Fractionatie van lipideklassen in biologische vloeistoffen

Transcriptie

1 Vakgroep rganische Chemie nderzoeksgroep Scheidingstechnieken Fractionatie van lipideklassen in biologische vloeistoffen Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door Mike DE VRIEZE Academiejaar Promotor: Prof. Dr. P. Sandra Begeleidster: Dr. B. Bicalho

2

3 Dankwoord Ik zou hierbij enkele personen willen bedanken zonder wie ik dit resultaat niet had kunnen bereiken. In eerste instantie wil ik mijn promotor, Prof. Dr. P. Sandra en mijn begeleidster, Dr. B. Bicalho bedanken voor de kans die ik kreeg om mijn thesis te realiseren en voor de voortreffelijke begeleiding tijdens het onderzoek. Verder wil ik iedereen in de onderzoeksgroep Scheidingstechnieken bedanken voor hun hulpvaardigheid bij allerhande problemen en voor de aangename sfeer. Tot slot wil ik mijn familie en vrienden bedanken voor de financiële en emotionele steun, dankzij hen kreeg ik de kans om mijn studies tot een goed einde te brengen.

4 Inhoudstafel 1. Inleiding en doelstellingen Fundamentele chromatografische aspecten ntstaan van de chromatografie Theorie omtrent chromatografie Vormen van chromatografie aangewend in dit werk Dunnelaagchromatografie (TLC) Hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC) HPLC-opstelling Detectoren Modes in HPLC Gaschromatografie (GC) GC-opstelling De injectie bij CGC Soorten kolommen bij GC Detectoren Lipidenonderzoek in biologische vloeistoffen verzicht van de lipideklassen Neutrale lipiden Vrije vetzuren Glycerolipiden Sterolen en sterolesters Polaire lipiden Lipidenonderzoek met TLC Lipidenonderzoek met HPLC Lipidenonderzoek met GC Experimenteel gedeelte i

5 4.1. Doelstellingen Gebruikte chemicaliën Evaluatie van een TLC-methode voor het scheiden van de lipideklassen Reagentia en standaarden Instrumentatie Extractie van de lipiden uit eigeel Methode Resultaten en bespreking Conclusie Analyse van lipiden via HPLC Evaluatie van een silica-kolom voor het scheiden van lipideklassen Instrumentatie Aangewende methodes Resultaten en bespreking Conclusies bij het gebruik van een silica-kolom Evaluatie van een diol-kolom voor het scheiden van lipideklassen Instrumentatie Aangewende methodes Resultaten en bespreking Conclusies bij het gebruik van een diol-kolom Concentratiebepaling van de lipideklassen in plasma Doel Instrumentatie Methode Resultaten en bespreking Fractieverzameling met HPLC Analyse van vetzuren via GC-FID ii

6 Instrumentatie mestering van de vetzuren naar FAMEs Injectie bij GC-FID Resultaten en bespreking Conclusies bij de analyse van de vetzuursamenstelling Besluit Referentielijst Appendix A: Lijst met de gebruikte afkortingen Appendix B: verzicht van de gebruikte standaarden iii

7 1. Inleiding en doelstellingen De laatste jaren is er heel wat vooruitgang geboekt bij de instrumentatie voor chromatografie en massaspectrometrie. Deze vooruitgang heeft bijgedragen tot een sterke uitbouw van de omics -onderzoeksgebieden in de systeembiologie. Voorbeelden hiervan zijn lipidomics, proteomics, genomics en metabolomics. Lipidomics wordt omschreven als de studie (identificatie en kwantificatie) van lipiden en hun interacties met andere lipiden, proteïnen en andere metabolieten. Lipidomics is een snel groeiend onderzoeksveld waarbij de vooruitgang aan de kennis omtrent lipiden een analoge trend volgt aan de voorafgaande explosie aan informatie uit de genomics en proteomics. Lipiden spelen een cruciale rol in de cel, in weefsels en bij de fysiologie van organen. Dit wordt aangetoond door een groot aantal genetische studies en door meerdere menselijke ziektes waarbij enzymen voor het lipidenmetabolisme afgebroken worden of het reactiemechanisme onderbroken wordt. Voorbeelden van ziektes waarbij lipiden een belangrijke rol spelen zijn diabetes, obesitas, atherosclerose, hoge bloeddruk, hartaanvallen en kanker. Lipidomics is derhalve een veelbelovend gebied bij biomedisch onderzoek, met een waaier aan mogelijke toepassingen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en het ontdekken van biomarkers. Het doel van dit werk is het opstellen van een bruikbare methode voor een fractionatie van de verschillende lipideklassen en deze methode te toetsen voor biologische vloeistoffen. Voorts zal gepoogd worden om de verschillende lipideklassen preparatief op te vangen zodat een verdere analyse hiervan mogelijk wordt, zoals de bepaling van hun individuele vetzuursamenstelling. 1

8 2. Fundamentele chromatografische aspecten 2.1. ntstaan van de chromatografie Het woord chromatografie is afgeleid van de Griekse woorden χρωμα ( chroma, kleur) en γραφειν ( graphein, schrijven). De Russische botanicus Mikhail Semyonovich Tswett (figuur 2.1) legde in 1901 de basis voor chromatografie tijdens zijn onderzoek op plantenpigmenten, waarbij hij erin slaagde om chlorofyl (= bladgroen) te scheiden van carotenoïden. Hiertoe gebruikte hij glazen kolommen gepakt met CaC 3 als stationaire fase en een mengsel van petroleumether en ethanol als mobiele fase. De pigmenten, die zichtbaar waren als verschillende gekleurde banden in de kolom, werden van elkaar gescheiden door de verschillende snelheid waarmee ze door de kolom bewogen. De mobiele fase werd doorheen de gepakte kolom gestuurd onder invloed van de zwaartekracht, dit zorgde er echter voor dat de experimenten nogal traag verliepen. Desondanks was de basis gelegd voor vloeistofchromatografie. Archer John Porter Martin en Richard Laurence Millington Synge legden in de periode de basis voor gaschromatografie. Hierna volgde een snelle ontwikkeling van de verschillende vormen van chromatografie. Chromatografie is intussen zo ver geëvolueerd dat deze techniek kan aangewend worden als een algemene routine analysetechniek. Figuur 2.1: Mikhail S. Tswett 2.2. Theorie omtrent chromatografie Bij een chromatografische analyse wordt een monster met verschillende componenten aangebracht op een plaat (zoals bij TLC, zie verder) of op een kolom. De snelheid waarmee verschillende componenten de kolom doorlopen varieert naargelang de affiniteit die ze vertonen voor de stationaire en de mobiele fase. De elutie- of retentietijd (t R ) van een component wordt langer wanneer de affiniteit van de component voor de stationaire fase groter wordt ten opzichte van de mobiele fase. Elke component heeft bijgevolg een karakteristieke retentietijd voor elke combinatie van stationaire en mobiele fase. Dit leidt tot de definitie van de retentiefactor k (zie vergelijking 2.1), die de retentietijd t R relateert aan de tijd die een component spendeert in de mobiele fase (t M ). t M is de retentietijd van een component die niet weerhouden wordt en wordt ook wel de dode tijd van de kolom genoemd. 2

9 k = t t t = t t (2.1) Hierbij is t R de tijd die een component doorbrengt in de stationaire fase. Door een chromatogram, waarin het signaal van een detector wordt uitgezet in functie van de tijd, kan dit verduidelijkt worden (figuur 2.2). signaalsterkte Δt R t R1 t R2 t R1 σ 1 σ 2 t R2 t M W h1 W h2 W b1 W b2 tijd Figuur 2.2: Chromatogram voor een mengsel van 2 componenten De belangrijkste methode om de waarde van k te wijzigen is door de samenstelling van de mobiele fase te veranderen: hoe kleiner de affiniteit van de componenten is voor de mobiele fase, hoe langer de retentietijd zal zijn, en hoe groter k zal zijn. k is ook afhankelijk van de hoeveelheid stationaire fase aangezien de interactie met de stationaire fase dan groter wordt. Dit laatste wordt verduidelijkt met behulp van vergelijking 2.2. De distributiecoëfficiënt K D, gedefinieerd als de verhouding van de concentratie van een component in de stationaire fase (C S ) over de concentratie in de mobiele fase (C M ), kan herschreven worden als het product van de retentiefactor en de fase ratio β. De fase ratio is de verhouding van het volume van de mobiele fase (V M ) over het volume van de stationaire fase (V S ). K = C = m V C m V = m m V V = k β (2.2) De selectiviteitsfactor α is de verhouding van de retentiefactor van de later eluerende component over deze van de eerder eluerende component en wordt berekend met behulp van 3

10 vergelijking 2.3. In HPLC wordt de waarde van α, die altijd groter is dan 1, bepaald door de keuze van de stationaire en mobiele fase. Bij GC zal verandering van de mobiele fase weinig invloed hebben op de selectiviteit. α = k k = t t t t = t t (2.3) Het plaatgetal N levert een idee omtrent de efficiëntie van de scheiding. N wordt bekomen via vergelijking 2.4. W b is de piekbreedte aan de basis van de piek, W h is de piekbreedte op halve hoogte, σ is 1 4 van W b. Deze piekbreedte komt voor op 88,2% van de hoogte van de piek wanneer de piekverdeling Gaussiaans is. N = 16 t = 5,54 t = t W W σ (2.4) Het verwachte plaatgetal kan theoretisch worden berekend met behulp van vergelijking 2.5 of 2.6, respectievelijk voor vloeistofchromatografie (met gepakte kolommen) en gaschromatografie (met open tubulaire kolommen). In beide vergelijkingen staat L symbool voor de lengte van de kolom. H is de afkorting van HETP, dit is het hoogte-equivalent van een theoretische plaat. N = L H L 2d (2.5) d p staat voor de diameter van de deeltjes waarmee de kolom gepakt is. Het kan aangetoond worden dat H bij een optimaal gepakte kolom gelijk is aan 2d p [1]. N = L H L d (2.6) d c is de interne diameter van de kolom. De eenvoudigste manier om N te verhogen is dus door de kolomlengte (L) te verhogen of door de partikelgrootte (d p ) of de kolomdiameter (d c ) te verkleinen. Bij een hogere N is de 4

11 scheiding beter: ofwel wordt de piekbreedte kleiner, ofwel wordt de retentietijd van de componenten langer. Eén van de meest gebruikte kolommen bij HPLC is een kolom met een lengte van 25 cm en een interne diameter van 4,6 mm waarbij de diameter van de deeltjes 5 µm is. Een eenvoudige berekening leert ons dat het theoretisch plaatgetal van deze kolom bedraagt. De meest gebruikte kolom bij GC is een capillaire kolom met een lengte van 25 m met als interne diameter 0,25 mm en een filmdikte van 0,25 µm. Het theoretisch plaatgetal van deze kolom bedraagt De mate van scheiding tussen twee componenten wordt weergegeven door de resolutie R S. De resolutie kan experimenteel bepaald worden uit een chromatogram zoals figuur 2.2 via vergelijking 2.7. R = t t t t = t (2.7) ( ) W W Hierbij stellen t R1 en t R2 de retentietijden voor van de eerste en de tweede component. W b1 en W b2 komen overeen met de piekbreedtes aan de basis van deze pieken. mdat het verschil tussen W b1 en W b2 dikwijls klein is, kan meestal een vereenvoudiging gemaakt worden. De samenhang tussen de retentiefactor, de selectiviteitsfactor en het plaatgetal komt tot uiting in de resolutievergelijking (vergelijking 2.8). R = N 4 α 1 α k k + 1 (2.8) 2.3. Vormen van chromatografie aangewend in dit werk De International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) definieert chromatografie als een fysische scheidingsmethode waarin de te scheiden componenten verdeeld worden over twee fasen, waarvan er één stationair is, terwijl de andere beweegt in een bepaalde richting [2]. De stationaire fase kan hierbij een vaste stof, een gel of een vloeistof zijn. Men spreekt van kolomchromatografie wanneer de stationaire fase zich in een cylindrische kolom bevindt. Hier kan een onderscheid gemaakt worden tussen enerzijds een gepakte kolom, waarbij deeltjes de volledige kolom opvullen, en anderzijds een open buis kolom, waarbij de deeltjes of de stationaire fase als een dunne laag aangebracht zijn op de 5

12 binnenkant van de kolom en waarbij in het midden van de kolom een vrije doorgang is voor de mobiele fase. De mobiele fase kan een vloeistof (vloeistofchromatografie, LC), een gas (gaschromatografie, GC) of een superkritische vloeistof (superkritische vloeistofchromatografie, SFC) zijn. Men spreekt van planaire chromatografie wanneer de stationaire fase op een vlak verspreid is. Hier kunnen we een onderscheid maken tussen papierchromatografie en dunnelaagchromatografie (TLC). TLC, HPLC en GC worden hieronder kort uiteengezet aangezien deze technieken aangewend werden in dit werk Dunnelaagchromatografie (TLC) Bij deze vorm van chromatografie wordt een vlakke ondergrond (meestal een glazen of aluminium plaat) bedekt met de stationaire fase bestaande uit een dunne laag sorberend materiaal zoals silicagel of aluminiumoxide. Bij TLC (Thin Layer Chromatography) wordt het te analyseren monster aangebracht (gespot) op de plaat, en wordt de plaat rechtop geplaatst in de elutietank. Deze tank is gevuld met het eluens (de mobiele fase). De spot moet boven het eluensniveau komen wanneer de plaat in de elutietank wordt geplaatst. De beweeglijkheid van het eluens wordt verkregen door capillaire opstijging. m te vermijden dat dit mechanisme verstoord wordt, wordt er eerst voor gezorgd dat de atmosfeer in de afgesloten elutietank verzadigd is met eluensdamp. Het monster wordt altijd in oplossing gebracht vooraleer het op de plaat te spotten. Tijdens de chromatografie komt het eluens in contact met het monster. De componenten van het monster bewegen met een verschillende snelheid afhankelijk van hun relatieve affiniteit voor de stationaire en mobiele fase. Aan de hand van figuur 2.3 zijn de verschillende stappen te volgen. Bij deze figuur worden er drie monsters aangebracht op de plaat. De plaat wordt in de Figuur 2.3: ntwikkeling van een TLC-plaat elutietank geplaatst, die vervolgens wordt afgesloten. Na verloop van tijd zullen de mobiele fase en de componenten voldoende gestegen zijn om de plaat uit de elutietank te halen. Hierna wordt het eluens op de plaat verdampt. 6

13 Iedere component heeft onder bepaalde omstandigheden een karakteristieke chromatografische index, de zogenoemde R f -waarde (R f = retention/ retardation factor). Deze waarde is de verhouding van de afstand die de component afgelegd heeft (korte pijl rechts in figuur 2.3) tot de afstand die het eluens afgelegd heeft (lange pijl rechts in figuur 2.3). Er werden heel wat strategieën ontwikkeld om de spots zichtbaar te maken. Veelal wordt een UV-lamp (254 nm) gebruikt. Absorptie van I 2 -dampen kan ook als methode gebruikt worden. Het is ook mogelijk om de plaat onder te dompelen of te besproeien met een bepaalde oplossing, zoals een oplossing van zwavelzuur, permanganaat, anisaldehyde of ammoniummolybdaat [3]. TLC is een goedkope techniek die snel en gemakkelijk uitvoerbaar is. Daarom wordt TLC dikwijls gebruikt om het verloop van reacties op te volgen en voor een kwalitatieve analyse van reactieproducten. Een ander voordeel is dat er meerdere monsters simultaan gescheiden kunnen worden op één TLC-plaat. Enkele nadelen zijn onder andere het gering scheidend vermogen dit kan gedeeltelijk worden opgelost door een 2D-scheiding uit te voeren en de moeilijkheid om de resultaten kwantitatief te beoordelen Hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC) HPLC-opstelling Bij de kolomchromatografie door Tswett werden grote, ruwe partikels gebruikt en werd de mobiele fase door de kolom gestuurd onder lage (gravitatie) druk. De term HPLC (High Performance Liquid Chromatography) wordt gebruikt bij het aanwenden van hoge drukken en veel kleinere, homogene partikels. Een HPLC-systeem kan schematisch voorgesteld worden zoals in figuur 2.4. Het eluens, dat zich in een reservoir bevindt, wordt ontgast vooraleer het in het systeem wordt gebracht. De pomp moet in staat zijn om het debiet constant te houden. Dit kan slechts als de druk heel goed gecontroleerd wordt. Bij vele pompen bedraagt de maximale druk 400 bar, recentere pompen halen reeds 1200 bar. Menging van de verschillende solventen is ook belangrijk. Bij een isocratische elutie blijft de samenstelling van de mobiele fase constant gedurende de analyse. Bij een gradiëntelutie verandert de samenstelling van de mobiele fase. Het monster wordt via de injector als een smalle plug in de mobiele fase gebracht, dit gebeurt met behulp van een zeswegkraan met injectielus. 7

14 Eluens Filter Pump HPLC-pomp Monster Injectiesysteem Meting van druk en stroomsnelheid Afval Kolom Detector Dataverwerking Fractiecollector Figuur 2.4: Schematische voorstelling van een HPLC-opstelling De mobiele fase wordt vervolgens door de kolom gestuurd, die al dan niet gethermostatiseerd is, waarna het eluens naar een detector of naar een fractiecollector gaat. Indien er een niet-destructieve detector gebruikt wordt, is het plaatsen van de fractiecollector na de detector ook mogelijk. Het signaal van de detector wordt via een dataverwerkingssysteem omgezet in een chromatogram Detectoren Het is belangrijk om een geschikte detector te gebruiken bij een bepaalde meting. De respons van de detector is dikwijls afhankelijk van de component die onderzocht wordt. Wanneer een detector eenzelfde signaal levert voor elke molecule die uit een kolom komt, spreekt men van universele detectie. Gevoeligheid, selectiviteit en lineaire respons zijn belangrijke aspecten voor een detector. Enkele beschikbare HPLC-detectoren zijn UV-Vis, diode array detectie, laser geïnduceerde fluorescentie, massaspectrometrie, elektrochemische detectie en geïoniseerde aërosol detectie (CAD). Hieronder worden de meest relevante detectoren voor dit werk nader uitgelegd. a) UV-detectie UV-detectoren, zoals de variabele golflengte detector afgebeeld in figuur 2.5, werden reeds heel vroeg geïntroduceerd en worden aangewend voor veel toepassingen in HPLC. Met behulp van een rooster en spleten kan de gewenste golflengte geselecteerd worden uit het licht geëmitteerd door een breed spectrum UV-lamp. Het licht wordt vervolgens in een stroomcel 8

15 door de mobiele fase gestuurd. Een deel van het licht wordt hierbij geabsorbeerd. Bij aanwezigheid van een component wordt er meer licht geabsorbeerd, waardoor er een piek in het chromatogram komt. Een nadeel van deze detector is dat niet alle componenten gedetecteerd kunnen worden, enkel chromoforen hebben een UV-spectrum. Uitlaat HPLC kolom Lichtbron Lichtsensor Stroomcel I I 0 Rooster Figuur 2.5: Werkingswijze van een UV-detector Afval b) CAD-detectie Geïoniseerde aërosol detectie of Charged Aerosol Detection (CAD) is een recente detector. De detector geeft een bijna universele respons voor componenten die weinig vluchtig zijn. Voor componenten met een intermediaire vluchtigheid is het signaal dikwijls inconsistent, voor vluchtige componenten geeft de CAD geen signaal [4, 5]. De werking van de detector wordt uiteengezet aan de hand van figuur 2.6. De mobiele fase Verstuiver en impactplaat Elektrometer Uitlaat HPLCkolom Signaal Verwarmde buis Deeltjes met hoge beweeglijkheid worden verwijderd Gastoevoer Collector Afvoer grote druppels Positieve lading wordt overgedragen op componenten Gasstroom positief geladen door hogespanningsbron Figuur 2.6: Werkingswijze van een CAD-detector 9

16 die doorheen de kolom is gegaan wordt daarbij verneveld. De grootste druppels worden onmiddellijk verwijderd, de kleinere druppels komen in een verwarmde buis waar het solvent (gedeeltelijk) verdampt, zodat een aërosol van analietdeeltjes overblijft. De deeltjes worden positief geladen door contact met een geïoniseerd gas (meestal N 2 -gas). Vervolgens worden deeltjes met een hoge beweeglijkheid (zoals de N 2 -ionen) verwijderd onder invloed van een elektrisch veld. Hierna komen de geladen aërosoldeeltjes terecht op een geleidende filter die de lading overbrengt naar een elektrometer voor signaaltransductie. De detector heeft een lineair bereik over meerdere grootte-ordes en is vrij gevoelig (tot ongeveer 1 µg/ml). De respons is onafhankelijk van de chemische eigenschappen van de component. Eén van de grootste beperkingen bij deze techniek is dat de respons van de detector varieert volgens de samenstelling van de mobiele fase; de respons is hoger naarmate de mobiele fase meer organisch is. In principe kan dit probleem opgelost worden door met een andere pomp de tegengestelde gradiënt te leveren, waardoor de totale mobiele fase constant wordt. c) MS-detectie Massaspectrometrie of Mass Spectrometry (MS) is een zeer krachtige techniek die een groeiend gebruik kent. De mobiele fase die uit de kolom komt wordt naar een ionisatiebron gestuurd. Voorbeelden van ionisatiebronnen zijn ESI (Electrospray Ionization) en APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Met behulp van de ionisatiebron worden organische componenten omgezet in geladen ionen. De ionen worden vervolgens gescheiden volgens hun massa/ladingsverhouding (m/z) met de massaspectrometer die onder hoog-vacuüm staat. Er bestaan verschillende massaspectrometers, de belangrijkste zijn de quadrupool, ion trap, magnetische sector-veld en time of flight Modes in HPLC Bij HPLC kunnen meerdere modes aangewend worden ter scheiding van de componenten. Van de meest gebruikte modes wordt in tabel 2.1 een overzicht gegeven. mkeerfase, normaalfase en hydrofiele interactiefase worden hieronder besproken aangezien deze relevant zijn in dit werk. 10

17 Affiniteitschromatografie Chirale chromatografie Hydrofiele interactie chromatografie Ionenpaar chromatografie Ionenuitwisselingschromatografie Normaalfase chromatografie mkeerfase chromatografie Size Exclusion chromatografie Tabel 2.1: Verschillende modes in HPLC a) mkeerfase chromatografie Bij omkeerfase of RP (Reversed-Phase) chromatografie is de mobiele fase polair en de stationaire fase apolair. Als mobiele fase wordt meestal water en water-oplosbare organische solventen zoals acetonitril en methanol gebruikt. De mobiele fase kan gemodificeerd worden met een zuur of base. De scheiding bij RPLC gebeurt op basis van de hydrofobiciteit, waarbij de meest hydrofobe (meest C-atomen) component het langst weerhouden wordt. Hoe groter de hydrofobiciteit van de mobiele fase, hoe groter de eluerende kracht. Als stationaire fase wordt meestal C18 gebonden silicagel gebruikt. Andere stationaire fasen zijn C8, C4, CN en phenyl. RPLC heeft een brede waaier aan mogelijke toepassingen en is meestal heel reproduceerbaar, wat ervoor zorgt dat dit de meest gebruikte mode is bij HPLC. b) Normaalfase chromatografie Normaalfase of NP (Normal-Phase) chromatografie is de eerst ontwikkelde HPLC-mode. De stationaire fase is hierbij polairder dan de mobiele fase. Deze methode wordt vooral aangewend voor het scheiden van componenten die onoplosbaar zijn in water. De scheiding gebeurt op basis van polariteit, waarbij de minst polaire structuur het minst geretenteerd is. Apolaire componenten worden niet efficiënt gescheiden met NPLC. Silica (Si 2.xH 2 ) is één van de gebruikte stationaire fasen in NPLC, maar polair gebonden fasen met amino (-NH 2 ), cyano (-CN) of diol (-CHHCH 2 H) als functionele groepen worden ook veel gebruikt. nbehandelde silica is minder populair aangezien dit problemen geeft voor het behouden van een constante oppervlakteactiviteit, wat een nefaste invloed heeft op de reproduceerbaarheid. Bij het gebruik van gebonden fasen is de 11

18 reproduceerbaarheid beter, wat het uitvoeren van gradiënteluties ook mogelijk maakt. Enkele veelgebruikte solventen voor de mobiele fase zijn hexaan, heptaan, isopropanol, methanol, chloroform, dichloormethaan en ethylacetaat. Tot de jaren 70 was NPLC een heel populaire methode, maar door de opkomst van RPLC nam het gebruik sterk af. Door verbetering van de kolommen wordt NPLC opnieuw meer gebruikt. In dit werk wordt deze techniek aangewend aangezien hierbij de lipiden gescheiden worden op basis van hun klasse. Bij RPLC gebeurt de scheiding eerder volgens de vetzuursamenstelling [6]. c) Hydrofiele interactie chromatografie HILIC (Hydrophilic Interaction (Liquid) Chromatography) kan beschouwd worden als een uitbreiding van NPLC naar een waterige mobiele fase [7]. Acetonitril wordt het meest gebruikt als solvent, alhoewel in principe elk aprotisch solvent dat mengbaar is met water gebruikt kan worden. Voor het uitvoeren van een gradiëntelutie vertrekt men van een mobiele fase die typisch 95% organisch solvent bevat. Elutie wordt bekomen door het watergehalte en zo de hydrofiliciteit van de mobiele fase te verhogen. Er wordt aangenomen dat in een HILIC-systeem de mobiele fase een waterrijke laag vormt op het oppervlak van de polaire stationaire fase, waardoor er vloeistof-vloeistof verdeling gebeurt [7]. De componenten worden verdeeld tussen de quasi-stationaire waterrijke laag en de waterarme mobiele fase. Componenten die meer polair zijn zullen een hogere affiniteit vertonen voor de waterige laag dan minder polaire componenten. De scheiding tussen de componenten gebeurt hier dus ook op basis van polariteit. Er werden verschillende stationaire fasen ontwikkeld voor HILIC. Enkele voorbeelden hiervan zijn silica (met functionele groepen), ionenuitwisselaars [8, 9] en click -saccharides [10]. Het verschil in retentieprofiel is redelijk klein aangezien het grootste gedeelte van de scheiding gebeurt tussen de waterige laag op de stationaire fase en de hoofdzakelijk organische mobiele fase. Er is echter nog onduidelijkheid over het mechanisme van HILIC en of er een fundamenteel verschil is met NPLC Gaschromatografie (GC) Het concept van GC (Gas Chromatography) werd bedacht in 1941 door A.J.P. Martin en R.L.M. Synge. Hierna duurde het nog 10 jaar vooraleer deze uitvinding in praktijk werd getest [11]. GC is een uitstekende techniek voor de scheiding en analyse van componenten die in de dampfase gebracht kunnen worden zonder dat er ontleding optreedt. 12

19 GC-opstelling Een GC-systeem kan voorgesteld worden zoals in figuur 2.7. Het systeem start bij het draaggas (= de mobiele fase). Normaal gezien wordt als draaggas helium (He), waterstofgas (H 2 ) of stikstofgas (N 2 ) gebruikt. Het geïnjecteerde monster wordt met behulp van het draaggas door de kolom gestuurd. De kolom bevindt zich in een oven, waarbij het temperatuursprogramma een 1 bepalende factor is voor de scheiding en retentie. De snelheid van het draaggas heeft een grote invloed op de kwaliteit van de 1. Draaggas 2. Injectie 3. Kolom ven 5. Detectie 6. Data collectie en verwerking scheiding en op de analysetijd. De optimale snelheid voor het Figuur 2.7: Voorstelling van een GC-opstelling draaggas bij kolommen waarbij N 2, He of H 2 gebruikt wordt is respectievelijk ongeveer 10 cm/s, 25 cm/s en 40 cm/s. Een kleine variatie in de snelheid van het draaggas heeft het grootste effect bij N 2 en het kleinste effect bij H 2. He en H 2 zijn betere draaggassen aangezien de scheiding veel sneller gaat met eenzelfde efficiëntie als met N 2. Na de kolom wordt er gedetecteerd. De bekomen signalen worden verzameld met een computer, waardoor een chromatogram bekomen wordt. Niet alle componenten kunnen met GC geanalyseerd worden. Zo is een analyse van macromoleculen en biologisch interessante componenten wegens hun hoge kookpunten en/of instabiliteit dikwijls niet mogelijk, terwijl deze analyse wel mogelijk is met HPLC. HPLC en GC hebben elk hun voor- en nadelen, beide technieken hebben vele interessante toepassingen en soms kan de ene techniek een aanvulling zijn op de andere De injectie bij CGC De capaciteit van een capillaire kolom ligt meestal tussen de 0,1 en 3000 ng per component die geïnjecteerd wordt, afhankelijk van de karakteristieken van de kolom, de temperatuur en de retentiefactor. De injectie gebeurt meestal automatisch met een micro-spuit waarmee een volume van 1 µl kan geïnjecteerd worden. De precisie en accuratesse van een GC-analyse kan slechts zo goed zijn als deze van de injector. Bij gaschromatografie wordt de injector beschouwd als de achilleshiel van het 13

20 systeem. Er kan gebruik gemaakt worden van split injectie of splitless injectie. Beide methodes worden hieronder in het kort aangehaald. Bij split injectie wordt het monster in de dampfase gebracht. Na menging met het draaggas wordt de stroom opgesplitst in twee delen, waarvan één deel op de kolom gebracht wordt en het andere deel verwijderd wordt. De verhouding van de twee delen kan gekozen worden door de verhouding van het gasvolume dat door de kolom of naar de afvoer gaat aan te passen. Split injectie is niet geschikt voor monsters waarbij de componenten slechts voorkomen in spoorconcentraties. De concentratie kan dan immers beneden de detectielimiet liggen. Bij dergelijke monsters wordt er gekozen voor splitless injectie, waarbij het geïnjecteerde monster (bijna) volledig in de kolom wordt gebracht. De keuze tussen split of splitless injectie hangt niet enkel af van de concentratie van het monster, maar ook van de gebruikte detector Soorten kolommen bij GC De scheiding is bij GC vrijwel onafhankelijk van de mobiele fase. De interacties die het inerte draaggas aangaat zijn niet specifiek en hebben een gelijke invloed op alle componenten [11]. De stationaire fase heeft echter wel een grote invloed op de scheiding van de componenten. Tegenwoordig worden vrijwel uitsluitend nog open tubulaire capillaire kolommen gebruikt (CGC = capillaire gaschromatografie). De capillaire kolommen zijn uitgevonden door M.J.E. Golay, die de techniek ontwikkelde vanaf 1956 [12]. Wanneer de stationaire fase een vloeistof is, wordt er van een WCT-kolom (Wall-Coated pen-tubular) gesproken. Wanneer er een vaste stof als stationaire fase op de wand van de kolom is aangebracht, spreekt men van een PLT-kolom (Porous-Layer pen-tubular). De interne diameter van een capillaire kolom is meestal kleiner dan 500 µm, de dikte van de coating bedraagt maximaal enkele µm. De lengte van de kolom is heel variabel, frequent gebruikt men kolommen met een lengte van 25 tot 50 m. Er bestaan verschillende stationaire fases voor CGC. De meest universele en meest gebruikte fase is polydimethylsiloxaan (PDMS), de formule-eenheid van het polymeer is -(CH 3 ) 2 Si-. Bij een ongekend monster wordt eerst dit type kolom aangewend. De meeste andere types kolommen hebben dezelfde basisstructuur als PDMS, waarbij een bepaald percentage van de methylgroepen vervangen is door een andere groep. Bij een fenylkolom is deze groep -C 6 H 5. Dit soort kolom kan onder meer bij geneesmiddelen of milieustudies gebruikt worden. Bij een cyanopropylkolom is de groep -(CH 2 ) 3 CN. Dit soort kolom kan bijvoorbeeld aangewend worden bij vetzuuranalyse of bij onderzoek op dioxines. Bij een 14

21 polyethyleenglycol-kolom (WAX) is de basisstructuur -CH 2 CH 2 -. Dit is de beste stationaire fase voor de analyse van meer polaire componenten Detectoren Er zijn meerdere types GC-detectoren, waaronder de thermische conductiviteit detector, de electron capture detector, vlamionisatiedetector, stikstof-fosfor detector en de massaspectrometer. De vlamionisatiedetector en de massaspectrometer worden hieronder nader uitgelegd. a) FID Bij de vlamionisatiedetector (FID = Flame Ionization Detector) wordt het gas afkomstig van de kolom gemengd met H 2 -gas in een oven. Het gasmengsel wordt verbrand in de aanwezigheid van lucht. De collectorplaten verzamelen de ionen die bij de verbranding gevormd zijn en het signaal wordt gemeten met een ampèremeter. In figuur 2.8 wordt de opstelling van een FID schematisch weergegeven. Enkel organische componenten waarbij het mogelijk is om koolstof of waterstof te oxideren geven hierbij een respons. De respons van de detector is evenredig met het aantal CH 2 groepen. De detector is robuust, goedkoop en zeer gevoelig. Heteroatomen verlagen de gevoeligheid van de detector. Collectorplaten lucht, ml/min H 2, 50 ml/min Uitlaat van kolom Figuur 2.8: FID-opstelling b) MS Alhoewel de ionisatiebron verschillend is, is de werking van de massa-analysator dezelfde als hoger uiteengezet ( ). Bij GC-MS wordt de mobiele fase in hoog-vacuüm gebracht voor de ionisatiebron. Twee belangrijke ionisatietechnieken zijn EI (Electron Impact ionization) en CI (Chemical Ionization). EI wordt het meest gebruikt. De ionen die hierbij gevormd worden kunnen fragmenteren door het verbreken van zwakkere bindingen. Het ion met de hoogste m/z-waarde is meestal afkomstig van de origineel geïoniseerde molecule. m een voldoende sterk signaal te verkrijgen bij detectie wordt er een elektron multiplier gebruikt. 15

22 3. Lipidenonderzoek in biologische vloeistoffen 3.1. verzicht van de lipideklassen Het is moeilijk om een precieze definitie aan lipiden te geven. Dikwijls worden lipiden gedefinieerd als vetten en vetachtige stoffen die goed oplosbaar zijn in organische solventen, aangezien in een (biologisch) monster de extractie van lipiden meestal gebeurt met een organisch solvent (bvb. ether, dichloormethaan, alcoholen). Enkele heel polaire lipiden kunnen echter in de waterige fase terechtkomen bij de fasescheiding, zodat deze definitie zeker niet sluitend is [6]. Lipids Sterols Sterol lipids Fatty acids Glycerolipids Glycerophospholipids Sphingolipids Free sterols Bound sterols Sterol lipids Monoacylglycerols Diacylglycerols Phosphatidic acids Phosphatidylcholines Sphingoid bases Ceramides Steryl glycosides Triacylglycerols Phosphatidylserines Phosphatidylinositols Phosphosphingolipids Phosphonosphingolipids Phosphatidylethanolamines Neutral glycosphingolipids Phosphatidylglycerols Acidic glycosphingolipids Phosphoinositides Plasmalogens Figuur 3.1: verzicht van de verschillende lipideklassen Een overzicht van de lipideklassen, zoals opgesteld door M.R. Wenk [6], wordt weergegeven in figuur 3.1. De ingekleurde kaders op de figuur geven de klassen weer waarvan er in dit werk standaarden werden gebruikt. Een volledig overzicht van de gebruikte standaarden is te vinden in appendix B. De variatie aan lipideklassen in het menselijk lichaam is groot. Verscheidene lipideklassen vervullen belangrijke biologische functies. Zonder lipiden kan het lichaam niet functioneren, terwijl te hoge concentraties aan lipiden schadelijk zijn. Aangezien de lipiden een zeer ruime groep aan verbindingen omvatten, is het praktisch om ze in te delen in verschillende groepen. Deze classificatie is arbitrair en kan op verschillende 16

23 manieren gebeuren. Een eenvoudige manier is een onderverdeling in twee groepen: polaire en neutrale (apolaire) lipiden. Hieronder volgt een korte bespreking van deze groepen met hun voornaamste klassen Neutrale lipiden De groep van de neutrale lipiden omvat de sterolen, sterolesters, vrije vetzuren en glycerolipiden (in figuur 3.1 zijn dit de Sterols, Sterol lipids, Fatty acids en Glycerolipids). De structuur en enkele belangrijke kenmerken van deze klassen worden besproken Vrije vetzuren Een vetzuur is een carbonzuur, meestal met een lange, onvertakte alifatische keten. Vetzuren kunnen gebonden zijn aan andere moleculen. Wanneer dit niet het geval is, spreekt men van vrije vetzuren. Wanneer de keten verzadigd is, is de chemische formule als volgt: CH 3 (CH 2 ) n CH. Bij onverzadigde natuurlijke vetzuren is de dubbele binding meestal van het cis-type (zie bijvoorbeeld oliezuur in figuur 3.2). In figuur 3.2 worden enkele van de frequent voorkomende vrije vetzuren voorgesteld. H CH 2 (CH 2 ) 11 CH 3 H CH 2 (CH 2 ) 13 CH 3 H CH 2 (CH 2 ) 15 CH 3 Myristinezuur Palmitinezuur Stearinezuur CH 2 (CH 2 ) 6 CH 3 H H H liezuur Figuur 3.2: Enkele veel voorkomende vrije vetzuren Natuurlijke vetzuren in planten en dieren hebben meestal een even aantal koolstofatomen. Vetzuren met een oneven aantal koolstofatomen komen in de natuur ook voor aangezien sommige bacteriën in staat zijn om deze te synthetiseren Glycerolipiden Deze lipideklasse is verder onder te verdelen in mono-, di- en triglyceriden. 17

24 Een monoglyceride (of monoacylglycerol) bestaat uit een vetzuur dat via een esterbinding gebonden is aan glycerol (figuur 3.3). Men spreekt van een 1-monoglyceride wanneer de esterbinding zich op één van de buitenste H functies van glycerol bevindt. Indien het vetzuur gekoppeld is aan de middelste H functie, spreekt men van een 2-monoglyceride. Bij een diglyceride (of diacylglycerol) zijn er twee vetzuren via H esterbindingen gebonden aan glycerol. Wanneer deze vetzuren voorkomen op de twee buitenste H functies spreekt men van een 1,3- H diglyceride. Indien ze voorkomen op één van de buitenste en op de middelste H functie spreekt men van een 1,2-diglyceride. Het is H mogelijk dat hetzelfde vetzuur tweemaal voorkomt op glycerol of dat Figuur 3.3: Glycerol er twee verschillende vetzuren op gebonden zijn. Bij een triglyceride (of triacylglycerol) is glycerol veresterd met drie vetzuren. Bij de triglyceriden maakt men dikwijls het onderscheid tussen vetten en oliën, aangezien plantaardige oliën en dierlijke vetten voornamelijk (niet enkel) zijn opgebouwd uit triglyceriden. Wanneer de vetzuren verzadigd zijn, spreekt men van een vet. Als er één of meerdere onverzadigdheden voorkomen, zoals bij plantaardige oliën, zijn de triglyceriden veel moeilijker te stapelen en ligt het smeltpunt veel lager. Die zijn daarom vloeibaar bij kamertemperatuur. Triglyceriden, die fungeren als een energiebron in het lichaam, worden voornamelijk opgenomen uit het vet in de voeding. De energie die eruit gerecupereerd kan worden is mede afhankelijk van het aantal onverzadigdheden Sterolen en sterolesters De meest voorkomende verbinding bij de klasse van de sterolen (deze naam is een contractie van de termen steroïde en alcohol) is cholesterol. Cholesterol (zie figuur 3.4), gemaakt in de lever of opgenomen uit de voeding, kan dienen als bouwstof voor lichaamscellen en hormonen. Wanneer het alcohol op een sterol met een vetzuur omgezet wordt in een ester, H H H H Figuur 3.4: Cholesterol 18

25 ontstaat een sterolester. De belangrijkste groep verbindingen hierbij zijn de cholesterolesters Polaire lipiden De polaire lipiden worden in figuur 3.1 weergegeven door de klassen Glycerophospholipids en Sphingolipids. De glycerofosfolipiden bezitten een glycerolstructuur waarbij aan één van de hydroxylgroepen een fosfaatgroep met een eenvoudige organische molecule gebonden is. De andere H functies zijn veresterd met een vetzuur. Als voorbeeld wordt in figuur 3.5 de structuur van een fosfatidylcholine gegeven. R 1 en R 2 duiden op verschillende mogelijke vetzuren. R 2 H R 1 H H NH 2 P H - H3C CH 3 N + CH 3 Een celmembraan bij de mens is een dubbellaag die voornamelijk bestaat uit fosfolipiden: hun hydrofiele kopgroep bevindt zich aan het oppervlak van het membraan, de hydrofobe staart bevindt zich in het midden. De sfingolipiden hebben een sfingosinestructuur als basis. De meest voorkomende vorm van sfingosine is getekend in figuur 3.6. Sfingomyeline komt het meest voor bij de sfingolipiden. De belangrijkste taken van deze lipide zijn de bescherming van de cel en de doorgifte van signalen van de buitenkant naar de binnenkant van de cel. In appendix B worden de structuren van de in dit werk gebruikte polaire lipiden weergegeven. Figuur 3.5: Fosfatidylcholine Figuur 3.6: Sfingosine (CH 2 ) 12 CH Lipidenonderzoek met TLC Rond 1960 begon het onderzoek naar de scheiding van lipideklassen met behulp van chromatografie. Gedurende de jaren 60 gebeurde dit onderzoek vooral met TLC. Het gebruik van deze techniek werd kleiner naarmate HPLC meer toegankelijk werd, maar de laatste jaren heeft TLC een comeback gemaakt, voornamelijk dankzij de lage kostprijs van commerciële platen gecoat met silicagel [13, 14]. De afname van de grootte van de silicadeeltjes en de daaruitvolgende betere uniformiteit van de coating van de platen hebben geleid tot wat HPTLC (High Performance TLC) genoemd wordt, waarbij de scheiding van de componenten significant beter is [15]. 19

26 De afmetingen van de platen die gebruikt worden bij de scheiding via TLC zijn meestal 20 cm x 20 cm. Soms worden er ook platen met andere afmetingen gebruikt, zoals 34 cm x 20 cm of 10 cm x 20 cm. Bij TLC is men niet beperkt tot het gebruik van één eluens, het gebeurt veel meer dat er 2 of 3 mobiele fasen gebruikt worden bij de ontwikkeling van de plaat. Na de ontwikkeling in het ene solvent, wordt de plaat gedroogd en kan ze in het volgende solvent geplaatst worden. Er bestaat een eenvoudige verklaring voor het gebruik van meerdere mobiele fasen: via een bepaald eluens is het mogelijk om ofwel de neutrale lipiden te scheiden terwijl de polaire lipiden niet migreren, ofwel de polaire lipiden te scheiden terwijl de neutrale lipiden dichtbij het solventfront blijven met een slechte scheiding in verschillende klassen [16]. Een volledige scheiding kan dus slechts bekomen worden bij het gebruik van meerdere solventen. Een groot voordeel van TLC is dat het toelaat om meerdere monsters tegelijkertijd te analyseren als parallelle banden op de plaat. Wanneer een complex monster moet onderzocht worden, kan 2D-TLC uitgevoerd worden. De plaat wordt daarbij na de eerste ontwikkeling 90 gedraaid waarna een tweede ontwikkeling volgt in een ander solvent. Dit leidt tot een drastische verhoging van de piekcapaciteit. Polaire lipiden kunnen op een goede manier gescheiden worden met een solvent dat bestaat uit chloroform, methanol en water. Neutrale lipiden worden goed gescheiden met een solvent bestaande uit hexaan en aceton of diëthylether [13, 14, 17, 18]. In dit werk worden de lipiden zichtbaar gemaakt door de TLC-plaat te besproeien met een ammoniummolybdaat-oplossing. Ammoniummolybdaat kan door vele biologische componenten in een zure oplossing gereduceerd worden. Het molybdeen komt hierdoor in een blauwe oxidevorm terecht [19]. Blauwe spots op de TLC-plaat geven dus aan waar de lipiden zich bevinden Lipidenonderzoek met HPLC HPLC werd rond de jaren 80 populair als techniek voor het onderzoek op lipideklassen. Eén van de doelstellingen was het scheiden van alle lipideklassen gedurende één analyse. Een belangrijke stap in deze richting kwam er door het werk van Christie [20], die erin slaagde om de belangrijkste lipideklassen te scheiden. m de lipideklassen, die een groot verschil in polariteit hebben, in één stap te scheiden, was bij normaalfase een gradiëntanalyse aangewezen waarbij het beginsolvent een lage polariteit had en het eindsolvent tot 8% water bevatte. 20

27 De solventen die gebruikt worden om lipiden te extraheren moeten een hoge oplosbaarheid voor alle lipiden hebben en moeten voldoende polair zijn om de lipiden te verwijderen van de celmembranen en de lipoproteïnen. In 1957 werd door Folch een methode ontwikkeld waarbij lipiden uit biologische monsters geëxtraheerd werden met een overmaat aan chloroform-methanol (2:1, v/v) [21]. De methode is in essentie dezelfde gebleven, behalve enkele kleine aanpassingen zoals de extractievolumes [22 24]. De extractieefficiëntie lijkt groter bij een groter volume aangezien een grotere fractie van de organische fase gerecupereerd wordt. De evolutie van de beschikbare detectoren speelde een belangrijke rol bij het onderzoek naar de lipideklassen. UV-detectie kan aangewend worden als techniek [25]. In dit geval is het nodig om bij zeer lage golflengtes (rond de 200 nm) te meten. ok ESI-MS en APCI-MS zijn goede technieken gebleken voor de detectie van lipiden, waarbij zich echter het probleem voordoet dat verschillende componenten met een verschillende respons gedetecteerd worden [26]. De gevoeligheid van de detectie hangt af van de ketenlengte, het aantal onverzadigdheden, de polaire kopgroep, het solvent en de instellingen van de meetapparatuur. m deze redenen zijn kwantitatieve analyses via deze methode moeilijk haalbaar. Massadetectoren, zoals de ELSD zijn ook zeer geschikt voor lipidenonderzoek, zowel voor de neutrale als voor de polaire lipiden. In dit werk wordt gebruik gemaakt van CAD (Charged Aerosol Detection, zie ). Deze detector leent zich uitstekend tot het lipidenonderzoek [27, 28] Lipidenonderzoek met GC mwille van het hoge kookpunt van lipiden is de analyse van de lipideklassen niet zomaar mogelijk via GC. Het is echter wel mogelijk om via GC de samenstelling van de vetzuren bij de lipiden te achterhalen. mwille van de relatief hoge polariteit is het moeilijk om carbonzuren te scheiden met GC. m deze reden wordt er voor de analyse een derivatisatie uitgevoerd. De meest populaire derivatisatiemethode voor lipiden is een omestering (= transesterificatie) tot de corresponderende FAME (Fatty Acid Methyl Ester) [29]. Na de omestering volgt de analyse van de FAMEs met GC. Aangezien enkel de vetzuren van de lipiden bepaald worden, is het onmogelijk om via GC te bepalen welke lipideklasse(n) een monster bevat. Daarom is het aangeraden om eerst de verschillende lipideklassen van elkaar te scheiden (vb. via HPLC), zodat men vervolgens via GC de samenstelling van de vetzuren 21

28 in een bepaalde lipideklasse kan onderzoeken. De detectie van de FAMEs gebeurt dikwijls met MS (Mass Spectrometry) of met FID (Flame Ionization Detection). Vroeger werden de vetzuren eerst afgesplitst van de lipiden door verzeping met natriumhydroxide of kaliumhydroxide, waarna ze gemethyleerd werden. De verzeping bij deze methode gaat echter heel traag. De rechtstreekse omestering van de lipiden, waarbij hydrolyse en verestering in één stap plaatsvinden, gaat veel sneller dan de verzeping. Aangezien slechts één reagens nodig is, is de rechtstreekse omestering niet enkel sneller maar ook eenvoudiger dan verzeping gevolgd door verestering [30]. De reagentia die gebruikt worden bij de methylatie bevatten voornamelijk methanol. Apolaire lipiden zoals triglyceriden en cholesterolesters zijn niet oplosbaar in deze reagentia. m deze componenten op te lossen kan er bijvoorbeeld dichloormethaan gebruikt worden. De rechtstreekse omestering van lipiden kan via een zuur- of een basegekatalyseerde reactie. Bij zuurgekatalyseerde omestering kan men gebruik maken van waterstofchloride, zwavelzuur, boortrifluoride (BF 3 ) of acetylchloride in methanol [30 34]. Er is verwarming nodig om de reactie door te laten gaan. BF 3 -methanol wordt het meest gebruikt voor de omestering van lipiden. Bij basegekatalyseerde omestering zijn natriummethoxide of kaliumhydroxide in methanol de populairste reagentia. Voordelen van deze methode zijn snelle reactietijden en reactie bij kamertemperatuur; nadelen zijn dat de verestering van de vetzuren en de omestering van de sfingolipiden niet doorgaan en dat er een risico is op verzeping. Er kunnen zich meerdere problemen voordoen bij de bereiding van de esters. De conversie van lipiden naar FAMEs kan onvolledig zijn; de vetzuurcompositie kan tijdens de omestering veranderen; onvolledige extractie van de gevormde FAMEs... [30] De extractie werkt heel goed met hexaan aangezien de vetzuurketens bij de FAMEs meestal lang zijn, en de FAMEs bijgevolg apolair zijn. De scheiding van de FAMEs gebeurt met capillaire GC, waarbij de retentietijden van de componenten bepaald worden door de polariteit van de stationaire fase. Wanneer complexe mengsels zoals deze van biologische membranen onderzocht worden, is het aangeraden om te werken met een polaire stationaire fase (bijvoorbeeld met een WAX kolom). Hierbij is de retentietijd groter bij een toenemend aantal dubbele bindingen. Minder polaire stationaire fasen volstaan in de meeste gevallen voor scheiding van FAMEs uit biologische monsters zoals plasma. Wanneer men niet-polaire stationaire fasen gebruikt bij de scheiding van de FAMEs, loopt men het risico op overlapping van enkele belangrijke onverzadigde FAMEs. 22

29 Aangezien onverzadigde vetzuren belangrijk zijn in biologische monsters, werd in dit werk een polaire kolom gebruikt met cyanopropyl siloxaan als stationaire fase. 23

30 4. Experimenteel gedeelte 4.1. Doelstellingen Het doel van dit werk is om via HPLC en TLC een methode op te stellen om lipideklassen te scheiden. Eenmaal deze doelstelling bereikt is zal via GC gepoogd worden om de vetzuursamenstelling van de verschillende lipideklassen in plasma te onderzoeken Gebruikte chemicaliën Aceton, dichloormethaan, isopropanol, methanol en water werden aangekocht bij Sigma- Aldrich (Bornem, België). Ammoniumformiaat, ammoniumacetaat en chloroform waren afkomstig van Aldrich (Milwaukee, WI, VS). Hexaan werd aangekocht bij Fisher Scientific (Loughborough, Leicestershire, Engeland). Azijnzuur en acetylchloride werden bekomen bij Fluka (Buchs, Zwitserland), mierenzuur bij Biosolve (HA Valkenswaard, Nederland). Alle solventen waren van HPLC-kwaliteit. De lipidestandaarden worden samen met hun leverancier vermeld in appendix B (Janssen is gelegen in Beerse, België; Avantipolar Lipids ligt in Alabaster, AL, VS) Evaluatie van een TLC-methode voor het scheiden van de lipideklassen Een scheiding van enkele lipideklassen is relatief eenvoudig te bekomen via TLC. TLC is dus een aangewezen techniek om vertrouwd te raken met het onderwerp van dit onderzoek. Hierbij wordt ook een poging ondernomen om de lipiden uit eigeel te scheiden en de verschillende lipiden via extractie te recupereren om verder te gebruiken bij HPLC Reagentia en standaarden Als lipidestandaarden werden cholesteryloleaat, trioleïne, cholesterol en oliezuur (C, T, C en A) gebruikt. De concentratie van de oplossingen bedroeg 10 mg/ml; cholesterol werd opgelost in hexaan, de andere standaarden in dichloormethaan. De ammoniummolybdaat-oplossing werd bereid door 1 g ceriumsulfaat, 25 g ammoniummolybdaat tetrahydraat en 13,6 ml geconcentreerd zwavelzuur met water aan te lengen tot 1L Instrumentatie Analyses werden uitgevoerd op de analytische silicagel GHLF -platen van Analtech (Newark, DE, VS). De afmetingen van deze platen zijn 20 cm x 20 cm; de silicagellaag heeft een dikte van 250 µm. 24