Mobiele qpcr aan de waterkant

Transcriptie

1 Mobiele qpcr aan de waterkant Voortgaande innovaties in DNA monitoring voor (zwem)waterkwaliteit Bas van der Zaan

2 Monitoring kwaliteit zwemwater Zwemwater Zwemwaterrichtlijn Intestinale Enteroccocen E.coli Blauwalgen etc 1 dag Actiena3 dagen 1-2 dagen Laboratorium analyse Actie bij zwem locatie nodig?

3 Toepassen van DNA-detectie 1. qpcr (quantitative Polymerase Chain Reaction) geen incubatie 1. Bemonstering van het water 2. Filtreren van watermonster 3. Extractie van het aanwezige DNA 4. qpcr analyse op DNA monster Data verwerking en interpretatie 4. 3.

4 Voor- en nadelen DNA monitoring Voordelen Sneller dan kweekmethode Betrouwbaar en accuraat Lage detectiegrens Nadelen Ook niet-actieve cellen Specialistisch lab nodig Past niet in huidige zwemwaterrichtlijn Meerdere analyse zelfde monster

5 Informatie voor de zwemmers Actuele informatie Afweging tussen snel en betrouwbaarheid

6 Ontwikkeling on-site monitoring systemen Aquascope - BioTrack Gene Xpert - Cepheid ChipGenie ChipShop gmbl EPS - Spyglass

7 Waarom nog niet breed toegepast? - Relatief dure systemen > k euro - Onderhoud in het veld nodig - Ook nog kosten per analyse - High-tech niet makkelijk toegankelijk

8 Mobiele qpcr systemen Amplino BV Scout -system BioMeme Inc. Two3 -system

9 DNA Isolatie in het veld 1. Bemonstering van het water 2. Filtreren van watermonster 3. Extractie van het aanwezige DNA 4. qpcr analyse op DNA monster 5. Data verwerking en interpretatie Ook DNA isolatie in het veld Alternatieve methodes: Needle press Verhitting Chemische lysis Ultrasound

10 Evaluatie alternatieve DNA extractie Methode Variatie Efficiëntie t.o.v. MoBio DNA kit (%) no extraction 90 Ultrasound Direct 101 Oplossing filter isopore 90 Oplossing filter nitrocellulose 84 Oplossing filter nylon 87 Filter isopore 47 Filter nitrocellulose 0 Filter nylon 0 Centrifugeren 89 Spuit met Naald 27G 90 25G 97 23G 96 basische-behandeling isopore 0 nitrocellulose 0 nylon 0 UV-behandeling isopore 54 nitrocellulose 28 nylon 0 Magnetron 650W W direct W HCl W direct HCl W HCl-EDTA W direct HCl-EDTA W Tris-HCl-EDTA W direct Tris-HCl-EDTA W W direct W HCl W direct HCl W HCl-EDTA W direct HCl-EDTA W Tris-HCl-EDTA W direct Tris-HCl-EDTA 81 Verhitten HCl 54 HCl-EDTA 56 Tris-HCl-EDTA 0 HotSHOT HCl + NaOH-EDTA 0 Tris-HCl + NaOH-EDTA 0 Diverse methoden Variatie binnen methode Recovery >80%

11 Voorbeeld recovery-resultaten Verhitten en Needle press Reproduceerbaar Recovery > 85%

12 Evaluatie alternatieve DNA extractie Protocol in het veld toepassen. Remming? Filter DNA kit DNA kit Direct DNA kit Direct 100x Hitte Hitte 100x Spuit Spuit 100x

13 Snelle DNA extractie methode BioMeme here.

14 Start Pilot project E.coli in zwemwater 5 deelnemende waterschappen Focus op E.coli 3 Monitoringsrondes juni - sept Doel pilot: Vergelijk qpcr veld en lab methode Praktische uitvoerbaarheid Nut van snelle informatie stroom

15 Vergelijk analysemethode in het veld

16 Planning Start datum (juni 2017) Selectie van moleculaire targets Optimalisatie E.coli qpcr in mobiele qpcr qpcr in het veld, 3 meetrondes Vergelijk data Evaluatie / Rapportage / verspreiding kennis Eind datum project (begin 2018) Juni Juni / juli Juli - sept Sept Okt / nov

17 Fase 1 2 : Target en optimalisatie Primer sets geselecteerd voor: 23srRNA uida tuff Test op dh5a en k12 rein cultures, daarnaast op oppervlaktewater samples Goed signaal: 23S rrna gen uida Matig/slecht: tuff

18 Procedure, inclusief DNA isolatie QiaGen Lab kit BioMeme veld-kit Voorlopige conclusie: Veldisolatie doet beter in mobiele qpcr BioMeme

19 Toekomstige ontwikkelingen monitoring Snel Lage-kosten Mobiel / handzaam LAMP (loop-mediated isothermal amplification) Helicase dependent amplificatie minder remming Lateral flow methode Ontwikkeling medische sector waterbeheer Martzy et al, 2017 Microfluidics Reis et at, 2016

20 Conclusies innovaties DNA monitoring Dichter bij monsterpunt kunnen meten Deze zomer ervaring mee opdoen Zelfde kwaliteit als in lab analyse haalbaar?? DNA isolatie Minder controles, etc Diverse ontwikkelingen gaande om nog sneller en betrouwbaar te kunnen meten

21 Vragen? Bedankt voor jullie aandacht