Detectie van pneumocystis in broncheoalveolaire lavage Rafke Schoffelen 15-12-2015 IC Radboudumc
Casus Man, 78 jaar Behandeld met rituximab en prednison Verdenking pneumocystis pneumonie(pcp) Start cotrimoxazol in therapeutische dosering Broncheoalveolairelavage (BAL) Beloop: Geringe afnameground-glass afwijkingen op HRCT Sepsis, waarschijnlijkdoor Pseudomonas >> overleden
Casus Uitslag PCP in BAL: Directe detectie (na enkele uren): negatief PCR (na 2 dagen): positief
Casus Na uitslag directe detectie: Recept van cotrimoxazol onderbroken, direct daarna herstart Echter: te lage dosis Na uitslag PCR (na 2 dagen): Correctienaar therapeutische dosis
Vraagstelling Indien we de behandeling voor PCP baseren op de uitslag van de PCR, wat is dan de meerwaardevan de directe detectie-methode?
Vraagstelling Indien we de behandeling voor PCP baseren op de uitslag van de PCR, wat is dan de meerwaardevan de directe detectie-methode? Welke technieken worden gebruikt? Wat is de klinische toepassing?
Pneumocystis jiroveci Gist Levenscyclus: trofozoïeten en cysten Vrijwel alleen in longen aanwezig Thomas CF, Limper AH. Currents insights into thebiology and pathogenesis of Pneumocystis pneumonia. Nature Reviews Microbiology 2007; 5, 298-308.
Diagnostiek Materialen: Kweek >> onmogelijk Serologie >> (nog) onmogelijk BAL Mondspoeling/ geïnduceerd sputum Bioptlong / transbronchiaal
Diagnostiek Materialen: Kweek >> onmogelijk Serologie >> (nog) onmogelijk BAL Mondspoeling/ geïnduceerd sputum Bioptlong / transbronchiaal Technieken: Microscopie (= directe detectie, sneltest ) Polymerase chain reaction (PCR)
Microscopie Verschillende methodes: Kleuring nuclei: Giemsa Kleuring wand van cysten: zilver Immunofluorescentiembv monoclonaleantilichamen Wehle K, Blanke M. Koenig G, Pfitzer P. The cytological diagnosis of Pneumocystis carinii by fluorescence microscopy of Papanicolaou stained bronchoalveolar lavage specimens. Cytopathology. 1991;2(3):113-20.
Microscopie Voordelen: Uitslag direct beschikbaar Hoge specificiteit Nadeel: Lagere sensitiviteitdanpcr Afhankelijk van hoeveelheid aanwezigecysten/trofozoieten Nog lager bij HIV-negatieve patienten* en mogelijk ook na start van cotrimoxazol *Limper AH, Offord KP, Smith TF, Martin WJ. Pneumocystis carinii pneumonia: differences in lungparasite number and inflammation in patients with and without AIDS. Am Rev Respir Dis 1989;140:1204-9
PCR Technieken: Conventinoneel Nested Kwantitatief Verschillende methodes voor DNA-extractie Verschillende DNA-fragmentenen primers
PCR Voordelen: Hoge sensitiviteit (79-100%) en specificiteit (86-100%), afhankelijk van techniek (nested, kwantitatief)* Nadelen: Uitslag pas na 2 dagen beschikbaar Geen onderscheidtussen colonisatie en infectie *Khot PD, Fredricks DN. PCR-based diagnosis of human fungal infections. Expert Rev Anti Infect Ther. 2009 Dec;7(10):1201-21. doi: 10.1586/eri.09.104.
PCR techniek
PCR resultaat Agarose gel of PCR of a patiënt suspected of PCP (BAL): Lane S: 100-bp ladder, molecular base pair standard Lane 1: Single step PCR: pimer pair pa2102-e/pa2102-h Lane 2: Nested PCR: primer pairs 1724F/ITS2R + ITS1F/ITS2R1 http://www.cdc.gov/dpdx/pneumocystis/dx.html
Nested PCR
Kwantitatieve PCR = qpcr = real-time PCR
Klinische toepassing Gezien patientencategorie (immunogecomprimiteerd, IC-indicatie) en ernst van de ziekte, wordtbij verdenking(kliniek en beeldvorming) al met behandelinggestart voordatbal is verricht en uitslag bekend is
Klinische toepassing Negatieve uitslag microscopie: behandeling niet stoppen Positieve uitslag microscopie= bevestiging, dus geen PCR nodig Langere duur uitslag PCR: in de kliniek minder relevant Positieve uitslag PCR: mogelijk overbehandeling, echter afwegen acceptabele bijwerkingen versus ernstig beloop onbehandeldeziekte
Vragen?