SPOTTEN MET BLOED. Ir. Mariëtte T. Ackermans, PhD Analytisch Chemica Laboratorium voor Endocrinologie Academisch Medisch Centrum Amsterdam

Transcriptie

1 SPOTTEN MET BLOED Ir. Mariëtte T. Ackermans, PhD Analytisch Chemica Laboratorium voor Endocrinologie Academisch Medisch Centrum Amsterdam

2 Burgers Zoo DISCLOSURE (Potentiële) Belangenverstrengeling Geen

3 Monster dilemma

4 Dried Blood Spot Voordelen: Patiënt kan eenvoudig thuis zelf bloed afnemen Monster kan via reguliere post naar lab gestuurd Klein monstervolume (belangrijk voor o.a. neonaten) Nadelen: Gevoeligere meetmethoden nodig vanwege kleine monstervolumina Validatie DBS ten opzichte van conventionele bloedafname (effecten matrix zoals T en bloedvolume)

5 Adrenogenitaal syndroom (AGS) Sinds 2000 onderdeel van het Nederlandse neonatale screeningsprogramma

6 AGS screening: ielprik Interpretatie afhankelijk van zwangerschapduur Actie: 17-hydroxyprogesteron afwijkend: verwijzing naar kinderarts 17-hydroxyprogesteron dubieus: 2 e hielprik aanvragen

7 AGS screening in AMC (2012) Neonaten n= ste ielprik Negatief n=35057 Dubieus n=29 Verwezen n=6 Positief n=1 2 de ielprik (n=23) Negatief n=21 Dubieus n=0 Positief n=2 Geen aktie n=35078 Verwezen n=3

8 Diagnostiek Synacthen test: Bepaling van cortisol na synacthen Androsteendion O In eerste monster ook: 17-OP, testosteron, androsteendion, ACT en PRA O 17-OP O O Monster volume: 1 ml bloed O

9 Nadelen immunoassays Kruisreactiviteit ten gevolge van non-specifieke binding Aparte immunoassays nodig voor 17-OP en androsteendion O O O O O Cortisol O O O O O O 17-OP O 11-Deoxycortisol

10 Nadelen immunoassays Kruisreactiviteit ten gevolge van non-specifieke binding Aparte immunoassays nodig voor 17-OP en androsteendion O O O O O Cortisol O O O O O O 17-OP O 11-Deoxycortisol

11 LC-MSMS versus immunoassays Voordelen: Kruisreactiviteit is geen issue Meerdere componenten kunnen in één run gemeten worden Lineaire bereik is groter Kan worden gezien als gouden standaard Nadelen: Er is meer monstervoorbereiding nodig (matrix effect) Apparatuur is duurder en complexer Analist moet meer geschoold worden/zijn

12 2 nd Tier test eerste hielprik Voordelen: Geen tweede hielprik nodig (voordeel voor de neonaat en sneller) Minder vals positieven Minder ongerustheid ouders Voordat we dit in gebruik kunnen nemen is een analytische en klinische validatie nodig.

13 LC-MSMS methode Monstervoorbewerking: DBS: extractie met acetonitril/ 2 O Interne Standaarden: deuterium gelabelde steroïden LC-MSMS Kolom: Acquity SS T3 (50x2.1mm, 1.7 µm) Mobiele fase: A: 2 mm Ammonium acetaat/ 2 O + 0.1% mierenzuur B: 2 mm Ammonium acetaat/methanol + 0.1% mierenzuur 0.6 ml/min, gradiënt: 40 tot 64% B Detectie: MS/MS Waters Xevo TQ-S

14 Chromatogram standaard

15 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g)

16 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g)

17 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g)

18 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g)

19 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g)

20 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g)

21 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g)

22 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g)

23 Chromatogram ielprik (, 41.5 w, 3664 g) 11-deoxycorticosteron

24 Extractie recovery Component Extractie recovery d3-testosteron 86% 72% d8-17-hydroxyrogesteron 78% 68% d7-androsteendion 72% 62% d4-cortisol 88% 76% d8-corticosteron 80% 69%

25 Matrix effect Component Matrix effect testosteron -6% 17-hydroxyrogesteron 5% androsteendion 6% 11-deoxycortisol 8% cortisol 10% cortison 18% corticosteron 2% 21-deoxycortisol 9% 11-deoxycorticosteron -7%

26 Analytische validatie Lineariteit COR : nmol/l DAND, TST, CCN : nmol/l 11-DOCL, 21-DOCL, OP, CN: nmol/l Precisie Intra-assay CV <8%; Total-assay CV <8% Stabiliteit DBS: Tenminste 3 weken op KT, 4 C of -20 C Ge-extraheerde spots: 2 dagen bij 10 C LLOQ <1 nmol/l voor alle componenten COR:cortisol, DAND:D4-androstenedion; TST:testosteron; CCN:corticosteron, 11-DOCL:11-deoxycortisol 21-DOCL:21-deoxycortisol, OP:17-hydroxyprogesteron, CN:cortison

27 Vergelijking met OP Immunoassay van de screening Referentie populatie Neonaten met bewezen 21- hydroxylase deficiëntie

28 Klinische validatie: referentiewaarden

29 Steroidprofiel kinderen met afwijkende AGS screening Referentie populatie Neonaten met bewezen AGS

30 Steroidprofiel kinderen met afwijkende AGS screening Neonaten met afwijkende 1 ste hielprik Neonaten met bewezen 21-hydroxylase deficiëntie

31 Biosynthese 21-deoxycortisol

32 Conclusie De LC-MSMS methode kan worden gebruikt als 2 nd tier test voor AGS 21-Desoxycortisol is een goede marker voor AGS. De 8 neonaten die bewezen 21-hydroxylase deficiëntie hebben konden op basis van de 21- desoxycortisol geïdentificeerd worden uit de groep met 94 dubieuze of afwijkende eerste hielprik Door de 2 nd tier test voor dubieuze en afwijkende eerste hielprik screening van AGS te gebruiken: Is er geen tweede hielprik nodig (voordeel voor de neonaat en sneller) Zijn er minder vals positieve uitslagen Is er minder ongerustheid ouders

33 Acknowledgements An Ruiter Erik Endert Anita Boelen edi Claahsen Nationale screeningslabs: Marja van Veen (AMC) Marella Bouva (RIVM) Johan Timmers (Elisabeth Ziekenhuis Tilburg) Carolien van Rijswijk (IJsselland Ziekenhuis, Capelle a/d IJssel) Gerda Beltman (Isala Klinieken, Zwolle)