Nieuwe anti-tumor therapie ontwikkelingen in de moleculaire pathologie therapie op maat Ed Schuuring Klinisch Moleculair Bioloog in de Pathologie Hoofd Laboratorium Moleculaire Pathologie Hoogleraar Moleculaire Oncologische Pathologie Afdeling Pathologie UMCG
De klassieke diagnostiek van kanker Classificatie op basis van histologie 2014 Aangevuld met immunohistochemische kleuringen (e.g. HER2, ER, PR)
Klassieke pathologie: behandelkeuze op basis van histologie Longkankerpatiënten diagnose Selectie voor behandeling therapie Histopathologische diagnose Adenocarcinoom plaveiselcel carcinoom grootcellig carcinoom kleincellig carcinoom Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie Standaard chirurgie chemo- of radiotherapie
Moleculaire Pathologie
2001: De DNA volgorde van het hele humane genoom is ontrafeld
Niet de veranderingen in het DNA, maar ook verschillen in RNA/eiwit expressie zijn klinische/biologische relevant DNA: 6.000.000.000 nucleotiden/cel RNA/eiwit: ~30.000 genen Functioneel eiwit
Welke genetische veranderingen? Chromosomale deleties DNA amplificaties Puntmutaties Chromosomale translocaties Numerieke chromosoom afwijkingen Expressie-verschillen Polymorfismen Exogene agentia (bv virussen)
Anno 2015 beschikken we over veel moleculaire methoden om genetische afwijkingen te detecteren
De moleculaire pathologie van borstkanker
Voorbeelden van genprofielen die prognostisch zijn in borstkanker Mammaprint (70 genen) Oncotype DX (21 genen) 76 gene profile (Rotterdam) PAM50 (50 genen)
Microarray (gen-expressie) analyse voor de vaststellen van de prognose van patiënten met een mammacarcinoom Cut-off van 't Veer, Nature 415, 530-536; 2002
Microarray (gen-expressie) analyse voor de vaststellen van de prognose van patiënten met een mammacarcinoom Significant verschillend expressie profiel (70 genen) MAAR predictie is niet perfect! Vals-positieve uitslag Vals-negatieve uitslag van 't Veer, Nature 415, 530-536; 2002
Gen-gerichte therapie in borstkanker therapie op maat als één van de klassieke voorbeelden in de oncologie ER-positief mammacarcinoom: tamoxifen HER2-positief mammacarcinoom: herceptin BRCA1/2-positief mammacarcinoom: olaparib
the ErbB Family of Cell Surface Receptors Extracellular Domain Transmembrane Domain Intracellular TK Domain Amgen slide ErbB1 (EGFR) ErbB2 (HER2/neu) ErbB3 (HER3) ErbB4 (HER4)
ligand/groeifactor erbb/ receptoren 2 = erbb2 = HER2/neu
ligand/groeifactor erbb/ receptoren Gecontroleerde groei migratie Regulatie celdood
Her2/neu expressie en gen amplificatie 0 (negatief) 1+ (negatief) 2+ (twijfelachtig) (23-43%) 3+ (positief) (~15%) Plaatjes courtesy of Wesseling, Nederlof, Bart Wolff, ASCO, Arch Pathol Lab Med 2007 and 2013 (Guideline recommendations)
ligand/groeifactor erbb/ receptoren Groei Metastasering Remming apoptose
ligand/groeifactor erbb/ receptoren Remming celdeling Voorkomt metastasering Induceert apoptose + Herceptin
Her2/neu expressie en gen amplificatie Geen Herceptin-behandeling Geen Herceptin-behandeling 0 (negatief) 1+ (negatief) Herceptin-behandeling??? Herceptin-behandeling 2+ (twijfelachtig) (23-43%) 3+ (positief) Plaatjes courtesy of Wesseling, Nederlof, Bart Wolff, ASCO, Arch Pathol Lab Med 2007 and 2013 (Guideline recommendations)
HER2/neu amplificatie in borstkanker Mbv FISH (moleculaire test) FISH Amplificatie her2 FISH normaal Moleculaire Pathologie UMCG
Her2/neu test-algoritme (inter)nationale richtlijn mammacarcinoom IHC ISH 0 1+ 2+ 3+ - + ISH Herceptin Therapie Herceptin Therapie - + Herceptin Therapie Wolff, ASCO, Arch Pathol Lab Med 2007 and 2013 (Guideline recommendations)
Mutaties om patiënten te selecteren voor beschikbare gen-gerichte therapie Dancey Cell 2012
De moleculaire pathologie van longkanker
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie (2015) In 2007: gestart met EGFR-mutatie screening In 2013: Landelijke richtlijn Niet-kleincellig longcarcinoom (23-05-2011) De enige moleculair-diagnostische test in de huidige richtlijn!!! In 2013: ALK-ELM4 translocatie (crizotinib geregistreerd vanaf 2012)
Lazarus Response to Gefitinib: Chemoresistant EGFR mutant adenocarcinoma January 2002 October 2004 Johnson 2004
Activating Mutations in the Epidermal Growth Factor Receptor Underlying Responsiveness of Non Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib NEJM (2004) 350:2129-2139 Thomas J. Lynch, M.D., Daphne W. Bell, Ph.D., Raffaella Sordella, Ph.D., Sarada Gurubhagavatula, M.D., Ross A. Okimoto, B.S., Brian W. Brannigan, B.A., Patricia L. Harris, M.S., Sara M. Haserlat, B.A., Jeffrey G. Supko, Ph.D., Frank G. Haluska, M.D., Ph.D., David N. Louis, M.D., David C. Christiani, M.D.,Jeff Settleman, Ph.D., and Daniel A. Haber, M.D., Ph.D. Science (2004) 304:1497-1500 PNAS (2004) 101:13306-13311
Response to gefitinib in a patient with refractory non-small-cell lung cancer to chemotherapy with EGFR exon 21 mutation Improvement in 6 weeks
De ziekte-vrije-overleving van NSCLC patiënten met/zonder EGFR-mutatie behandeld met gefitinib Mok T et al, NEJM 2009
Belangrijkste resultaten van de behandeling van NSCLC met TKI (erlotinib/gefinitib) 1) Verbeterde ziekte-vrije overleving voor patiënten met EGFR-mutatie 2) Verbeterde overleving voor patiënten met EGFR-mutatie (m.n. primair NSCLC) 3) Veel geringere mate van bijwerkingen i.t.t. chemotherapie 4) Verbeterde kwaliteit-van-leven Bepalen van de EGFR-mutatie-status is belangrijk onderdeel van de nieuwe landelijke richtlijn Niet-kleincellig longcarcinoom (dd 23 mei 2011)).
Detectie van mutaties in EGFR Waar zitten de mutaties? hotspots Extracellular P- loop 18 G719 (~5%) domain 19 LREA deletions (45-50%) Transmembrane region ATP binding cleft N-lobe C-lobe TK domain C- helix 20 duplications/ insertions (~5%) T790M (3-5%) Regulatory domain A- loop 21 L858R (35-45%) L861 (~2%) EGFR-EIWIT-MOLECULE Sequist JCO 2007, 25; 587 EGFR-GEN en EXONEN
De ziekte-vrije-overleving van NSCLC patiënten met/zonder EGFR-mutatie behandeld met gefitinib Mok T et al, NEJM 2009 Alle longkankerpatiënten behandeld met EGFR-TKI worden uiteindelijk therapie-resistent
Resistant EGFR mutations Sequist et al, Sci Transl Med 2011 3:75ra26
EGFR-mutaties met resistentie tegen EGFR-targeted therapie Detectie van mutaties in EGFR TKI-sensitieve en TKI-resistente EGFR mutaties hotspots 18 G719 (~5%) D761Y L747S duplications/ insertions T790M 19 20 LREA deletions (45-50%) voor EGFR-targeted therapie EGFR-mutaties die gevoelig zijn < 5% TKI-resistente T854A 21 L858R (35-45%) L861 (~2%) ~90% TKI- sensitieve EGFR- EGFR mutaties EGFR-GEN en EXONEN mutaties: del19 en L858R
Presence of T790M mutations in tumor-biopsy and decreased progression-free survival Maheswaran S et al. N Engl J Med 2008;10.1056
Tumor regression by T790M mutation status with afatinib + cetuximab PS: alleen in trial-verband verkrijgbaar (2015) Horn L, Groen HJM et al WCLC 2011
PS: alleen in trial-verband verkrijgbaar (2015)
Nieuwe drugs gericht tegen specifieke EGFR-mutaties voorbeeld PS: alleen in trial-verband verkrijgbaar (2015) Ohashi JCO 2013
Progression-free survival in EGFR exon 19 deletion and L858R point mutation with EGFR-TKI
EGFR-mutaties met resistentie tegen EGFR-targeted therapie < 5% TKI-resistente EGFR mutaties Detectie van mutaties in EGFR TKI-sensitieve en TKI-resistente EGFR mutaties 3305 different EGFR-mutations duplications/ insertions T790M 18 20 21 EGFR-GEN en EXONEN hotspots G719 (~5%) 254 EGFR-mutations associated with TKI-response Linardou NatRevCancer 2009 Only 9 D761Y with frequency => 1% LREA deletions 19 L747S (45-50%) T854A L858R (35-45%) L861 (~2%) voor EGFR-targeted therapie EGFR-mutaties die gevoelig zijn ~90% TKI- sensitieve EGFR- mutaties: del19 en L858R
EGFR mutaties in longkanker EGFR-mutaties: 32.9% (wereldbreed) EGFR-mutaties: 15% (blanken) EGFR-mutaties: 10% (Nederland) EGFR-mutaties: 30% (aziaten) EGFR-mutaties: 60% (non-smoking aziaten) Dahabreh, meta-analyse Clin Cancer Res 2010 Sasaki Eur J Cancer 2010
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie (2015) In 2007: gestart met EGFR-mutatie screening In 2013: Landelijke richtlijn Niet-kleincellig longcarcinoom (23-05-2011) De enige moleculair-diagnostische test in de huidige richtlijn!!! In 2013: ALK-ELM4 translocatie (crizotinib geregistreerd vanaf 2012)
FDA approved Xalkori treatment only in combination with FDA approved ALK-test Abbott/Vysis ALK Break Apart FISH test
Complex patterns detected with ALK-split signal assay Single red (3 ) pattern (positive) Due to deletion of 5 allele representing 30% of ALK-positive cases ALK-breuk in <3.5% NSCLC FISH-ALK-positive NSCLC
Tumor response on crizotinib in FISH positive EML4-ALK translocation Before start crizotinib After 6 weeks of crizotinib
ALK-D5F3-CTS IHC (manueel) FISH-ALK-positief FISH-ALK-negatief ALK-D5F3-CTS IHC (Ventana/Ultrabench) FISH-ALK-positief FISH-ALK-positief
Tumor response on crizotinib in FISH ALK positive and IHC ALK positive NSCLC: complete response 26-07-2011 27-09-2011 10-11-2011 FISH-ALKpositief IHC-ALKpositief By courtesy of prof Harry Groen, UMCG
Anno 2015: therapie op maat op basis van 2 gen-mutaties Longkankerpatiënten diagnose Selectie voor behandeling therapie Mutattie profiling Geen mutatie (87%%) EGFR-mutatie (9%) ALK-mutatie (3%) Medicijn op maat Medicijn op maat
Driver Mutation Incidence In Lung Cancers Mark Kris JAMA 2014
ROS1-rearrangements in NSCLC target for crizotinib detection of ROS1 breaks using Vysis/Abbott FISH (> Sept 2013) ROS1-rearrangements in NSCLC: Voor behandeling na 4 weken na 8 weken * 9/556 NSCLC (1.6%) sensitive to crizotinib detected by FISH (2012: Kreatech/CytoCell) >7 partners
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv gen-mutatie-gerichte therapie Vanaf 2015 e.v. (verwachtte toepassingen): resistente EGFR mutaties $ (100% AC) > next-generation-tki FGFR1-amplificatie $ (~20% SCC) > BIBF1120 BRAF-mutatie $ (< 2% AC) > PLX4732 KRAS-mutatie $ (~40% AC) > sorafenib, MET-amplificatie & (4-20% AC) > Metmab, Crizotinib, AMG102, XL880 (GSK1363089) ROS1-translocatie & (1.7% AC) > crizotinib RET/KIF5B-translocatie & (<2% AC) > vandetanib HER2-mutatie & (2% AC) > herceptin EGFR-amplificatie $ (10% AC) > cetuximab, erlotinib, PIK3CA-mutatie & (<5% AC) > mtor inhibitor, aspirine DDR1-mutatie (~4% SCC) > dasatinib Alle testen in kader van klinische trials UMCG is longkanker-expertcentrum en participeert in vele internationale trials
Anno 2015-16: therapie op maat op basis van >6 gen-mutaties Longkankerpatiënten diagnose Selectie voor behandeling therapie Geen mutatie (60%%) EGFR-mutatie (9%) Medicijn op maat Mutattie profiling FGFR1-mutatie (20%) MET-mutatie (3%) ALK-mutatie (3%) Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat ROS-mutatie (1%) Medicijn op maat BRAF-mutatie (3%) Medicijn op maat
Het in kaart brengen van de mutaties in alle genen in verschillende Longkankerpatiënten m.b.v. genoom-brede sequentie analyse next-generation-sequencing Resultaat: * in elke tumor zijn >2 genmutaties aanwezig * mogelijkheid voor specifieke genmutatie-gerichte therapie voor elke individuele patiënt
Een arsenaal aan nieuwe farmaceutica gericht tegen kankercellen die aangrijpen op een gemuteerd eiwit gen-gerichte therapie (gene-targeted therapy)
Anno 2015: Moleculaire Pathologie > tumor mutatie profiel > individuele therapie op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Medicijn op maat Elke kleur = andere mutatie en ander medicijn op maat Ellke pijl = moleculaire test
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie anno 2015 binnen lab Moleculaire Pathologie UMCG longkanker-mutatie-analyse (EGFR, KRAS, BRAF) ALK-/ROS1-translocatie en ALK-immunohistochemie Sporadisch/op verzoek: PIK3CA, RET, FGFR1
Mutation detection to selected patients that benefit from gene-target-therapy in cancer in general based on registered drugs and guidelines In 2015 (MD-aanvraagformulier-UMCG*): Melanoma mutation testing: BRAF, NRAS, ckit Thyroid carcinoma mutation testing: BRAF Lung cancer mutation testing: EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA, ROS, ALK, RET, HER2, MET CRC mutation testing: KRAS, NRAS, BRAF GIST mutation testing ckit, PDGFRA Breast cancer mutation testing: HER2 * In 2015 voor targeted therapie: mutatie-profiling mbv next-gen-sequencing met panel 11 genen en FISH voor 5 genen * www.moloncopath.nl
Targeted next-generation sequencing (Ion-Torrent)
UMCG-PGM-oncopanel (11-genes; 29 amplicons) ALK codon 1174 GNA11 codon 209 KRAS codon 61 ALKcodon 1275 GNAQ codon 209 NRAS codon 117/146 BRAF exon 15 KIT exon 11 NRAS codon 12/13 EGFR exon 18 KIT exon 13 NRAS codon 61 EGFR exon 19 KIT exon 14 PDGFRA exon 12 EGFR exon 20 KIT exon 17 PDGFRA exon 14 EGFR exon 21 KIT exon 8 PDGFRA exon 18 ERBB2 exon 19 KIT exon 9 PIK3CA exon 20 ERBB2 exon 20 KRAS codon 117/146 ERBB2 exon 21 KRAS codon 12/13 PIK3CA exon 9 Standaard mutatie-test vanaf 01-09-2014 Klinisch gevalideerd volgens ISO15189 Doorlooptijd 5-7 werkdagen (2x/week NGS) Pathologie-verslag: uitgebreid vanaf 1 mei 2015 conform ISO en europese richtlijnen Behandeladvies (lastige cases besproken in wekelijkse Moleculaire Tumor Board) www.moloncopath.nl
Nieuwe ontwikkelingen Targeted next-generation-sequencing (vanaf 1 september 2014) Standarisatie, archivering en analyse van de FISH Moleculaire bloedtest
D A small biopsy B core-needle biopsy C surgical specimen D cytology E biopsy with very few tumor cells E Invasieve methoden zijn nodig om de tumor te biopteren om diagnose te kunnen stellen Biopteren niet altijd mogelijk (erg belastend en risicovol neveneffecten) Biopteren vaak niet toegestaan Risico op iatrogene metastasering Geen representatief weefsel (kleine tumoren, non-vitaal weefsel, image-negatief
Liquid biopsies: the detection of cell-free circulating tumor DNA in plasma (ctdna) Crowly E. et al Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013)
Can peripheral blood be used to determine the presence of the tumor? Plasma: * DNA and circulating tumor DNA (ctdna) * RNA and circulating tumor RNA (ctrna) * Proteomic/immunological tumor markers * Pharmacokinetics ([drug]) Leukocytes and circulating tumor cells (CTC) Platelets and tumor RNA
Digital droplet PCR technologie ddpcr ddpcr-assay: primer-set with HEX-probe for mutation and FAM-probe for wt
Rare Mutation Detection: Example (KRAS G12V) mutant only 1% mutant 0.1% mutant mut mut + wt wt 0.01% mutant 0.001% mutant 0% mutant wt Biorad
Work-flow of monitoring response to targeted therapy in plasma ctdna Tumor volume Resistant mutations Druggable mutation Druggable mutation Tumor volume Detection of mutation before treatment (high tumor load): diagnosis/prognosis Monitoring of treatment respons Early detection of therapy-resistent mutation levels (prior to clinical manifestation)
Dank voor uw aandacht e.schuuring@umcg.nl www.moloncopath.nl Recente literatuur te lezen in oratie van prof dr Ed Schuuring: http://www.rug.nl/news-and-events/promotioninauguration/2013/06_oratie-schuuring.pdf
Doelgerichte behandelingen bij het gevorderd longkanker 1. Chemotherapy: one size fits all 2. EGFR inhibitors 3. BRAF inhibitors 4. ALK inhibitors 4. ROS1, RET inhibitors 5. FGFR1 inhibitors 6. MET inhibitors 7. KRAS inhibitors 8. HER2 inhibitors 9. PIK3CA inhibitors H.Groen
Doelgerichte behandelingen bij het gevorderd longkanker 1. Chemotherapy: one size fits all 2. EGFR inhibitors 3. BRAF inhibitors 4. ALK inhibitors 4. ROS1, RET inhibitors 5. FGFR1 inhibitors 6. MET inhibitors 7. KRAS inhibitors 8. HER2 inhibitors 9. PIK3CA inhibitors
Validation of ALK IHC and FISH in relation to response to crizotinib preliminary (Van der Wekken, Groen, Schuuring) 21 NSCLC 21 positive for ALK breaks by FISH (15%) or/and IHC (internat guidelines) Median % nuclei with ALK breaks: 47% (6-76%) > Tumour response: 12 pts with median of 51% (6-76) and 9 non-responders with median of 27% (15-64) breaks >> 8/11 responders were ALK-IHC positive (73%) >> 2/9 non-responders were ALK-IHC positive (22%) >>> median PFS for ALK-IHC-positive: 8 mo >>> median PFS for ALK-IHC-negative: 2 mo (n=17, p=0.01) >> PFS for > 47% ALK breaks: 7 mo >> PFS for < 47% ALK breaks: 1 mo (n=21, p=0.03) >> PFS is more prolonged in those tumors with more ALK breaks
Doelgerichte behandelingen bij het gevorderd longkanker 1. Chemotherapy: one size fits all 2. EGFR inhibitors 3. BRAF inhibitors 4. ALK inhibitors >>> trial: registratie en bloedtest 4. ROS1, RET inhibitors >>> 4 ROS1-pos cases 5. FGFR1 inhibitors >>> trial: FISH test amp-fgfr1 in scc 6. MET inhibitors 7. KRAS inhibitors 8. HER2 inhibitors 9. PIK3CA inhibitors
Nieuwe ontwikkelingen Targeted next-generation-sequencing (vanaf 1 september 2014) Standarisatie, archivering en analyse van de FISH Moleculaire bloedtest
Detectie van mutaties in EGFR (UMCG tot 1 september 2014) (1) Voor-screening mbv High-Melting-Resolution-Analysis: is er een mutatie of niet? 80% 60% 40% 20% 10% 5% tonsil Sensitivity for HMRA of EGFR exon 19 del (Inge Platteel) (2) Indien ja, bevestiging met directe (bidirectionele) sequentie analyse Wild type del746-750 EGFR Exon 19 Analytische gevoeligheid is 40% tumor cellen
Targeted next-generation sequencing (Ion-Torrent) Diepte (coverage 500x) Oncopanel 22 genes/ 109 amplicons Ion Torrent: coverage 500x => gevoeligheid ~1-5% Exome/WGS: coverage 30x => gevoeligheid >10-20% 314: 1-2 samples/run 316: 1-8 samples/run
UMCG-PGM-oncopanel (11-genes; 29 amplicons) start-panel voor validatie van workflow, kosten, gevoeligheid, reproduceerbaarheid, werkbelasting, specificiteit ALK codon 1174 GNA11 codon 209 KRAS codon 61 ALKcodon 1275 GNAQ codon 209 NRAS codon 117/146 BRAF exon 15 KIT exon 11 NRAS codon 12/13 EGFR exon 18 KIT exon 13 NRAS codon 61 EGFR exon 19 KIT exon 14 PDGFRA exon 12 EGFR exon 20 KIT exon 17 PDGFRA exon 14 EGFR exon 21 KIT exon 8 PDGFRA exon 18 ERBB2 exon 19 KIT exon 9 PIK3CA exon 20 ERBB2 exon 20 KRAS codon 117/146 PIK3CA exon 9 ERBB2 exon 21 KRAS codon 12/13 Klinische validatie is afgerond (~1 jaar) Standaard mutatie-test vanaf 1 sept 2014 Doorlooptijd hetzelfde (2x/week NGS) 5x/week DNA isolatie Verslag: alleen genen volgens richtlijnen Voobereid op nabije toekomst/trials Procedure aanvragen veranderd
UMCG-PGM-oncopanel versie 2 ALK codon 1174 GNA11 codon 209 KRAS codon 61 ALKcodon 1275 GNAQ codon 209 NRAS codon 117/146 BRAF exon 15 KIT exon 11 NRAS codon 12/13 EGFR exon 18 KIT exon 13 NRAS codon 61 EGFR exon 19 KIT exon 14 PDGFRA exon 12 EGFR exon 20 KIT exon 17 PDGFRA exon 14 EGFR exon 21 KIT exon 8 PDGFRA exon 18 ERBB2 exon 19 KIT exon 9 PIK3CA exon 20 ERBB2 exon 20 KRAS codon 117/146 ERBB2 exon 21 KRAS codon 12/13 PIK3CA exon 9 Uitbreiding: mutaties in MET > long HRAS >??? JAK2 > hemato P53 >??? Notch > HN AKT >??? Oncopanel Colonpanel Longpanel GIST-panel TKI-resistentie panel Advies van klinici Voorwaarden: Diep sequencen (hoge gevoeligheid) Kosten/baten (2x amplicons = 2x zo duur) Ethische (te veel informatie)
50 genen = 739 amplicons = 2790 bekende mutaties
Commerciële en custome-made panels met frequent gemuteerde genen in verschillende kankers let op: de meeste zijn niet klinisch-gevalideerd volgens ISO15189 voor FFPE materiaal miseq (Illumuna): Cancer-panel: 48 genes/212 amplicons ABI/PGM-Ion Torrent: UMCN-oncopanel: 22 genes Oncogene-panel: 400 genes Custom-panel (11-genes UMCG) Cancerpanel: 50 genes/739 amplicons
Nieuwe ontwikkelingen Targeted next-generation-sequencing (vanaf 1 september 2014) Standarisatie, archivering en analyse van de FISH Moleculaire bloedtest
the ErbB Family of Cell Surface Receptors Extracellular Domain Transmembrane Domain Intracellular TK Domain Amgen slide ErbB1 (EGFR) ErbB2 (HER2/neu) ErbB3 (HER3) ErbB4 (HER4)
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) De activatie in normale cellen PTEN STAT signaling Evasion of apoptosis Proliferation Pathway Gazdar 2007
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) De activatie in tumorcellen 1. Verhoogde expressie van de groeifactor (ligand) 2. Verhoogde expressie van EGFR PTEN Evasion of apoptosis STAT signaling Proliferation Pathway als gevolg van DNA amplificatie 3. Mutaties in tyrosine kinase domein van EGFR 4. Mutaties in KRAS/NRAS Gazdar 2007
Receptor-protein tyrosine kinases as target for therapy Cetuximab Panitumumab Erlotinib Gefitinib
Dual-target EGFR drugs in the pipeline Agent Target Sponsor Status Lapatinib EFGR,HER2 GlaxoSmithKline Phase III breast, kidney cancer ZD6474 EGFR, HER2, VEGFR AstraZeneca Phase III, NSCLC; phase II, medullary thyroid carcinoma HKI-272 EGFR, HER2 Wyeth Phase II, breast, NSCLC BIBW-2992 EGFR, HER2 Boehringer-Ingelheim Planning for phase II in breast, prostate, and ovarian cancer AEE788 EGFR, HER2, VEGFR Novartis Phase I solid tumor BMS-599626 EGFR, HER2 Bristol-Myers Squibb Phase I for solid tumors CI-1033 EGFR, HER2, HER4 Pfizer Phase II breast, NSCLC XL-647 EGFR, HER2, VEGFR2, EphB4 Exelixis Phase I completed; phase II planned fo rnsclc Groen 2010 Steeds meer specifieke drugs gericht tegen specifieke EGFR-mutaties > Het dus essentieel om exact te bepalen welke mutatie aanwezig is
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv genmutatie-gerichte therapie anno 2015 binnen lab Moleculaire Pathologie UMCG longkanker-mutatie-analyse (EGFR, KRAS, BRAF) ALK-/ROS1-translocatie en ALK-immunohistochemie Sporadisch/op verzoek: PIK3CA, RET, FGFR1
Veelvoorkomende mutaties (%) in verschillende kankers Gen HNSCC NSCLC colonca thyroidca breast ca EGFR 3 26 0 6 0 PIK3CA 10 3 8 5 25 KRAS 4 17 35 3 4 BRAF 2 2 15 39 3 CDKN2A 18 15 5 14 5 P53 70 64 56 47 STR11 2 10 14 APC 6 1 27 4 MET 15 2 FGFR3 21 1 HRAS 9 0 3 Cosmic database 09/2009
De moleculaire diagnostiek van longkanker tbv gen-mutatie-gerichte therapie Vanaf 2014 e.v. (verwachtte toepassingen): resistente EGFR mutaties $ (100% AC) > next-generation-tki FGFR1-amplificatie $ (~20% SCC) > BIBF1120, BRAF-mutatie $ (< 2% AC) > PLX4732, KRAS-mutatie $ (~40% AC) > sorafenib, MET-amplificatie & (4-20% AC) > Metmab, Crizotinib, AMG102, XL880 (GSK1363089) ROS1-translocatie & (1.7% AC) > crizotinib, RET/KIF5B-translocatie & (<2% AC) > vandetanib HER2-mutatie & (2% AC) > herceptin EGFR-amplificatie $ (10% AC) > cetuximab, erlotinib, PIK3CA-mutatie & (<5% AC) > mtor inhibitor DDR1-mutatie (~4% SCC) > dasatinib, ALK-translocatie/IHC (~4% AC) > crizotinib, Alle testen in kader van klinische trials
Veelvoorkomende mutaties (%) in verschillende kankers Gen HNSCC NSCLC colonca thyroidca breast ca EGFR 3 26 0 6 0 PIK3CA 10 3 8 5 25 KRAS 4 17 35 3 4 BRAF 2 2 15 39 3 CDKN2A 18 15 5 14 5 P53 70 64 56 47 STR11 2 10 14 APC 6 1 27 4 MET 15 2 FGFR3 21 1 HRAS 9 0 3 Cosmic database 09/2009
Veelvoorkomende mutaties (%) in borstkanker Gen HNSCC NSCLC colonca thyroidca breast ca EGFR 3 26 0 6 0 PIK3CA 10 3 8 5 25 KRAS 4 17 35 3 4 BRAF 2 2 15 39 3 CDKN2A 18 15 5 14 5 P53 70 64 56 47 STR11 2 10 14 APC 6 1 27 4 MET 15 2 FGFR3 21 1 HRAS 9 0 3 Cosmic database 09/2009
Landscape of driver mutations in breast carcinoma using whole-genome-sequencing TGCA, Nature 2012
Mutation detection to selected patients that benefit from gene-target-therapy in cancer in general (UMCG-list) In 2015: Melanoma mutation testing: Thyroid carcinoma mutation testing: Lung cancer mutation testing: CRC mutation testing: GIST mutation testing Breast cancer mutation testing: BRAF, NRAS, ckit BRAF EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA, DRD2, ALK, ROS, FGFR1 NRAS, KRAS, BRAF ckit, PDGFRA HER2 After 2015: mutation-profiling for all/most malignancies!!!
de classificatie van longkanker in de tijd 2013 Pao W., Hutchinson K.E. Nature Medicine, 18, 349 351, 2012 Moleculaire Pathologie: Veranderde expertise (moleculair bioloog, informaticus) Geavanceerde, kostbare apparatuur Hoge kwaliteitsborging Relatief dure diagnostiek Pao, Lancet Oncol 2011 Vereist: centralisatie in zeer beperkt aantal expertcentra
discussie Moleculaire testen in elk zks uitvoeren? Neen, centraliseren maar multidisciplinair overleg belangrijk Geen EGFR-mutaties, dan nooit meer testen? Neen, want aantal target/nieuwe middelen groeit enorm Breed testen ipv beperkt aantal testen? Neen, ethisch verantwoord om informatie te verkrijgen waar je niets mee kunt (diagnostiek vs klinische trials) PS dit is de visie van prof dr Ed Schuuring anno 2014
discussie Pathologen overbodig straks? Neen, moleculaire interpretatie is niet los te zien van de gehele diagnose (wel optimale samenwerking met KMBP) Patiënt dient te weten in welk zks getest wordt? Zou niet nodig moeten zijn! In NL is accreditatie voor deze testen niet verplicht én niet elk lab voldoet aan kwaliteitsnormen. Dus ja. Belangrijk is vooral naar zks te gaan die de expertise heeft voor bepaalde ziekte Snelheid bepaalt de kwaliteit van de test? Ja, kwaliteit kost tijd PS dit is de visie van prof dr Ed Schuuring anno 2014
Complexiteit van chromosomale afwijkingen Genes LOC401700 LOC220070 LOC399921 SHANK2 CTTN PPFIA1 FADD TMEM16A LOC399920 FGF3 FGF4 FGF19 ORAOV1 FLJ42258 CCND1 LOC399919 LOC390218 MYEOV TPCN2 MRGPRF MRGPRD IGHMBP2 MRPL21 CPT1A 68,2 68,4 68,6 68,8 69,0 69,2 69,4 69,6 69,8 70,0 70,2 70,4 Chromosome 11 position (Mbp, NCBI B35) Het 11q13 amplicon bevat >13 genen waarvan er >8 geactiveerd zijn Welke zijn biologisch/klinisch relevant? Gibcus Clin Cancer Res 2007 Gibcus Hum Genet 2007 Gibcus Brit J Cancer 2008
Survival % Wat is de biologische betekenis van expressie van het FADD gen gelegen in het 11q13 amplicon? 100 10 1 EV unstimulated EV + 5 um PonA FADD SA unstimulated FADD SA + 5 um PonA FADD SE unstimulated FADD SE + 5uM PonA 0.1 0 2 4 6 Radiation (Gy) Clinical samples show that high pfadd associates with radiosensitivity In early-stage-laryngeal carcinomas In vitro radiation experiments show that pfadd increases radiosensitivity Schrijvers IJROBP 2011 Pattje unpublished
Microarray (gen-expressie) analyse voor de vaststellen van de prognose van patiënten met een mammacarcinoom De mammaprint Significant verschillend expressie profiel (70 genen) MAAR predictie is niet perfect! van 't Veer, Nature 415, 530-536, 2002
Whole genome CGH arrays Gain 1q Normalized ratio 8.0 7.8 7.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Voorbeeld van een tumor 3 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Clones sorted by chromosome Red = chromosomal loss = ratio < 0.8 Green = chromosomal gain = ratio >1.3 Yellow = normal = ratio 1 Amplification 11q13 11 Loss 3p Normal copy Gibcus Clin Cancer Res 2007 Gibcus Hum Genet 2007 Gibcus Brit J Cancer 2008
Detectie van chromosoom 11q13 amplificatie in ~15% van mammacarcinomen FISH FISH Amplificatie 11q13 Schuuring, Cancer Res 1992
11q13 amplificatie voorspeller voor overleving in borstkanker mortaliteit Significant verschillend MAAR predictie is niet perfect! Niet alle patienten met 11q13-amp hebben korte overleving en niet alle patienten zonder 11q13 amp worden genezen Schuuring, Cancer Res 1992
De mogelijke biologische betekenis van geactiveerde genen in het 11q13 amplificon FISH FISH Amplificatie 11q13 cyclin D1 involved in cycle regulation (Schuuring, Oncogene 1991) cortactin/ems1 involved in migration (Schuuring, Oncogene 1992) EMSY involved in BRCA2-dependent DNA repair (Cell 2003) myeov a putative transforming gene (Blood 2000) FADD involved in radioresponse (Pattje, unpub and schrijvers IJRBP 2011) ORAOV involved in migration PPFIA1 involved in migration FGF3/4/19 are ligands for receptor kinases
Welk gen is verantwoordelijk voor het biologische of klinische effect Is het één gen? Is het een combinatie van genen?
Whole genome Array CGH comparative genomic hybridization voor het in kaart brengen van chromosomale afwijkingen in borstkanker Genomic clones: Van elke clone is de exacte sequentie bekend (chromosomale locatie welke genen)
Array CGH hoe worden afwijkingen gedetecteerd? Clones carcinoma reference Red = chromosomal loss Green = chromosomal gain Yellow = normal Labelling Printing Hybridize Excitation Computer analysis Emission
Sex-mismatch hybridisatie Normalized ratio Red = chromosomal loss = ratio < 0.8 Green = chromosomal gain = ratio >1.3 Yellow = normal = ratio 1 Normalized ratio 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Female to male ratio: X=2:1 Y=0:1 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Clones sorted by chromosome
Normalized ratio 8,0 7,8 7,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Whole genome CGH arrays voorbeeld van genetische afwijkingen in 2 tumoren A 5 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Clones sorted by chromosome 18 Normalized ratio 7,0 6,8 6,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 B 7 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 8 Clones sorted by chromosome 11 17 Gibcus Clin Cancer Res 2007 Gibcus Hum Genet 2007 Gibcus Brit J Cancer 2008
CGH classifier profiel om onderscheid te maken tussen low-risk/high-risk borstkankertypen Significant verschillend CGH profiel MAAR predictie is niet perfect! Niet alle patienten met HR-profiel hebben korte overleving en niet alle patienten met LR-profiel worden genezen Gravier Genes Chrom Cancer 2010
Niet de veranderingen in het DNA, maar ook verschillen in RNA/eiwit expressie zijn klinische/biologische relevant DNA: 6.000.000.000 nucleotiden/cel RNA/eiwit: ~30.000 genen Functioneel eiwit
Expressie microarray analyse identificatie van RNA-expressieprofielen cdna clones carcinoma reference Red = chromosomal loss Green = chromosomal gain Yellow = normal Labelling Printing Hybridize Excitation Computer analysis Emission