Validatie van moleculaire methodes in een drinkwaterlaboratorium Adrie Atsma
Drinkwater laboratorium Nederland
Controleren drinkwater van bron tot tap Chemisch Fysiologisch Micro-organismen
Controleren drinkwater van bron tot tap Detectie fecale verontreiniging; huidige methode. Fecale Enterococcen E.coli Analyse doorlooptijd +/- 40 uur Analyse doorlooptijd +/- 20 uur
Reverse transcriptase PCR. ribosoom RNA die specifiek is voor E.coli
RT-PCR voor fecale verontreinigingen Positief voor fecale verontreiniging Negatief voor fecale verontreiniging
Vragen die knagen? Denk na wat de impact is voor de introductie van een nieuwe techniek, bijvoorbeeld op de (interne) bedrijfsvoering. Voor wie is deze methode bedoeld en voor welk doel wilt u deze techniek gebruiken? Welk doel wilt u bereiken met de validatie.? Beschikt u over de geschikte resources? Ben u afhankelijk van een leverancier voor levering van chemicaliën? Welke eisen stelt u aan de kwaliteit van de chemicaliën? Kunt u deze methode vervangen voor een conventionele methode; ben ik ook afhankelijk van wet en regelgeving Is er business voor deze methode? Inventariseer aandachtspunten, praat met elkaar.
Voordelen en nadelen van de inzet van RT-PCR? Snelheid (tijdwinst 1,5 dag t.o.v. huidige situatie). Meer onder control. Kortere kookadviezen. Lagere kosten bedrijfsvoering. Nadelen Duurdere analyse methode. Gevoelig voor remmende factoren Methode vereist expertise, nieuwe tak van sport. Voor het lab: Biedt mogelijkheid om de analyse verder te automatiseren; flexibel en kostenreductie. Meet niet kweekbare en kweekbare E.coli (en fecale Enterococcen). Meer duidelijkheid omtrent de aanwezigheid van fecale verontreiniging. Schoner drinkwater voor de klant. Betrouwbaarder drinkwater voor de klant.
Vragen die je stelt in een validatietraject Gevoeligheid? Remming? Matrix effect? Reproduceerbaar? Vaststellen prestatiekenmerken. RT-PCR = Kweek? Wet en Regelgeving? Advies 1: voer voor de validatie een haalbaarheidsstudie uit om de techniek en de uitkomsten alvast te leren kennen. Advies 2: maak een validatieplan waarin u beschrijft welke prestatiekenmerken u wilt bepalen, hoe u dit gaat doen en welke criteria u er aan gaan hangen.
Wet en Regelgeving Alle drinkwaterlabs RT-PCR werkgroep Validatie werkgroep
Vaststellen prestatiekenmerken: selectiviteit Inclusivity/exclusivity Testen van een selectie van herleidbare specifieke en nonspecifieke stammen op de nieuwe methode Bij voorkeur nonspecifieke stammen die in de testen matrix kunnen voorkomen of genetisch verwant zijn. NCBI nucleotide BLAST
Vaststellen prestatiekenmerken Kweek = referentiemethode. Reference method positive (R + ) Reference method negative (R - ) Alternative method positive (A + ) +/+ positive agreement (PA) -/+ positive deviation (PD) (R-/A+) Alternative method negative (A - ) +/- negative deviation (ND) (A-/R+) -/- negative agreement (NA) Relatieve juistheid: AC= (PA+NA) X100% N Relatieve specificiteit: SP= NA X100% N - Relatieve gevoeligheid: SE= PA X100% N + Gebruik besmette monsters, grote genetische diversiteit, dus monsters gebruikt verspreid over NL. Gevoeligheid is doorgaans laag ivm verschil tussen kweek en PCR
Vaststellen prestatiekenmerken Gevoeligheid/aantoonbaarheidsgrens. Bij lage aantallen zien we vaak verschillen tussen kweek en RT-PCR. Voor RT-PCR, bevat geen E.coli Het kan voorkomen dat bij een monster: Voor kweek, bevat wel E.coli Kweek positief maar RT-PCR negatief Kweek negatief maar RT-PCR positief E.coli
Vaststellen prestatiekenmerken Ringstudies georganiseerd door KWR. Advies; gebruik gecertificeerde stammen met vastgestelde hoeveelheden kve of cdna. Binnenlab herhaalbaarheid Houdbaarheid monsters Positieve lijn controle Blanco
Wet en regelgeving Gelijkwaardigheid; vergelijking moleculaire diagnostiek t.o.v. de kweek; blijft een dilemma. Waarom: Kweekbare en niet kweekbare bacteriën. Ongeveer 2,5x vaker positief i.v.m. de kweek Doel te bereiken door: Klankbord (KWR, RIVM, experts) Bewijsmateriaal aanleveren (veel data) Krachten bundelen; onderlinge labs samenwerken
Tot slot RT-PCR heeft een toegevoegde waarde in de drinkwater diagnostiek. Genetische studies. Meer inzichten van kwaliteit drinkwater
Betrokken werkgroepleden: Marsha van der Wiel Leo Heijnen Dennis Kloes Liesbeth Visser Adrie Atsma