Nieuwe ontwikkelingen in HER2- detectie bij het mammacarcinoom

Transcriptie

1 Nieuwe ontwikkelingen in HER2- detectie bij het mammacarcinoom New developments in detection of HER2 in breast cancer Auteurs Trefwoorden Key words C.B. Moelans, R.A. de Weger, L.D.C. Hoefnagel, E. van der Wall en P.J. van Diest CISH, FISH, HER2, mammacarcinoom, MLPA, SISH breast cancer, CISH, FISH, HER2, MLPA, SISH Samenvatting De moleculaire diagnostiek van het mammacarcinoom heeft de afgelopen jaren een grote vlucht genomen. De HER2/neu-bepaling voorspelt in hoge mate de gevoeligheid voor behandeling met trastuzumab en lapatinib. De HER2-status werd traditioneel op eiwitniveau bepaald met immuunhistochemie, maar inmiddels zijn er verscheidene HER2-eiwitbepalingen (bijvoorbeeld enzyme-linked immunosorbent assay ) alsmede HER2-bepalingen op RNA-niveau (real-timepolymerasekettingreactie, microarray) en op DNA-niveau (fluorescentie-in-situhybridisatie, chromogene-in-situhybridisatie, zilver-in-situhybridisatie of multiplex ligatie-afhankelijke probeamplificatie). Dit artikel geeft een overzicht van deze nieuwe ontwikkelingen. Daar geen van de nu beschikbare methoden als echte gouden standaard beschouwd kan worden, is de diagnostiek in de praktijk veelal gebaseerd op een combinatie van technieken. Verdere klinische studies zullen moeten uitwijzen welke techniek de beste voorspellende waarde heeft voor reactie op trastuzumab en vergelijkbare HER2-remmers. Standaardisatie, interne en externe kwaliteitscontrole, en automatisering van de processen voor weefselbewerking (autostainers) en interpretatie (beeldanalyse) zullen een steeds belangrijkere rol spelen bij het optimaal testen van de HER2-status. (Ned Tijdschr Oncol 2010;7:186-97) Summary Molecular techniques play an increasing role in breast cancer detection and prediction of prognosis and treatment response. HER-2/neu predicts the sensitivity of breast tumors to trastuzumab. HER2 status has traditionally been assessed at the protein level by immunohistochemistry, but nowadays there are several new ways to assess HER2 at the protein level (e.g. enzyme-linked immunosorbent assay), at the RNA level (real-time polymerase chain reaction, microarray) or at the DNA level (fluorescence in situ hybridisation, chromogenic in situ hybridisation, silver in situ hybridisation or multiplex ligation-dependent probe amplification). This paper provides an overview of these new developments in HER2 testing. Since none of the available techniques can serve as a true gold standard for HER2 status at this point, diagnostics are often based on a combination of these techniques. Further clinical studies will have to reveal which technique has the best predictive value for response to trastuzumab. Standardisation, proper internal and external quality control, and automation of tissue processing (autostainers) and interpretation methods (image analysis) will play an increasingly important role in HER2 testing. Inleiding Wereldwijd wordt jaarlijks bij meer dan 1,1 miljoen vrouwen de diagnose mammacarcinoom gesteld en dit aantal is sinds 1975 bijna verdubbeld. In Nederland is het mammacarcinoom de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen: ongeveer 1 N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E V O L. 7 N R

2 op de 8 Nederlandse vrouwen krijgt in haar leven een mammacarcinoom. De diagnose werd in 2007 bij vrouwen en 87 mannen gesteld (ikcnet) en jaarlijks sterven meer dan Nederlandse vrouwen aan een mammacarcinoom. Bij de diagnose, prognose en de hieruit voortvloeiende behandelingskeuze van het mammacarcinoom is er een toenemende rol weggelegd voor moleculaire technieken. Een belangrijk voorbeeld hiervan is de detectie van amplificatie of overexpressie van het oncogen humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2), aanwezig in 10-25% van de mammacarcinomen. 1-4 HER2, ook wel neu genoemd naar zijn rattenhomoloog, is een proto-oncogen dat gelegen is op de lange arm van chromosoom 17 en codeert voor een transmembraanreceptoreiwit, dat samen met HER1, HER3 en HER4 de epidermale groeifactorfamilie vormt. In een normale cel zijn 2 kopieën van het HER2-gen aanwezig, maar bij 10-25% van de mammacarcinomen is het gen in meerdere kopieën aanwezig (amplificatie), wat doorgaans resulteert in te grote hoeveelheden receptoreiwit op de celmembraan en een gestimuleerde groei door autokinaseactiviteit. Patiënten met HER2-genamplificatie, en in de meeste gevallen dus HER2-eiwitoverexpressie, hebben een slechtere prognose dan patiënten met tumoren zonder HER2-amplificatie. 3,5 Bovendien zijn HER2- positieve tumoren gevoeliger voor bepaalde chemotherapeutica (antracyclines). 6 Naast een prognostische marker is HER2 een belangrijk direct therapeutisch target bij de behandeling van het mammacarcinoom. Trastuzumab (Herceptin ) is een recombinant gehumaniseerd monoklonaal antilichaam gericht tegen het HER2-eiwit dat, al dan niet in combinatie met reguliere chemotherapie, de levensduur van HER2- positieve patiënten aanzienlijk verlengt. 7,8 In 2000 is trastuzumab in Nederland geregistreerd voor de behandeling van gemetastaseerde HER2-positieve mammacarcinomen. Als adjuvante behandeling in combinatie met chemotherapie vermindert trastuzumab de kans op recidief met 50% en reduceert het de mortaliteit met eenderde versus chemotherapie alleen Inmiddels is ook lapatinib geregisteerd, in combinatie met het cytostaticum capecitabine, voor de behandeling van HER2-positieve tumoren die gemetastaseerd zijn. 13 Omwille van deze prognostische, predictieve en therapeutische implicaties, is het van belang om de HER2-status van patiënten met een mammacarcinoom met de grootst mogelijke nauwkeurigheid te bepalen. Alleen patiënten met HER2-overexpressie of -amplificatie hebben voordeel bij een trastuzumabbehandeling. 14 Een fout-positieve-uitslag kan leiden tot een onnodige, dure ( per patiënt per jaar) therapie en onnodige (voornamelijk cardiotoxische) bijwerkingen van trastuzumab voor de patiënt. Bij een fout-negatieve-uitslag wordt de patiënt een belangrijke therapieoptie onthouden. De HER2-status van een mammacarcinoom kan zowel op eiwitniveau als op DNA-/RNA-niveau bepaald worden. Traditioneel werd de HER2-status op eiwitniveau bepaald met immuunhistochemie, maar inmiddels zijn er verscheidene HER2-eiwitbepalingen, alsmede HER2-bepalingen op RNA- en DNAniveau beschikbaar. In dit overzichtsartikel worden deze verschillende nieuwe ontwikkelingen beschreven. HER2-statusbepaling op eiwitniveau Immuunhistochemie Tot op heden is immuunhistochemie (IHC), zoals weergegeven in Figuur 1A en 1D, de meest toegepaste primaire techniek om de HER2-status te bepalen. IHC is een eenvoudige, snelle en relatief goedkope rechtstreekse detectiemethode van het HER2-eiwit die gemakkelijk te implementeren is in routine pathologielaboratoria. Bij deze test worden weefselcoupes geïncubeerd met een antilichaam gericht tegen het HER2-receptoreiwit, vervolgens gelabeld, en ten slotte wordt het eiwit zichtbaar gemaakt met een kleurstof met als resultaat een membraankleuring. Hoe meer HER2-eiwit aanwezig is, hoe sterker deze kleuring. De mate van kleuring wordt doorgaans gescoord volgens de DAKO-richtlijnen (Glostrup, Denemarken) als 0 (negatief), 1+ (zwakke niet-complete membraankleuring), 2+ (complete membraankleuring die niet uniform is of met een zwakke intensiteit bij meer dan 10% van de tumorcellen) of 3+ (complete sterk-positieve membraneuze aankleuring bij meer dan 30% van de tumorcellen). Alleen een IHC 3+-score wordt geinterpreteerd als overexpressie van HER2 en geldt als indicatie voor therapie met trastuzumab. Bij een score van IHC 0 of 1+ komt de patiënt niet in aanmerking voor deze therapie. De IHC 2+-groep (10-15% van alle mammacarcinomen) is moeilijker te beoordelen, daar uit verschillende onderzoeken is gebleken dat bij een deel van de IHC 2+-groep het HER2-gen daadwerkelijk geamplificeerd is. Daarom vereist deze groep nog een verdere analyse met een secundaire genamplificatietest zoals fluorescentie-insituhybridisatie (FISH), chromogene-in-situhybridisatie (CISH), zilver-in-situhybridisatie ( silver in situ 187 V O L. 7 N R N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

3 A C B D F E Figuur 1. Immuunhistochemie (IHC, HercepTest TM ), chromogene-in-situhybridisatie (CISH) en multiplex ligatie-afhankelijke probe-amplificatie (MLPA) voor de detectie van HER2-overexpressie en -amplificatie bij het mammacarcinoom: een voorbeeld met discrepantie tussen de technieken. A. HER2-IHC 1+-tumor met in B. amplificatie door MLPA (zie 3 HER2-probepieken (*) veel hoger dan de controles en 2 andere gecoamplificeerde chromosoom 17-pieken (**)), zoals bevestigd door CISH in C. D. HER2-IHC 3+-tumor met in E. geen amplificatie door MLPA (geen van de 3 HER2-probepieken is hoger dan de controles) of CISH in F. hybridisation ; SISH) of multiplex ligatie-afhankelijke probe-amplificatie (MLPA). Bovenstaand scoringssysteem is echter onderhevig aan variatie tussen verschillende pathologen, en N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E V O L. 7 N R

4 standaardisatie en kwaliteitscontrole zijn absoluut noodzakelijk. Bovendien is de mate van IHC-aankleuring erg beïnvloedbaar door fixatiecondities. Dit alles heeft tot gevolg dat verschillende interlaboratorium-kwaliteitscontrolestudies variabiliteit in meer of mindere mate hebben aangetoond. Door de invoering van de Food and Drug Administration (FDA)-goedgekeurde HercepTest TM (Genentech Inc.), veruit de meest gebruikte IHC-test, is het kleuringsproces en het scoringssyteem beter gestandaardiseerd, maar nog steeds gebruiken binnen Nederland 47 verschillende laboratoria 10 verschillende antilichamen, 9 verschillende voorbehandelingen en maar liefst 12 verschillende ontwikkelmethoden (Stichting Kwaliteitsbewaring Medische Laboratoriumdiagnostiek (SKML) 2009). Het gebruik van geautomatiseerde systemen zoals Ventana Benchmark (Pathway, 4B5-kloon) en Leica Microsystems Bondmax TM (Oracle HER2 Bond IHC system, CB11-kloon) kan de procesvariabiliteit minimaliseren en vaak ook de specificiteit en positieve predictieve waarde van HER2-testen verhogen, maar dan nog blijft de interpretatie van de mate van membraankleuring een struikelblok. 15,16 Interpretatie van membraankleuring kan wellicht worden geoptimaliseerd met kwantitatieve beeldanalyse. 5 Hiervoor zijn momenteel verschillende applicaties voorhanden. Het automated quantitative analysis (AQUA)-systeem, bijvoorbeeld, is gekoppeld met een fluorescentiemicroscoop die de expressie van biomarkereiwitten detecteert door de intensiteit te meten van antilichaam-geconjugeerde fluorescente labels in een bepaald cellulair compartiment (kern, cytoplasma, plasmamembraan) binnen een tumorgebied, bijvoorbeeld voor HER2. 17 Het resultaat is een kwantitatieve score van de intensiteit van een biomarker binnen de tumor. Andere software-applicaties zijn onder andere Aperio Scanscope, Definiens en Vysis AutoVysion TM. Dit soort applicaties neemt de subjectiviteit van een traditioneel scoresysteem voor een belangrijk deel weg en geeft een meer reproduceerbare score van eiwitexpressie (of genamplificatie) in een tumor Kwantitatieve beeldanalyse wordt aanbevolen door de American Society of Clinical Oncology (ASCO)-/College of American Pathologists (CAP)-richtlijnen, vooral bij een zwakke HER2- membraankleuring (1+/2+). 20 Immuunhistochemie kost volgens de 2009 Nederlandse Zorgautoriteit (NZA)-tarieven 237,70 en kwantitatieve beeldanalyse 142,40. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Het HER2-receptoreiwit kan door een matrix metalloproteïnase, zoals ADAM10, geknipt worden in 2 delen: een extracellulair domein (ECD, p105) dat in de circulatie vrijkomt, en een transmembraan en intracellulair domein (p95). ECD-niveaus kunnen in serum gemeten worden met behulp van een ELISA (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.). Deze test werd FDA-goedgekeurd in 2000 en gebruikt 2 antilichamen om de hoeveelheid HER2-ECD in het bloed te meten. Indien deze waarde groter of gelijk is aan 15 ng/ml wordt er gesproken van een verhoogde ECD-waarde. Een verhoogd ECD is detecteerbaar door ELISA bij tot 45% van de mammacarcinoompatiënten met metastasen en bij ongeveer 15-30% van alle mammacarcinoompatiënten op het tijdstip van diagnose Bij HER2-positieve tumoren worden verhoogde niveaus van serum HER2-ECD geassocieerd met progressieve gemetastaseerde ziekte en een slechte respons op chemotherapie en hormonale therapie. 25 Bij patiënten behandeld met trastuzumab is de respons groter bij patiënten met verhoogde HER2-ECD basale waardes en een snelle verlaging van deze waardes is predictief voor respons en progressievrije overleving. 26,27 Serum-ECD-waardes zijn daarom voorgesteld als alternatieve methode om de HER2-status te bepalen, maar niet alle patiënten met HER2-positieve tumoren hebben verhoogde serum-ecd-waardes, en ook patiënten met HER2- negatieve tumoren kunnen verhoogde ECD-waardes hebben. Het nut van de serum-ecd basale waarde en de verandering ervan gedurende de therapie als potentiële marker voor tumorrespons of progressieve ziekte staat momenteel nog ter discussie. Het aantal geïncludeerde patiënten in de meeste studies was relatief laag en leverde dus niet genoeg bewijs op om hier behandelingskeuzes op te kunnen baseren. De HER2-ECD-waarde wordt op dit moment onderzocht als potentiële biomarker voor de detectie van recidief of metastase en voor het voorspellen van de respons op therapie. 28 Nochtans heeft recentelijk een grote meta-analyse de gegevens van 4 trastuzumabstudies bij gemetastaseerde mammacarcinoom samengevoegd en aangetoond dat er bij de 322 geincludeerde patiënten geen verband was tussen basale ECD-waarde en tumorrespons. 29 ECDwaardes daalden bij de initiatie van combinatietherapie onafhankelijk van de behandeling en de tumorrespons. Alleen bij trastuzumab-monotherapie werd een trend gezien tussen een snelle verlaging van 189 V O L. 7 N R N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

5 de ECD-waarde en de beste respons, maar de overlap was te groot om klinisch toepasbaar te kunnen zijn. Bovendien werd ziekteprogressie niet betrouwbaar voorspeld door verhoging van de ECD-waardes. Deze studie raadt dan ook niet aan om ECD-waardes te gebruiken voor het maken van een behandelingskeuze. Bovendien is gebleken dat de respons op lapatinib-therapie onafhankelijk is van de HER2- ECD-status en dus wordt het meten van de serum- HER2-ECD-waardes ook niet aangeraden voor het voorspellen van lapatinib-respons. 30,31 HER2-eiwit en -homodimeren De HERmark assay (Monogram Biosciences) is gebaseerd op Veratag -technologie en is voorlopig alleen in de Verenigde Staten verkrijgbaar. HERmark gebruikt 2 monoklonale antilichamen gericht tegen unieke epitopen op de HER2-receptor. Dit resulteert in 2 antilichamen die vlakbij elkaar binden aan dezelfde HER2-receptor. Een fluorescente VeraTag (V)-reporter wordt geconjugeerd aan een eerste monoklonaal antilichaam (Ab1) specifiek voor HER2. Het tweede HER2-specifieke monoklonale antilichaam (Ab2) wordt geconjugeerd aan biotine, dat dan weer is vastgemaakt aan een fotosensitief molecuul (FM). Fotoactivatie van een sample bij een specifieke golflengte activeert de FM, waardoor zuurstofradicalen vrijkomen die de vlakbij gelegen V-reporter kunnen losknippen. De vrijgekomen V-reporter wordt dan opgevangen en vervolgens gekwantificeerd met capillaire elektroforese. De hoeveelheid losgeknipte V-reporter is rechtevenredig met de concentratie van HER2 in het sample. 32 De HERmark Breast Cancer Assay kwantificeert nauwkeurig de hoeveelheid totaal HER2-eiwit en de HER2--homodimeerhoeveelheden in paraffine-ingebed materiaal. Een positieve HERmark -uitslag is gebaseerd op de vergelijking met HER2-tests gedaan bij referentiemonsters (centrale IHC en centrale insituhybridisatie), zijnde mammacarcinomen van het Hershey Medical Center/Medical University of Vienna-cohort, het Mayo Clinic-cohort en de Fin Her Adjuvant Breast Cancer-studie. De precisie, accuraatheid, reproduceerbaarheid, lineariteit, specificiteit en sensitiviteit waren reeds gevalideerd over een brede dynamische range van HER2- expressie. Data over de HERmark -test werden voornamelijk gepresenteerd op grote oncologische conferenties zoals de ASCO en het San Antonio Breast Cancer Symposium. Details over deze presentaties en over lopende klinische studies kunnen teruggevonden worden op de website HERmark reclassifeerde tot 25% van de samples van een cohort van de FinHer Adjuvant Breast Cancer-studie. 33 HERmark kon de prognose van gemetastaseerde mammacarcinoompatiënten beter bepalen dan FISH en de resultaten correleerden sterk met de trastuzumab-respons in de Hershey- Vienna klinische studie (n=103). 34 Andere klinische validatiestudies zijn op dit moment gaande om HERmark -metingen te correleren met de respons op HER2-gerichte therapieën. Monogram Biosciences beweert dat haar test accurater is dan IHC- en FISHtechnologie bij het selecteren van mammacarcinoompatiënten die een voordeel zullen hebben bij trastuzumab-therapie. De HERmark -test kan HER2 detecteren bij aantallen vanaf tot meer dan 1 miljoen receptoren per cel, wat 7 tot 10 keer meer sensitief zou zijn dan IHC. Patiënten die op dit moment getest willen worden met HERmark moeten daarvoor wel $ betalen. HER2-statusbepaling op RNA-niveau Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qrt-pcr) QRT-PCR-studies voor HER2 bij het mammacarcinoom zijn relatief zeldzaam, waarschijnlijk door het moeilijk te isoleren RNA uit paraffinemateriaal en door de relatieve instabiliteit van RNA ten opzichte van DNA. De studies die er wel naar gekeken hebben, vonden een goede correlatie met IHC- en ISH-technieken, zelfs in paraffinemateriaal Bovendien wordt qrt-pcr ook steeds vaker gebruikt in de vorm van een nested -PCR voor het meten van mrna in circulerende tumorcellen (CTC s), maar bepaling van CTC s wordt volgens de huidige richtlijnen (nog) niet aangeraden voor het bepalen van de behandelbaarheid van patiënten met mammacarcinoom. 38 QRT-PCR kost volgens de NZA-tarieven 304,90. Microarray TargetPrint (Agendia) is een microarray-gebaseerde genexpressietest die een kwantitatieve bepaling toelaat van de RNA-overexpressie van oestrogeenreceptor, progesteronreceptor en HER2 bij mammacarcinoom. IHC levert een semi-kwantitatief HER2-resultaat op, terwijl het genexpressie-resultaat bij TargetPrint een absolute (kwantitatieve) waarde van HER2 oplevert. TargetPrint werd gevalideerd bij meer dan 500 mammacarcinomen in 3 onafhankelijke studies in vergelijking met de IHC- N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E V O L. 7 N R

6 resultaten van een centraal laboratorium met een concordantie van 96% (95%-betrouwbaarheidsinterval: 94-98%). 39,40 Deze bepaling werd eind 2008 door Agendia BV ingevoerd, wordt alleen verricht in Agendia s laboratoria in Huntington Beach (California, Verenigde Staten) en in Amsterdam en kost daar 800 (of gratis in combinatie met de Mammaprint-test, die kost). HER2-statusbepaling op DNA-niveau Er zijn momenteel 2 FDA-goedgekeurde HER2- genamplificatietesten beschikbaar: FISH en CISH. Van 29 laboratoria die meededen aan de kwaliteitsrondzendingen georganiseerd door de SKML in 2009, gebruikten 45% van de labs CISH (Zymed / Invitrogen TM, Zytovision) als genamplificatietechniek, 42% FISH (DAKO, Vysis Inc.), 10% SISH (Ventana Medical Systems Inc.) en 3% gebruikten een andere techniek. FISH Twee-kleuren-FISH (Vysis Pathvysion TM, DAKO pharmdx TM ) werd goedgekeurd door de FDA in Bij FISH worden (meestal rood-) fluorescentgelabelde probes (enkelstrengs DNA-fragmenten) gebruikt die complementair zijn aan (een deel van) het HER2-gen. Na hybridisatie (binding) aan het complementaire DNA in de coupe kunnen deze probes met een fluorescentiemicroscoop zichtbaar worden gemaakt. Het aantal kopieën van het HER2-gen kan dan geschat worden. Volgens internationale afspraak wordt bij een HER2-kopieaantal 2,2 ten opzichte van een centromeer 17-probe (als controle voor polysomie 17, meestal groen), een tumor als HER2-geamplificeerd beschouwd. Hierbij worden minimaal 20 tumorcellen geteld in ten minste 2 invasieve tumorgebieden. Of de controleprobes voor centromeer 17 nodig zijn, wordt sinds kort echter betwijfeld, omdat polysomie 17 erg zeldzaam is in mammacarcinomen Vergelijkende studies hebben aangetoond dat er een goede correlatie bestaat tussen FISH en IHC. 44,45 Tegenstrijdige resultaten bevinden zich voornamelijk in de IHC 2+-groep. FISH is echter een arbeidsintensieve en dure techniek, waarvoor het gebruik van een fluorescentiemicroscoop en een getrainde beoordelaar absoluut noodzakelijk zijn. Beoordeling kost veel tijd en wordt vaak belemmerd door het optreden van autofluorescentie en overlappende kernen. De fluorescentie verzwakt met de tijd waardoor preparaten en de fluorescent-gelabelde probes in de commercieel beschikbare kits maar een beperkte houdbaarheid hebben. Ten slotte zijn gedetailleerde morfologische kenmerken van de tumor vaak moeilijk te herkennen door de vereiste voorafgaande eiwitdigestie en de fluorescente modus, en kan heterogeniteit gemakkelijker over het hoofd gezien worden omdat de beoordeling van het aantal kopieën gebeurt met de 100 x olie-immersielens. FISH is hierdoor geen erg praktische primaire screeningtest en wordt meestal alleen uitgevoerd voor de IHC 2+-groep. FISH kost volgens de NZA-tarieven 304,90. CISH In 2008 kreeg ook CISH (InvitrogenT M ), geïntroduceerd door Tanner et al. als alternatief voor FISH, een FDA-goedkeuring. 41,46 CISH maakt gebruik van een immuunperoxidasereactie om de HER2-probes zichtbaar te maken, waardoor beoordeling met een conventionele lichtmicroscoop mogelijk wordt. Bovendien zijn preparaten, net als bij IHC, permanent houdbaar en wordt de morfologie veel beter behouden, hetgeen detectie van heterogeniteit vergemakkelijkt. Volgens internationale afspraak wordt bij een HER2-kopieaantal >10 of bij aanwezigheid van grote clusters bij meer dan 50% van de tumorcellen, een tumor als HER2-geamplificeerd beschouwd. Hierbij worden minimaal 30 tumorcellen geteld in invasieve tumorgebieden. CISH (Figuur 1C en 1F, pagina 188) is gemakkelijker te beoordelen door pathologen die nog weinig ervaring hebben met fluorescentiemicroscopie en is minder duur dan FISH. Verschillende studies toonden aan dat er een goede correlatie bestaat tussen CISH, FISH en IHC De meeste beschikbare CISH-assays op dit moment zijn nog steeds monoprobe-assays, wat betekent dat, in tegenstelling tot bij de meeste FISH-assays, er alleen naar de aanwezigheid van meerdere kopieën van HER2 gekeken wordt. High-level HER2-amplificaties zijn gemakkelijk te herkennen, maar low-level-amplificaties - die minder frequent voorkomen - zouden verward kunnen worden met polysomie van chromosoom 17, en deze tumoren lijken klinisch en morfologisch meer op HER2-negatieve dan op HER2-positieve tumoren. 49 Er is nu ook een nieuwe CISH (DAKO DuoCISH TM Kit)-assay commercieel beschikbaar die bestaat uit zowel een HER2-probe (rood) als een CEP17-probe (blauw). Deze test wordt uitgevoerd op coupes die al met Dako PharmDx FISH-probes gekleurd zijn: anti-fitc wordt geconjugeerd met horseradish peroxidase en anti-texas Red wordt geconjugeerd met alkalische fosfatase. Nochtans is 191 V O L. 7 N R N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

7 Figuur 2. Multiplex ligatie-afhankelijke probe-amplificatie (MLPA)-ratio-resultaten voor een mammacarcinoom met een amplificatie van HER2 (ERBB2, 3 probes) en WSB1 (een ander meer centromerisch gelegen chromosoom 17-gen). Alle andere probes (onder andere ESR1, EGFR, TOP2A), inclusief de controleprobes (c), hebben een ratio <2,0 en zijn niet geamplificeerd. recentelijk gebleken dat polysomie van chromosoom 17 erg zeldzaam is bij het mammacarcinoom, en is aangetoond dat FISH-negatieve patiënten met polysomie (wel HER2-amplificatie maar een HER2/ CEP17-ratio <2,2) toch een respons vertoonden op trastuzumab-therapie. 42,43,50 CISH kost volgens de NZA-tarieven 304,90. SISH Ventana Medical Systems Inc. (Tucson, Verenigde Staten) heeft nu ook een FDA-goedkeuring aangevraagd voor hun volautomatische INFORM TM HER2-SISH-technologie die binnen 6 uur een diagnose mogelijk maakt en gebruik maakt van metallografie, waarbij het gebonden horseradish peroxidase de reductie van zilveracetaat katalyseert om een zwart signaal te produceren. SISH voor CEP17 kan bovendien gelijktijdig op een sequentiële coupe uitgevoerd worden. Het scoren van SISH gebeurt op dezelfde manier als bij CISH en HER2/ CEP17-SISH vertoont een goede correlatie met CISH en met FISH. 51,52 Bovendien is er, ondanks het feit dat SISH een goede interobserver-concordantie vertoont, een nieuwe softwareapplicatie ontwikkeld, het Ventana Image Analysis System (VIAS TM ), wat een digitaal beeld vormt van het microscoopveld en de HER2- en CEP17-kopieën telt bij opeenvolgende coupes. Als het minimale aantal cellen bereikt is, berekent VIAS TM de HER2/CEP17-ratio. Een recent overzichtsartikel geeft een vergelijking weer tussen IHC, FISH, CISH en SISH, waaruit blijkt dat CISH een goede concordantie vertoont met IHC en FISH en dat SISH even betrouwbaar is als CISH en FISH voor het bepalen van de HER2-status. 53 SISH kost volgens de NZA-tarieven 304,90. MLPA Omdat meer kwantitatieve resultaten gemakkelijker interpreteerbaar zijn dan ISH om HER2-amplificatie te beoordelen, werden PCR-gebaseerde technieken geïntroduceerd zoals MLPA en qpcr (voorheen Roche Diagnostics, nu alleen nog custom-made verkrijgbaar) MLPA heeft maar kleine hoeveelheden uit paraffine geïsoleerd DNA ( ng) nodig, waarbij fragmentatie van het DNA van weinig belang is. MLPA is gebaseerd op amplificatie van paren hemiprobes die specifieke sequenties tegen verschillende targets (genen), alsmede universele PCR-primersequenties bevatten. Na hybridizatie op de targetsequentie worden de hemiprobes geligeerd en kunnen deze worden geamplificeerd. Een variabele (verschilt in lengte voor elke probe) stuffer -sequentie op 1 van de hemiprobes bepaalt de lengte van het PCRproduct van ieder gen, waardoor tot 45 paren hemiprobes (tegen verschillende genen of verschillende N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E V O L. 7 N R

8 Tabel 1. Vergelijking voor- en nadelen van HER2-immuunhistochemie (IHC), in-situhybridisatie (ISH) en multiplex ligatie-afhankelijke probe-amplificatie (MLPA). IHC FISH CISH SISH MLPA target eiwit gen gen gen gen FDA-goedgekeurd ja* ja ja nee nee arbeidsintensiviteit laag hoog hoog laag laag laboratoriumkosten laag hoog hoog hoog laag moeilijkheidsgraad laag hoog hoog hoog intermediair doorvoersnelheid hoog laag laag hoog hoog invloed heterogeniteit nee ja nee nee ja invloed tumorpercentage nee nee nee nee ja invloed DCIS nee ja nee nee ja objectiviteit interpretatie +/- +/- +/- +/- + behoud morfologie + +/ additionele informatie - chromosoom - - chromosoom 17-ploïdie 17-ploïdie diverse andere genen (bijvoorbeeld TOP2A) *sommige kits. FISH=fluorescentie in-situhybridisatie, CISH=chromogene in-situhybridisatie, SISH= silver in situ hybridisation, FDA=food and drug administration, DCIS=ductaal carcinoma in situ. delen van genen) geamplificeerd kunnen worden in dezelfde PCR-reactie. Eén van de PCR-primers is fluorescent gelabeld waardoor na analyse van het PCR-product op een Applied Biosystems TM I310/ 3130 Genetic Analyzer gevolgd door GeneScan - analyse (Figuur 1B en 1E, pagina 188), de relatieve piekhoogte per probe (ratio ten opzichte van referentieprobes gelegen in stabiele gebieden van het genoom), die correleert met de hoeveelheid aanwezig target- DNA, berekend kan worden met een softwareprogramma (Coffalyser, zie Figuur 2, pagina 192). De HER2-MLPA-assay (P004-B1, MRC-Holland) bevat een probemix met 3 sets van hemiprobes die verschillende sequenties van het HER2-gen herkennen, een aantal chromosoom 17-probes (zoals TOP2A), ESR1, EGFR en een aantal controleprobes gelegen op andere chromosomen. Deze high-throughput- PCR-gebaseerde techniek biedt een gemakkelijk uit te voeren en eenvoudig te interpreteren alternatief of supplement voor IHC en ISH. Een amplificatietest zoals MLPA zou misschien zelfs geschikt zijn als prescreeningtool: MLPA kan tot wel 45 genen analyseren in 1 assay en zo kunnen verschillende genen die belangrijk zijn voor therapieselectie en/of prognose gelijktijdig getest worden voor amplificatie. In verschillende studies werd een goede correlatie gevonden met IHC, FISH en CISH Daar tegenover staat dat de weefselarchitectuur verloren gaat, heterogeniteit over het hoofd gezien kan worden, dat contaminatie met ductaal carcinoma in situ (DCIS, dat vaak HER2-geamplificeerd is zonder dat de invasieve tumor die amplificatie heeft) tot fout-positiviteit kan leiden, en dat het tumorpercentage hoog genoeg moet zijn (>30%). 60 Daarom is een goede selectie van tumormateriaal in de haematoxyline-eosine (HE)-coupes essentieel en kunnen mesodissectie (het met een scalpel afschrapen van het tumorgebied) of lasermicrodissectie noodzakelijk zijn bij een laag tumorpercentage of een relevante DCIS-component. Een vergelijking tussen IHC, ISH en MLPA wordt weergegeven in Tabel 1. MLPA kost volgens de NZA-tarieven 304,90. Is er een beste test? Op dit moment is er (behalve voor de noodzaak van een tweedelijnstest bij IHC 2+) geen consensus over welke van de genoemde technieken de beste is, noch over het gebruik van mono- of duoprobe-ish- 193 V O L. 7 N R N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

9 Tabel 2. Factoren die een rol spelen bij een goede kwaliteitswaarborging. inrichting laboratoria protocolering werkwijze ( standard operating procedure ; SOP) interne/externe experimentele controles verslaglegging volgens praktijkrichtlijnen interne toetsing van analyses specifieke expertise (moleculair-bioloog, hoger laboratoriumonderwijs-analisten en pathologen) bijscholing en training voldoende kwantiteit participeren aan kwaliteitscontrole ( quality control ; QC)-rondzendingen immuunhistochemie/moleculaire pathologie accreditatie actieve interactie tussen verschillende pathologielaboratoria systemen, noch over het gebruik van manuele of geautomatiseerde kleur- en beoordelingssystemen. Alhoewel alle technieken een goede correlatie met elkaar hebben in vergelijkende studies, zijn er altijd discrepanties beide kanten op en hebben alle technieken hun voor- en nadelen. 61,62 Uit grote studies blijkt dat op dit moment bij 10 tot 20% van de als HER2-positief geteste (IHC, FISH) tumoren sprake is van een fout-positief-resultaat; over het percentage fout-negatieve-testresultaten zijn weinig gegevens beschikbaar. 20 Reactie op trastuzumab-therapie is het beste eindpunt, maar lang niet alle methoden zijn hiervoor getest, zeker niet in vergelijkende studies. Na een grondige literatuurstudie van januari 1987 tot februari 2006 bleek dat noch IHC, noch FISH superieur was als voorspeller voor de respons op anti- HER2-therapie. 20 Een echte gouden standaard is er dus echter vooralsnog niet. Gezien de toenemende waardering voor nieuwe methoden zoals CISH, SISH en MLPA, zal er in de toekomst waarschijnlijk discussie ontstaan over het al dan niet standaard toepassen van deze methoden naast IHC of zelfs als eerstelijnstest. Hoewel dit de kosten initieel ogenschijnlijk zal doen toenemen, levert dit uiteindelijk grote winst op omdat een deel van de patiënten een (zeer) dure therapie met significante bijwerkingen bespaard blijft. Het is daarom niet uitgesloten dat, na een gedegen kosteneffectiviteitanalyse, de high-throughput-amplificatietesten de IHC kosten-effectief zullen kunnen complementeren of zelfs vervangen. Vooralsnog zullen keuzes voor een teststrategie nog in sterke mate bepaald worden door lokale voorkeuren op basis van praktische en prijstechnische overwegingen. Kwaliteitsaspecten Tabel 2 geeft de factoren weer die nodig zijn om een goede kwaliteitswaarborging te kunnen garanderen. Hiervan zullen enkele verder uitgelicht worden. Gezien de moeilijkheid om zowel preanalytische, analytische als postanalytische (interpretatie-) factoren te kunnen standaardiseren, zijn het gebruik van interne en/of externe experimentele controles essentieel voor het waarborgen van een goede kwaliteit. Bij elke HER2-IHC-kleuring moet een combicoupe van een negatieve, een 1+- en 3+-controle worden meegenomen; indien de positieve controle negatief is of zwakker dan gebruikelijk, dient de kleuring herhaald te worden, alsook wanneer de 1+- of negatieve controle te sterk aankleuren. Pathologielaboratoria worden geacht te werken volgens de kwaliteitscriteria van een accrediterende instantie (in de huidige praktijk het CCKL of het Nederlands Instituut voor Accreditatie in de Zorg). Deze accreditatie richt zich op het bedrijfsvoeringsysteem (de organisatie als functionerend geheel), de laboratoriumverrichtingen (de technisch/analytische competentie) en op een beroepsinhoudelijke toetsing (de competentie van beroepsbeoefenaren). Een laboratorium dient ook met goed gevolg mee te doen aan externe nationale (SKML) of internationale (bijvoorbeeld NordiQC) quality assessment - rondzendingen. N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E V O L. 7 N R

10 Aanwijzingen voor de praktijk 1. Daar geen van de nu beschikbare HER2-testmethoden als echte gouden standaard beschouwd kan worden, is de diagnostiek in de praktijk veelal gebaseerd op een combinatie van technieken. Vooralsnog zullen keuzes voor een teststrategie nog in sterke mate bepaald worden door lokale voorkeuren op basis van praktische en prijstechnische overwegingen. 2. Uit grote studies blijkt dat op dit moment bij 10 tot 20% van de als HER2-positief geteste (immuunhistochemie, fluorescentie in-situhybridisatie) tumoren sprake is van een fout-positiefresultaat; over het percentage fout-negatieve-testresultaten zijn weinig gegevens beschikbaar, maar dit zou veel lager liggen. 3. Standaardisatie, interne en externe kwaliteitscontrole en automatisering van de processen voor weefselbewerking (autostainers) en interpretatie (beeldanalyse) zullen een steeds belangrijkere rol spelen bij het optimaal testen van de HER2-status. 4. Hoewel HER2-conversie bij mammacarcinoommetastasering relatief zeldzaam is (5%), roept de aanwezigheid ervan toch de vraag op of, indien mogelijk, metastasen niet vaker gebiopteerd zouden moeten worden. Bovendien worden door de taakgroep Moleculaire Pathologie van de Nederlandse Vereniging voor Pathologie sinds 2001 een aantal aanbevelingen geformuleerd die betrekking hebben op kwaliteitseisen voor de moleculaire diagnostiek in de pathologie. Hieronder vallen alle diagnostische bepalingen die worden uitgevoerd op DNA of RNA uit weefsel, histologisch of cytologisch materiaal (dit omvat dus ook de moleculaire bepaling van HER2). Hierbij wordt onder andere de beschikbaarheid van de expertise van een moleculair bioloog noodzakelijk geacht voor de kwaliteit van de moleculaire diagnostiek. Om de continuïteit te kunnen waarborgen moet een laboratorium kunnen terugvallen op de expertise van minimaal 2 moleculair biologen. Een patholoog kan taken overnemen van de moleculair bioloog, mits deze patholoog uitgebreide scholing heeft gehad in moleculair biologische technieken en deze expertise aantoonbaar up-to-date kan houden. Het is in deze situatie noodzakelijk dat er ook een moleculair bioloog beschikbaar is of dat er een formele samenwerkingsovereenkomst is met een moleculair bioloog van een ander diagnostisch laboratorium. Om continuïteit in het laboratorium te waarborgen is het noodzakelijk om minimaal 3 analisten te hebben, die voor de moleculair pathologische bepalingen kunnen worden ingezet. Een zeker volume per laboratorium en patholoog is essentieel om voldoende expertise in huis te hebben en consistentie te waarborgen. Over criteria hiervoor is geen wereldwijde consensus, maar als vuistregel zou gesteld kunnen worden dat een lab ten minste 100 bepalingen per jaar uitvoert en dat een patholoog ten minste 50 beoordelingen per jaar doet. Om dit laatste te halen zal voor de meeste labs de beoordeling beperkt moeten worden tot enkele pathologen. De gemetastaseerde setting, testen van primaire tumor of metastase? Ongeveer eenderde van de mammacarcinoompatiënten ontwikkelt een metastase op afstand. Ongeveer 25% van de mammacarcinoompatiënten zal overlijden aan afstandsmetastasen. Curatie is zeldzaam. Behandeling van deze metastasen wordt op dit moment gebaseerd op de status van de primaire tumor aangezien de metastase vaak niet wordt gebiopteerd. Dit komt enerzijds door de vaak gelimiteerde bereikbaarheid van deze metastasen, maar anderzijds ook omdat het niet noodzakelijk wordt geacht voor verdere therapiekeuze. Verschillende studies hebben echter aangetoond dat de HER2-status kan verschillen tussen de primaire tumor en de metastase (receptorconversie) Het gerapporteerde percentage HER2-conversie in deze studies varieert tussen 0 en 44%, waarbij vaker een HER2-positieve metastase gezien werd bij een negatieve primaire tumor dan vice versa. Deze bevinding, indien bevestigd, heeft belangrijke klinische conse- 195 V O L. 7 N R N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

11 quenties, aangezien een aantal patiënten niet de optimale systemische behandeling krijgt. In een recente eigen studie werd met behulp van IHC en SISH de HER2-status van 236 mammacarcinoommetastasen (79 huid, 63 lever, 43 long, 44 hersenen en 7 gastro-intestinaal) vergeleken met deze van de primaire tumor. HER2-SISH werd gebruikt bij IHC-conversie of wanneer de primaire tumor of metastase IHC 2+ was. HER2-receptorconversie (0/1+ of 2+ naar 3+ of omgekeerd) kwam voor bij 5% van de patiënten. Van deze 12 tumoren die HER2-conversie vertoonden, kon maar bij 5 metastasen ook conversie aangetoond worden met SISH. Bovendien was er 1 metastase die met SISH conversie vertoonde, maar niet met IHC. HER2- conversie kwam voor in beide richtingen (van hoog naar laag en van laag naar hoog) en leek het meest voor te komen in levermetastasen. HER2-conversie bij mammacarcinoommetastasen is dus zeldzaam, maar komt frequenter voor in levermetastasen. Deze resultaten roepen toch de vraag op of, indien mogelijk, metastasen niet vaker gebiopteerd zouden moeten worden. Als alternatief zouden moleculaire beeldvormingstechnieken zoals positronemissietomografie en single-photon-emission computerized tomography gebruikt kunnen worden om de HER2-status te bepalen van metastasen die moeilijk te biopteren zijn. 77,78 Conclusie De HER2-status wordt routinematig getest bij ieder nieuw invasief mammacarcinoom. Hoewel HER2- conversie bij mammacarcinoommetastasering relatief zeldzaam is (5%), roept de aanwezigheid ervan toch de vraag op of, indien mogelijk, metastasen niet vaker gebiopteerd zouden moeten worden. Er is de afgelopen 10 jaar veel technische vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van HER2-testen. Op dit moment is er echter nog geen consensus over welke van de eiwit- of gengebaseerde technieken de beste is, noch over het gebruik van mono- of duoprobe-ish-systemen, noch over het gebruik van manuele of geautomatiseerde kleur- en beoordelingssystemen. Alhoewel alle technieken een goede correlatie met elkaar hebben in vergelijkende studies, hebben alle technieken hun voor- en nadelen. Een echte gouden standaard is er daarom niet. Totdat grote vergelijkende klinische studies overtuigend 1 strategie aanwijzen als de best voorspellende voor reactie op trastuzumab, zullen keuzes voor een HER2-teststrategie vooralsnog nog in sterke mate bepaald worden door lokale voorkeuren op basis van praktische en prijstechnische overwegingen. Volgens de SKML-cijfers van 2009 gebruikten 45% van de labs CISH als secundaire genamplificatietechniek, 42% FISH en 10% SISH. Immuunhistochemie blijft nog steeds de meest toegepaste primaire techniek voor het bepalen van de HER2-status. Gezien de moeilijkheid om zowel preanalytische, analytische als postanalytische (interpretatie-) factoren te kunnen standaardiseren voor eender welke HER2- test, is het gebruik van interne en externe controles essentieel voor het waarborgen van een goede kwaliteit. Ook zijn het jaarlijks deelnemen aan kwaliteitsrondzendingen (zoals SKML of NordiQC) en kwaliteitscertificering en het hebben van een zeker volume aan bepalingen van groot belang. Referenties 1. Owens MA, et al. Clin Breast Cancer 2004;5: Ross JS, et al. Mol Cell Proteomics 2004;3: Slamon DJ, et al. Science 1987;235: Slamon DJ, et al. Science 1989;244: Baak JP, et al. Lab Invest 1991;64: Paik S, et al. J Natl Cancer Inst 1998;90: Vogel CL, et al. J Clin Oncol 2002;20: Slamon DJ, et al. N Engl J Med 2001;344: Piccart-Gebhart MJ, et al. N Engl J Med 2005;353: Romond EH, et al. N Engl J Med 2005;353: Slamon D, et al. Breast Cancer Res Treat 2005;94: Smith I, et al. Nat Rev Clin Oncol 2010;7: Mass RD, et al. Clin Breast Cancer 2005;6: Bankfalvi A, et al. Int J Oncol 2004;25: Moelans CB, et al. Cell Oncol 2010;32: Camp RL, et al. Nat Med 2002;8: Gustavson MD, et al. J Natl Cancer Inst 2005;97: Wolff AC, et al. Arch Pathol Lab Med 2007;131: Krainer M, et al. Oncology 1997;54: Molina R, et al. Anticancer Res 1999;19: Mori S, et al. Jpn J Cancer Res 1990;81: Isola JJ, et al. Cancer 1994;73: Colomer R, et al. Ann Oncol 2004;15: Kostler WJ, et al. Clin Cancer Res 2004;10: Kostler WJ, et al. Anticancer Res 2004;24: Imoto S, et al. Jpn J Clin Oncol 1999;29: Lennon S, et al. J Clin Oncol 2009;27: Cameron D, et al. Breast Cancer Res Treat 2008;112: Finn RS, et al. J Clin Oncol 2009;27: Shi Y, et al. Diagn Mol Pathol 2009;18: Joensuu H, et al. 31st Annual San Antonio Breast Cancer Symposium 2008;# Lipton A, et al. 31st Annual San Antonio Breast Cancer N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E V O L. 7 N R

12 Symposium 2008;# Bergqvist J, et al. Ann Oncol 2007;18: Rosa FE, et al. BMC Cancer 2009;9: Barberis M, et al. Am J Clin Pathol 2008;129: Apostolaki S, et al. Breast Cancer Res Treat 2009;117: Glas AM, et al. BMC Genomics 2006;7: Ach RA, et al. BMC Genomics 2007;8: Marchio C, et al. J Pathol 2009;219: Moelans CB, et al. Breast Cancer Res Treat 2009;120: Yeh IT, et al. Mod Pathol 2009;22: Pauletti G, et al. J Clin Oncol 2000;18: Lebeau A, et al. J Clin Oncol 2001;19: Tanner M, et al. Am J Pathol 2000;157: Hanna WM, et al. Mod Pathol 2006;19: Arnould L, et al. Br J Cancer 2003;88: Vanden Bempt I, et al. J Clin Oncol 2008;26: Hofmann M, et al. J Clin Pathol 2008;61: Francis GD, et al. Diagn Mol Pathol 2009;18: Bartlett JM, et al. Am J Clin Pathol 2009;132: Penault-Llorca F, et al. Am J Clin Pathol 2009;132: Schouten JP, et al. Nucleic Acids Res 2002;30:e Egervari K, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2009;17: Lamy PJ, et al. Int J Biol Markers 2006;21: Moelans CB, et al. Cell Oncol 2009;31: Moerland E, et al. Cell Oncol 2006;28: Purnomosari D, et al. Biotech Histochem 2006;81: Moelans CB, et al. BMC Cancer 2009;9: Perez EA, et al. J Clin Oncol 2006;24: Paik S, et al. J Natl Cancer Inst 2002;94: Masood S, et al. Ann Clin Lab Sci 2000;30: Shimizu C, et al. J Surg Oncol 2000;73: Tanner M, et al. Cancer Res 2001;61: Gancberg D, et al. Ann Oncol 2002;13: Edgerton SM, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2003;11: Lear-Kaul KC, et al. Arch Pathol Lab Med 2003;127: Gong Y, et al. Cancer 2005;103: Zidan J, et al. Br J Cancer 2005;93: Tapia C, et al. Breast Cancer Res 2007;9:R Santinelli A, et al. Int J Cancer 2008;122: Lower EE, et al. Breast Cancer Res Treat 2009;113: Broom RJ, et al. Anticancer Res 2009;29: Liedtke C, et al. Ann Oncol 2009;20: Simmons C, et al. Ann Oncol 2009;20: Munnink TH, et al. The Breast 2009;18:S66-S Perik PJ, et al. J Clin Oncol 2006;24: Ontvangen 6 januari 2010, geaccepteerd 3 mei Correspondentieadres Mw. dr. C.B. Moelans, onderzoeker Dhr. dr. R.A. de Weger, hoofd onderafdeling Moleculaire Immuunpathologie Mw. drs. L.D.C. Hoefnagel, promovendus Dhr. prof. dr. P.J. van Diest, hoofd afdeling Pathologie Universitair Medisch Centrum Utrecht Afdeling Pathologie Postbus GA Utrecht Tel.: adres: cmoelans@umcutrecht.nl Mw. prof. dr. E. van der Wall, hoogleraar Interne Geneeskunde Divisie Interne Geneeskunde en Dermatologie Correspondentie graag richten aan de eerste auteur. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. 197 V O L. 7 N R N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E