Evaluatie van de Mini-FLOTAC methode voor detectie van worminfecties bij huisdieren

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Evaluatie van de Mini-FLOTAC methode voor detectie van worminfecties bij huisdieren door Niels VAN DEN PUTTE Promotoren: Prof. dr. E. Claerebout Dr. B. Levecke Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef 2015 Niels Van den Putte

2

3 Vrijwaringsclausule Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

4 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Evaluatie van de Mini-FLOTAC methode voor detectie van worminfecties bij huisdieren door Niels VAN DEN PUTTE Promotoren: Prof. dr. E. Claerebout Dr. B. Levecke Onderzoek uitgevoerd in het kader van de Masterproef 2015 Niels Van den Putte

5 Voorwoord Graag zou ik mijn promotoren Prof. dr. E. Claerebout en Dr. B. Levecke bedanken voor de nodige uitleg over het besproken onderwerp, voor het aanbrengen van nuttige artikels, voor de hulp bij de statistische analyse van de resultaten en bij het schrijven en verbeteren van deze literatuurstudie. Verder wil ik ook N. De Wilde en S. Casaert en bij uitbreiding alle medewerkers van het laboratorium Parasitologie van de Faculteit Diergeneeskunde van de UGent bedanken voor hun hulp bij het aanleren van de technieken en bij het onderzoeken van de stalen. Tenslotte wil ik ook mijn collegastudenten en familie bedanken voor de steun en ideeën die zij gaven tijdens het werken aan deze masterproef.

6 Inhoudsopgave Samenvatting... 1 Inleiding... 2 Literatuurstudie Huidige gebruikte technieken Mestuitstrijkje Kato-Katz Proefbuis flotatie Sedimentatie-flotatie Centrifugatie-flotatie Formol-ether concentratie McMaster FECPAK FLOTAC Onderzoek rond Mini-FLOTAC Wat is Mini-FLOTAC? Vergelijking met andere technieken Humaan Diergeneeskunde Objectieven Materialen en methoden Fecesstalen McMaster Bepaling van de besmettingsgraad Tijdsduur bepaling Mini-FLOTAC Bepaling van de besmettingsgraad Tijdsduur bepaling Statistische analyse Diagnostiek: kwalitatief Diagnostiek: kwantitatief... 19

7 4.3. Tijd Kostenbaten analyse Resultaten Besmettingsgraad Vergelijking Mini-FLOTAC en McMaster Diagnostiek: kwalitatief Diagnostiek: kwantitatief Tijd Kostenbaten analyse Bespreking Kwalitatieve diagnostiek Kwantitatieve diagnostiek Tijd Kostenbaten analyse Vergelijking met andere studies Conclusie Referentielijst... 38

8 Samenvatting Voor de microscopische diagnose van besmettingen met maagdarmnematoden bij huisdieren werd recent een nieuwe techniek ontwikkeld, de Mini-FLOTAC. In deze masterproef werd deze nieuwe techniek vergeleken met de courant gebruikte McMaster techniek. Er werd gekeken naar de diagnostische mogelijkheden van beide technieken alsook naar de tijdsduur die nodig was voor het uitvoeren hiervan. In totaal werden 100 fecesstalen (78 paarden, 11 runderen, 6 schapen en 5 geiten) onderzocht met zowel de Mini-FLOTAC techniek als de McMaster techniek. Hieruit bleek dat met de Mini-FLOTAC techniek meer besmettingen met maagdarmparasieten konden worden gediagnosticeerd dan met de McMaster techniek, maar dat de correlatie tussen beide technieken van het aantal Eieren Per Gram feces (EPG) toch zeer hoog was. De benodigde tijdsduur voor het onderzoeken van de stalen met de Mini-FLOTAC techniek lag significant hoger dan deze nodig voor de McMaster techniek. Dit verschil in tijdsduur was eveneens afhankelijk van de bekomen EPG waarde, waarbij voor hogere EPG waarden het tijdsverschil tussen beide technieken nog sterk vergrootte. In conclusie kan de Mini-FLOTAC techniek het best worden gebruikt wanneer er een accurate diagnose van een lage besmettingsgraad nodig is. In andere gevallen kan de voorkeur worden gegeven aan de snellere McMaster methode.

9 Inleiding De diagnose van infecties met maagdarmnematoden bij mens en dier gebeurt voornamelijk door het microscopisch aantonen van wormeieren in de stoelgang. Voor de microscopische diagnose van maagdarmnematoden worden verschillende technieken aangewend, elk met hun eigen voor- en nadelen. Recent werd een nieuwe techniek, de Mini-FLOTAC, ontwikkeld. Deze techniek is ontstaan uit de eerder ontwikkelde FLOTAC techniek, en is een vereenvoudigde versie hiervan. In deze masterproef zal eerst een overzicht worden gegeven van de courant gebruikte technieken voor microscopische diagnose van maagdarmnematoden bij paarden, runderen, schapen, geiten en de mens. Daarna wordt gefocust op de bestaande literatuur over Mini-FLOTAC. Vervolgens wordt een vergelijking gemaakt tussen de McMaster methode en de Mini-FLOTAC methode op basis van fecesstalen van bovenvermelde diersoorten aangeboden aan de Faculteit Diergeneeskunde te Merelbeke. Deze vergelijking zal zowel gebeuren op vlak van de kwalitatieve en kwantitatieve diagnostische mogelijkheden van beide technieken, als op vlak van de benodigde tijd voor elke techniek. Ten slotte zullen de resultaten van deze vergelijking besproken worden en zullen enkele conclusies worden geformuleerd rond het gebruik van beide technieken. 2

10 Literatuurstudie 1. Huidige gebruikte technieken De technieken die momenteel courant worden gebruikt voor de microscopische diagnose van maagdarmnematoden door het aantonen van eieren in stoelgang of feces zijn: het mestuitstrijkje, Kato-Katz, sedimentatie- en centrifugatie-flotatie, formol-ether concentratie, McMaster, FECPAK, FLOTAC en Mini-FLOTAC. Deze technieken zullen hieronder kort worden besproken. Ook wordt aangehaald of deze technieken kwalitatief (geeft een idee van de aanwezige parasieten) of kwantitatief zijn (geeft het aantal parasieteneieren of -oöcysten per gram feces). In Tabel 1 wordt elke techniek kort samengevat Mestuitstrijkje Bij een mestuitstrijkje wordt een fecesstaal van 1-2 mm 3 gemengd met een druppel water of fysiologische zoutoplossing op een draagglaasje tot een mengsel van ongeveer 1 cm 2 (Fig. 1, 2). Vervolgens wordt er een dekglaasje op gelegd en wordt het bekeken onder de microscoop met een vergroting van 100x (Foreyt, 2001). Fig. 1 : Aanbrengen van een fecesstaal en een zoutoplossing op een draagglaasje. (Bron: T133/fecal%20smear.htm) Fig. 2 : Mengen van het fecesstaal met de zoutoplossing. (Bron: 33/fecal%20smear.htm) Het voordeel van deze techniek is dat het een snelle techniek is die niet veel materiaal vereist. Ook kan tegelijk worden gecontroleerd op zowel infecties met protozoa, nematoden, trematoden als cestoden, waar dit bij andere technieken meestal niet het geval is (Maurelli et al., 2014a). Een groot nadeel van deze techniek is echter de lage sensitiviteit, waardoor met nieuwe technieken meer infecties zullen worden gedetecteerd (Dryden et al., 2005). In een humane studie van Barda et al. (2013a) werd aangetoond dat voor protozoa deze techniek wel evenveel infecties diagnosticeerde als de nieuwere Mini-FLOTAC techniek. Een ander nadeel van deze techniek is dat door ongelijke verdeling van eieren in het staal een fout resultaat kan worden bekomen doordat slechts een heel kleine volume wordt onderzocht en er geen concentratie van de eieren gebeurt (Martin, 1965). 3

11 1.2. Kato-Katz De Kato-Katz techniek wordt in de humane parasitologie vaak aangeraden in regio's waar de middelen om parasitologische onderzoeken uit te voeren beperkt zijn, omdat deze techniek in tegenstelling tot een mestuitstrijkje wel kwantitatief is (Tarafder et al., 2010). Volgens Katz et al. (1972) wordt bij deze techniek een fecesstaal eerst gezeefd en vervolgens wordt een deel van dit staal (/- 155 mm 3 ) via een mal met een opening van een vooraf bepaalde diameter op een draagglaasje gebracht. Hierop wordt dan een dekglaasje, geïmpregneerd met glycerol en malachietgroen, gebracht en dit wordt aangeduwd zodat een dunne laag wordt bekomen. Dan dient een tijdje gewacht te worden tot het staal opklaart en de wormeieren aankleuren, zodat deze geteld kunnen worden. Ten slotte kan het bekomen preparaat onder de microscoop worden afgelezen (Fig. 3). Een demonstratie van de techniek kan worden gevonden op: Fig. 3 : Benodigdheden om de Kato-Katz techniek uit te voeren: 1.fecesstaal; 2.glycerol-malachietgroen; 3.mal om het fecesstaal op het draagglaasje te brengen; 4.afgewerkt preparaat (Aangepast van: De Kato-Katz techniek heeft als voordeel dat ze weinig materiaal behoeft en gemakkelijk is uit te voeren (Katz et al., 1972). Levecke et al. (2011a) vergeleken in hun studie de Kato-Katz techniek met de McMaster techniek voor de diagnose van bodem-overdraagbare nematoden bij de mens. Zij kwamen tot de conclusie dat hoewel met de Kato-Katz techniek meerdere parasietensoorten kunnen worden gedetecteerd (zoals onder andere trematoden) dan met de McMaster techniek, er toch ook enkele nadelen aan deze techniek zijn verbonden. Een eerste nadeel is dat de tijd nodig voor deze techniek langer is dan voor de meeste andere technieken doordat het opklaren van het preparaat vaak redelijk wat tijd vraagt en door de verschillende klaringstijden voor de verschillende parasieten het staal ook meerdere malen moet worden afgelezen. In de praktijk wordt de Kato-Katz vaak echter slechts eenmaal afgelezen om tijd te besparen (Speich et al., 2010). Verder werd in de studie van Levecke et al. (2011a) ook een meer accurate bepaling van de ei-uitscheiding bekomen met de McMaster techniek in vergelijking met Kato-Katz. Dit zou volgens hen opgelost kunnen worden door bij de Kato-Katz techniek in plaats van een constante vermeerderingsfactor voor de bepaling van de EPG (Eieren Per Gram stoelgang), een variabele vermenigvuldigingsfactor te gebruiken op basis van 4

12 het gewicht van het onderzochte staal. Wanneer de Kato-Katz techniek werd vergeleken met de recentere FLOTAC techniek, bleek dat de Kato-Katz techniek zowel goedkoper was als sneller in uitvoering, waardoor deze techniek toch de voorkeur zou kunnen genieten ondanks de theoretisch lagere gevoeligheid (Speich et al., 2010). Tenslotte wordt door Barda et al. (2013b) en Barda et al. (2014) ook vermeld dat het gebruik van gesloten technieken, zoals Mini-FLOTAC, waar er minder contact is van de uitvoerende persoon met de feces, veiliger is met betrekking tot het voorkomen van besmettingen Proefbuis flotatie Sedimentatie-flotatie In het laboratorium voor Parasitologie van de Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent wordt de sedimentatie-flotatie techniek als volgt uitgevoerd: 5 g van een fecesstaal wordt afgewogen in een beker en hieraan wordt 50 ml van een 1% formaline oplossing toegevoegd. Deze suspensie wordt gehomogeniseerd en driemaal gezeefd. Hierna wordt opnieuw 50 ml van een 1% formaline oplossing toegevoegd en blijft de suspensie een kwartier staan om sedimentatie toe te laten. Na deze 15 minuten wordt het supernatans afgegoten en het sediment overgebracht naar een 15 ml proefbuis, welke 2 minuten aan 3000 toeren per minuut wordt gecentrifugeerd. Het supernatans wordt opnieuw afgegoten en een flotatievloeistof naar keuze wordt toegevoegd waarin het sediment opnieuw wordt gesuspendeerd. Vervolgens wordt deze suspensie opnieuw gecentrifugeerd gedurende 2 minuten aan 1500 toeren per minuut. Hierna wordt flotatievloeistof toegevoegd aan de proefbuis tot bovenaan een meniscus wordt gevormd, waarop gedurende 2 minuten een dekglaasje wordt geplaatst. Dit dekglaasje wordt tenslotte op een draagglaasje geplaatst en wordt in het geheel afgelezen onder de microscoop bij een minimale vergroting van 100x. Het grote nadeel van deze techniek is dat door de wachttijd van een kwartier, deze redelijk wat tijd in beslag neemt. Daarom wordt in de meeste publicaties gebruik gemaakt van de centrifugatie-flotatie techniek, welke hieronder uitgebreider wordt besproken Centrifugatie-flotatie Voor het uitvoeren van de centrifugatie-flotatie techniek zijn verschillende protocols beschreven. Algemeen wordt een fecesstaal achtereenvolgens verdund, gehomogeniseerd, gezeefd en in een proefbuisje gebracht, vervolgens wordt het gecentrifugeerd op 3000 toeren per minuut, wordt het supernatans afgegoten en het sediment terug aangevuld met flotatievloeistof, wordt nogmaals gecentrifugeerd op 1500 toeren per minuut en ten slotte gedurende een bepaalde tijd een dekglaasje geplaatst op een meniscus van de vloeistof in het buisje, waarna dit dekglaasje kan worden bekeken onder de microscoop op minimum 100x vergroting (Egwang en Slocombe, 1982). In figuur 4 wordt een voorbeeld gegeven van een centrifugatie-flotatie protocol. 5

13 Fig. 4 : Voorbeeld van een centrifugatie-flotatie protocol (Bron: Volgens sommige studies is het voordeel van deze techniek zijn dat zeer weinig tot geen vals negatieve resultaten voorkomen doordat geen vermeerderingsfactor wordt gebruikt (Egwang en Slocombe, 1982; Mes, 2003; Palmbergen, 2014), anderen beweren net dat lage wormbesmettingen makkelijk kunnen worden gemist met deze techniek (Rinaldi et al., 2011; Maurelli et al., 2014a). Een ander voordeel is dat door gebruik van flotatievloeistoffen met hoge dichtheid ook de zwaardere eieren van trematoden kunnen worden aangetoond (Rinaldi et al., 2011). Nadelen zijn dat centrifugatie noodzakelijk is en dat de techniek hierdoor heel wat tijd in beslag neemt (Palmbergen, 2014) en dat bij grote aantallen wormeieren een correcte aflezing van het bekomen preparaat moeilijk is en vaak een onderschatting van ei-uitscheiding wordt bekomen (Rinaldi et al., 2011) Formol-ether concentratie De kwalitatieve formol-ether concentratie techniek werd voor het eerst beschreven door Ritchie (1948): Aan één gram feces wordt 10 ml 10% formaline toegevoegd om dit fixeren en dit blijft 10 minuten staan. Daarna wordt 3 ml ether toegevoegd om het vet uit het staal te extraheren, wordt een dop op de proefbuis geplaatst en wordt stevig geschud. Dit mengsel wordt 2 minuten gecentrifugeerd op 1000 toeren per minuut waardoor de substanties met verschillende densiteiten worden gescheiden in de proefbuis. Van boven naar onder bevindt zich in de proefbuis na centrifugeren: de ether, fecale vuildeeltjes, formaline en onderaan het sediment (Fig. 5). De vuildeeltjes worden verwijderd, de vloeistof wordt afgegoten en het sediment wordt verzameld, op een draagglaasje gebracht, gekleurd met iodine en microscopisch onderzocht (100x vergroting) op de aanwezigheid van parasieteneieren (nematoden, trematoden, cestoden) of - (oö)cysten. 6

14 Fig. 5 : Voorbeeld van een formol-ether concentratie procedure (Bron: Voordelen van deze techniek zijn dat besmettingen met een groter aantal wormsoorten en protozoa kunnen worden gedetecteerd dan met een mestuitstrijkje bij humane patiënten (Ridley en Hawgood, 1956) en dat ook de zwaardere trematodeneieren kunnen worden aangetoond (Foreyt, 2001). Verder werd in een humane studie van Barda et al. (2013a) aangetoond dat wanneer de infectiegraad hoog is, het aantal gediagnosticeerde wormbesmettingen met formol-ether concentratie gelijkaardig is aan deze gedetecteerd met nieuwere technieken zoals Mini-FLOTAC. Levecke et al. (2009) toonden echter aan dat de formol-ether concentratie techniek minder geschikt is voor het schatten van de eiuitscheiding daar in hun studie met de McMaster en FLOTAC techniek significant hogere FEC's (Fecale Ei-tellingen) werden bekomen. Een ander nadeel van deze techniek is de nood aan dure labuitrusting en chemicaliën in vergelijking met de McMaster techniek, waardoor deze laatste door Levecke et al. (2009) als gebruiksvriendelijker werd beschreven. Belangrijk is ook de ontvlambaarheid van ether, welke steeds een risico met zich meebrengt. Ether kan echter vervangen worden door ethylacetaat (Telemann, 1908) McMaster In de diergeneeskunde wordt voor de diagnose van gastro-intestinale wormbesmettingen vaak gebruik gemaakt van de kwantitatieve McMaster techniek, beschreven door Gordon en Whitlock (1939). Hierbij wordt een bepaalde hoeveelheid van een fecesstaal afgewogen en wordt er een flotatievloeistof aan toegevoegd, dit wordt vervolgens gezeefd en gehomogeniseerd en ten slotte in een McMaster telkamer (Fig. 6) gebracht en afgelezen onder de microscoop (Gordon en Whitlock, 1939). Er zijn verschillende McMaster telkamers op de markt. De detectielimiet is afhankelijk van de gebruikte verdunning, het volume van de telkamer en hoeveel telkamers er worden afgelezen. 7

15 Fig. 6 : Voorbeeld van een gevulde McMaster telkamer, klaar om af te lezen onder de microscoop. Het grote voordeel van de McMaster techniek is dat hij zeer snel kan worden uitgevoerd met weinig materiaal (Gordon en Whitlock, 1939). Ook kunnen verschillende flotatievloeistoffen worden gebruikt, afhankelijk van welke parasieten men wil aantonen (Cringoli et al., 2004). Nadelen vermeld door Gordon en Whitlock (1939) zijn dat zeer donkere feces er soms voor kunnen zorgen dat er niet genoeg licht passeert door het preparaat om dit duidelijk te kunnen aflezen en dat luchtbellen soms verward zouden kunnen worden met wormeieren door onervaren gebruikers. Het belangrijkste nadeel van de McMaster techniek is echter de lage gevoeligheid, meestal 25 EPG of 50 EPG, welke echter vooral van belang is wanneer de besmettingsgraad in een populatie laag is, of bij het uitvoeren van FECR (Fecal Egg Count Reduction) testen (Levecke et al., 2011b; Rinaldi et al., 2014) FECPAK De FECPAK methode is een kwantitatieve techniek, ontwikkeld in Nieuw-Zeeland door Techion Group Ltd., om FEC's (Fecale Ei Tellingen) op de bedrijven zelf uit te kunnen voeren in plaats van in een laboratorium (Fig. 7). De techniek is reeds beschikbaar voor schapen, geiten, rundvee en paarden. Bosco et al. (2014) beschrijven de FECPAK als een grotere versie van de McMaster. Dit onder andere omdat met een groter volume mest wordt gestart en een groter volume van de fecale suspensie wordt onderzocht onder de telkamer in vergelijking met de McMaster techniek. De methode is daardoor gevoeliger dan de McMaster methode (Presland et al., 2005; Bosco et al., 2014). Wanneer 1 telkamer werd afgelezen, werd door Bosco et al. (2014) een gevoeligheid van 7.1 EPG voor FECPAK en van 20 EPG voor McMaster bekomen. Vooral bij paarden werd door Presland et al. (2005) deze techniek aangeraden in plaats van de McMaster. Door de grotere hoeveelheid feces die gebruikt worden om het te onderzoeken staal samen te stellen en het grondig mengen hiervan, is er volgens hen minder kans op het missen of onderschatten van wormbesmettingen door de ongelijke verdeling van wormeieren in paardenfeces. Recent werd door Techion Group Ltd. de FECPAK G2 ontwikkeld, welke een verbeterde versie is van de originele FECPAK. Deze versie wordt momenteel getest in het Verenigd Koninkrijk. 8

16 Fig. 7 : FECPAK-kit (Bron: PAK%20DLE%20Brochure%20Website.pdf) 1.7. FLOTAC De kwantitatieve FLOTAC techniek is ontwikkeld en beschreven door Cringoli et al. (2010). Het is een zeer gevoelige techniek, met een detectielimiet van 1 ei per gram feces (EPG). De techniek bestaat uit het verdunnen, homogeniseren en zeven van een fecesstaal, vervolgens centrifugatie (170 g) voor 3 minuten en toevoegen van een flotatievloeistof, daarna wordt het zo bekomen staal in het FLOTAC systeem (Fig. 8) gebracht, waar het nogmaals 5 minuten gecentrifugeerd wordt (120 g) en ten slotte kan worden afgelezen onder de microscoop (Cringoli et al., 2010). Er werden door Cringoli et al. (2010) ook andere uitvoeringswijzen van de techniek beschreven, elk toegepast op specifieke problemen. Zo kan één staal simultaan met twee verschillende flotatievloeistoffen getest worden. Dit kan handig zijn om tegelijk te testen voor verschillende parasietensoorten. Verder kunnen ook twee stalen tegelijk worden getest met gebruik van slechts één FLOTAC systeem. (Cringoli et al., 2010) Fig. 8 : De verschillende onderdelen van het FLOTAC-systeem (Bron: Cringoli et al. 2010) 9

17 Het grote voordeel van de FLOTAC techniek is de hoge gevoeligheid van 1 EPG, welke het mogelijk maakt ook zeer lage wormbesmettingen accuraat te diagnosticeren (Levecke et al., 2009; Cringoli et al., 2010; Speich et al., 2010). Een belangrijk nadeel van de FLOTAC techniek is dat centrifugatie nodig is, wat niet in elk laboratorium kan worden uitgevoerd (Cringoli et al., 2010). Wanneer centrifugatie wel mogelijk is, toonden verschillende studies waarin een vergelijking tussen verschillende technieken werd gemaakt, aan dat FLOTAC de techniek is die de voorkeur moet krijgen wanneer men een zo correct mogelijke schatting van de ei-uitscheiding wil bekomen, omdat deze techniek een zeer hoge gevoeligheid heeft (Bosco et al., 2014; Maurelli et al., 2014a). Dit wil echter niet zeggen dat wanneer de mogelijkheden om de FLOTAC techniek uit te voeren aanwezig zijn, deze steeds de voorkeur geniet tegenover andere technieken. Zo toonde Levecke et al. (2009) in een vergelijkende studie tussen verschillende microscopische technieken voor de diagnose van Trichuris trichiura bij niet-mensapen aan dat deze techniek zowel de meest tijdrovende is als de meest arbeidsintensieve. Vooral in vergelijking met de eenvoudige McMaster techniek was dit verschil zeer uitgesproken. Zij concludeerden dan ook dat de McMaster techniek de meest aangewezen was in hun studie daar met de lagere gevoeligheid van de McMaster techniek toch betrouwbare resultaten werden bekomen in een veel kortere tijd. Speich et al. (2010) vergeleken de FLOTAC techniek met de Kato-Katz techniek op basis van kost en tijdsduur van uitvoering en concludeerden hieruit, zoals eerder vermeld dat de FLOTAC zowel duurder was als meer tijdrovend dan de Kato-Katz techniek. Een laatste belangrijk aspect van de FLOTAC techniek is dat volgens Cringoli et al. (2010) ook voldoende aandacht moet besteed worden aan de keuze van flotatievloeistof in functie van de te diagnosticeren parasieten, zoals bij elke flotatie gebaseerde techniek. Zo kan best voor elke parasiet bij elke diersoort afzonderlijk onderzocht worden welke flotatievloeistof de beste resultaten geeft. Flotatievloeistoffen met hetzelfde soortelijk gewicht geven namelijk niet altijd dezelfde resultaten. Cringoli et al. (2010) verklaren dit doordat parasieteneieren niet inert zijn. Zij stellen dat ze kunnen reageren met bepaalde stoffen in een flotatievloeistof waardoor ze beter of juist minder goed zullen bovendrijven. Naast de verschillende samenstelling van flotatievloeistoffen met hetzelfde soortelijk gewicht spelen volgens hen ook andere factoren een rol. Zo kunnen resultaten met betrekking tot gebruik van een bepaalde flotatievloeistof voor een bepaalde parasiet in een bepaalde diagnostische techniek, niet zomaar overgenomen worden voor het gebruik in andere diagnostische technieken. Ook de bewaring van de stalen is een factor waarmee rekening dient gehouden te worden aangezien met verse stalen andere resultaten worden bekomen dan met stalen welke op verschillende wijzen bewaard werden. Een laatste factor die volgens Cringoli et al. (2010) een invloed zou kunnen hebben op de resultaten is het dieet van het dier waarvan het staal afkomstig is. 10

18 Tabel 1. Samenvatting van de verschillende gebruikte technieken voor microscopische diagnose van maagdarmparasieten door bepaling van eiuitscheiding Techniek Mestuitstrijkje Kato-Katz Sedimentatie/centrifugatie -flotatie Formol-ether concentratie McMaster FECPAK FLOTAC Mini-FLOTAC Kwantitatief - - Snel Uitgebreide laboapparatuur noodzakelijk Arbeidsintensief Verschillende flotatievloeistoffen Trematoden aantoonbaar - - Hoge gevoeligheid

19 2. Onderzoek rond Mini-FLOTAC 2.1. Wat is Mini-FLOTAC? Mini-FLOTAC is een recent ontwikkelde kwantitatieve techniek voor de microscopische diagnose van maagdarm-parasieten, afgeleid van de FLOTAC techniek. Het is aangepast om sneller en in minder uitgeruste laboratoria uitgevoerd te kunnen worden. Zo is onder andere geen centrifugatie nodig (Cringoli et al., 2013). De Mini-FLOTAC techniek wordt uitgevoerd met behulp van twee aangepaste materialen, de fill-flotac (optioneel) en de Mini-FLOTAC (Fig. 9) (Barda et al., 2013a). De fill- FLOTAC kan gebruikt worden om het staal te homogeniseren, filteren en om de Mini-FLOTAC te vullen en bestaat uit een beker, een staafje om de inhoud te homogeniseren en waarin eveneens het staal kan worden aangebracht, een filter en een opening waarop een plastic tip kan worden gezet om de Mini-FLOTAC te vullen (Barda et al., 2013). De Mini-FLOTAC bestaat uit een basis, een afleesdisk en een sleutel (Fig. 10 en 11) waarmee beiden ten opzichte van elkaar kunnen worden geroteerd (Barda et al., 2013). Fig. 10 : Links: basis; Rechts: afleesdisk (Bron: PZvfxI) Fig. 9 : Fill-FLOTAC en Mini-FLOTAC (Bron: Barda et al. 2013a) Fig. 11 : Sleutel 2.2. Vergelijking met andere technieken De vergelijking van Mini-FLOTAC met andere technieken voor de diagnose van besmettingen met gastro-intestinale parasieten is initieel vooral gebeurd bij de mens. Recent worden er ook meer studies gepubliceerd waarin toepassingen voor diergeneeskundig gebruik worden geformuleerd. 12

20 Humaan Uit een vergelijkend onderzoek van Barda et al. (2014) tussen de McMaster, Mini-FLOTAC en Kato- Katz methode bleek dat McMaster de snelste methode was zowel in het voorbereiden van het preparaat als in het aflezen ervan. Zowel de McMaster techniek als de Kato-Katz techniek hadden echter een lagere sensitiviteit voor Hymenolepsis nana (een cestode), welke de meest voorkomende parasiet was in deze studie, en Ascaris lumbricoides, welke de tweede hoogste prevalentie had, dan de Mini-FLOTAC techniek. Ook Barda et al. (2013b) en Nikolay et al. (2014) vergeleken de Mini-FLOTAC techniek met de Kato- Katz techniek. Zij kwamen tot de conclusie dat Mini-FLOTAC even gevoelig was voor de diagnose van haakwormen (Barda et al., 2013b; Nikolay et al., 2014), Schistosoma mansoni (een trematode) (Barda et al., 2013b), Ascaris lumbricoides (Nikolay et al., 2014) en Trichuris trichiura (Nikolay et al., 2014) als de frequent gebruikte Kato-Katz techniek. Voor haakwormen en Schistosoma mansoni bleek uit een studie van Barda et al. (2013a) wel dat Mini-FLOTAC significant gevoeliger was voor de diagnose dan de formol-ether concentratie en het stoelganguitstrijkje. Voor protozoaire infecties bleek echter volgens Barda et al. (2013a) dat de formol-ether concentratie techniek geschikter zou zijn dan Mini- FLOTAC, daar deze meer infecties wist te detecteren in deze studie. Ook een stoelganguitstrijkje leverde hier meer positieve resultaten op dan de Mini-FLOTAC. De sensitiviteit voor protozoa was in deze studie: formol-ether concentratie: 88%; stoelganguitstrijkje: 70%; Mini-FLOTAC: 68% (Barda et al., 2013a) Diergeneeskunde Een overzicht van de reeds uitgevoerde studies bij dieren wordt gegeven in Tabel 2. Kleine huisdieren Bij de hond zijn reeds verschillende studies gebeurd omtrent het gebruik van de Mini-FLOTAC techniek. Zo toonden Maurelli et al. (2014a) aan dat voor Toxocara canis, haakwormen en Trichuris vulpis met de Mini-FLOTAC en FLOTAC techniek een hoger aantal positieve stalen en een gemiddeld hogere EPG werd bekomen dan met een mestuitstrijkje, centrifugatie-flotatie en ether-formol concentratie techniek. Zij zien de Mini-FLOTAC dan ook als een veelbelovende techniek, met als voordeel tegenover de FLOTAC techniek dat geen centrifugatiestap nodig is. Ook Palmbergen (2013) concludeerde dat, hoewel sedimentatie-flotatie door middel van centrifugatie de meeste wormbesmettingen detecteerde, de Mini-FLOTAC een volwaardig alternatief is voor de diagnose van T. canis wanneer geen centrifuge voorhanden is. Dit vooral omdat de bekomen eitellingen in deze studie niet sterk verschilden van die van de sedimentatie-flotatie techniek. Verder werd bij de hond ook een toepassing van de Mini-FLOTAC beschreven voor de diagnose van Capillaria plica in urinestalen door Maurelli et al. (2014b). 13

21 Een toepassing van de Mini-FLOTAC bij de kat is beschreven door Djokic et al. (2014). Zij vonden dat voor de diagnose van Toxoplasma gondii uit fecesstalen van katten, de Mini-FLOTAC significant gevoeliger was dan de traditioneel gebruikte methode om T. gondii te diagnosticeren, dewelke gebruik maakt van cel telplaten. Dit, in combinatie met de eenvoudigheid van uitvoeren, maakt voor hen de Mini-FLOTAC de aangewezen techniek om kattenfeces te screenen voor T. gondii. Herkauwers Bij schapen toonden Rinaldi et al. (2014) aan dat de Mini-FLOTAC techniek, met een detectielimiet van 10 EPG, gevoeliger is om infecties met gastro-intestinale strongyliden op te sporen dan de McMaster methode, met een detectielimiet van 15 EPG en 50 EPG. Deze hogere gevoeligheid werd vooral vastgesteld bij lage besmettingen, welke vaak door de McMaster werden gemist. De bekomen EPG's in deze studie waren wel gelijkaardig voor beide technieken. Een zelfde conclusie werd getrokken door Godber et al. (2015). Ook zij zagen, wanneer ze de FECPAK techniek met een detectielimiet van 30 EPG vergeleken met de Mini-FLOTAC techniek met een detectielimiet van 5 EPG, dat de FECPAK techniek vooral bij lage wormbesmettingen een onderschatting geeft van de eiuitscheiding. Ook de precisie van de bekomen resultaten lag in hun studie lager voor de FECPAK techniek dan voor de Mini-FLOTAC techniek. Voor geiten werd door Silva et al. (2013) vastgesteld dat Mini-FLOTAC een veelbelovende methode is voor de diagnose van Eimeria spp. infecties. Zij vonden hiermee namelijk een significant hogere oöcysten-uitscheiding in de verschillende fecesstalen in vergelijking met de McMaster methode. Tabel 2. Overzicht vergelijkende studies met Mini-FLOTAC bij de verschillende diersoorten Studie Diersoort - Staal Onderzochte parasieten Technieken waarmee Mini- FLOTAC werd vergeleken Maurelli et al., 2014a Hond - feces - Toxocara canis - haakwormen - Trichuris vulpis - mestuitstrijkje - sedimentatie-flotatie - ether-formol concentratie - FLOTAC Palmbergen, 2013 Hond - feces - Toxocara canis -sedimentatie-flotatie Maurelli et al., 2014b Hond - urine - Capillaria plica - urine sedimentatie Djokic et al., 2014 Kat - feces - Toxoplasma gondii - cel telplaten Rinaldi et al., 2014 Schaap - feces - Gastro-intestinale - McMaster strongyliden Godber et al., 2015 Schaap - feces - Gastro-intestinale -FECPAK nematoden Silva et al., 2013 Geit - feces - Eimeria spp. - McMaster 14

22 Objectieven De objectieven van deze masterproef zijn om de Mini-FLOTAC techniek te vergelijken met de McMaster techniek. Een eerste vergelijking gebeurt op basis van de sensitiviteit van beide technieken voor de diagnose van gastro-intestinale parasieten bij paard, rund, schaap en geit, welke een indicatie geeft van de kwalitatieve diagnostische mogelijkheden. Ook wordt de correlatie tussen beide technieken bepaald wat betreft het schatten van de ei-uitscheiding. Dit geeft een indicatie over de kwantitatieve diagnostische eigenschappen van beide technieken. Een tweede vergelijking gebeurt op basis van de benodigde tijdsduur voor beide technieken. Ten slotte zullen de kosten en baten van beide technieken tegen elkaar worden afgewogen om zo een aanbeveling tot gebruik van beide technieken te kunnen formuleren. 15

23 Materialen en methoden 1. Fecesstalen De in deze studie gebruikte fecesstalen waren aangeboden aan het laboratorium Parasitologie van de Faculteit Diergeneeskunde te Merelbeke voor parasitair coprologisch onderzoek. Op elk staal werd zowel de McMaster als de Mini-FLOTAC techniek uitgevoerd om de EPG te bepalen. Ook werd telkens de tijdsduur nodig voor deze technieken bepaald. In totaal werden 100 fecesstalen onderzocht waarvan 78 paardenstalen, 11 runderstalen, 5 geitenstalen en 6 schapenstalen. 2. McMaster 2.1. Bepaling van de besmettingsgraad Voor de McMaster methode werd van het te onderzoeken fecesstaal 4g afgewogen, vervolgens werd 60 ml verzadigde zoutoplossing met een samenstelling van 333 g NaCl en 200 g sucrose in 1 liter aqua dest. toegevoegd (specifieke densiteit 1,24). Na homogeniseren werd 3 maal gezeefd door een theezeef, waarna het resterend materiaal in de zeef werd verwijderd. Het zo bekomen filtraat werd vervolgens 10 maal overgegoten van de ene beker in de andere om de wormeieren in de suspensie te homogeniseren. Hierna werd één kant van een McMaster telkamer gevuld met de bekomen suspensie met behulp van een pasteurpipet. Na nogmaals 10 maal overgieten werd vervolgens de tweede kant van de McMaster telkamer gevuld met de bekomen suspensie. Na 2 minuten werd de telkamer bekeken onder de microscoop op een vergroting van 100x, waar het aantal wormeieren onder de 2 roosters van de telkamer werden geteld, dit is een volume van 2 maal 0,15 ml. Het aantal wormeieren per gram feces (EPG) werd bekomen door het getelde aantal eieren te vermenigvuldigen met 50. Deze vermenigvuldigingsfactor werd als volgt bekomen: 4 g feces verdund met 60 ml vloeistof = 0,067 g feces per ml suspensie; 2 x 0,15 ml suspensie wordt onderzocht = 0,3 ml; 0,067 g/ml x 0.3 ml = 0.02 g feces dat wordt onderzocht; om het aantal eieren uit de onderzochte hoeveelheid om te zetten naar het aantal eieren per gram (EPG) moet het getelde aantal eieren dus vermenigvuldigd worden met 50. (Tabel 3) 2.2. Tijdsduur bepaling Voor het bepalen van de totale tijdsduur van de McMaster procedure werd deze onderverdeeld in 5 tijdsblokken. Een eerste tijd werd gemeten voor de duur van het afwegen en labelen van het staal. Een tweede voor het toevoegen van de verzadigde zoutoplossing, homogeniseren en zeven van het staal en vullen van de McMaster telkamer. Het derde tijdsblok bedroeg telkens 2 minuten daar dit de tijd was tussen vullen en bekijken van het staal. De vierde tijd was deze nodig voor het tellen van het aantal wormeieren onder de microscoop bij een 100x vergroting. De vijfde tijdsmeting tenslotte was deze voor het afwassen van de gebruikte materialen. (Tabel 3) 16

24 Tabel 3. Overzicht van de uitgevoerde McMaster techniek Stap Handeling Tijdsblok 1 Afwegen staal 1 2 Toevoegen zoutoplossing, homogeniseren en zeven 3 10x overgieten 4 Vullen eerste kant McMaster telkamer x overgieten, 6 Vullen tweede kant McMaster telkamer 7 2 minuten wachten 3 8 Aflezen staal onder microscoop 4 9 Afwassen benodigdheden 5 3. Mini-FLOTAC 3.1. Bepaling van de besmettingsgraad Voor het uitvoeren van de Mini-FLOTAC werd 5 g van het te onderzoeken fecesstaal afgewogen in de beker van de fill-flotac. Hieraan werd vervolgens 45 ml verzadigde zoutoplossing met een samenstelling van 333 g NaCl en 200 g sucrose in 1 liter aqua dest. toegevoegd (specifieke densiteit 1,24). De fill-flotac werd gesloten en de inhoud grondig gehomogeniseerd met behulp van het in het deksel aanwezige mengstaafje. De verschillende onderdelen van de Mini-FLOTAC werden in elkaar gezet en het geheel werd onder een schuine hoek geplaatst om het vullen te vergemakkelijken. Vervolgens werden beide kamers van de Mini-FLOTAC gevuld na voor elke kamer 10 mengbewegingen met de fill-flotac te hebben gemaakt. Het vullen gebeurde met behulp van een plastic tip waarvan de punt was afgeknipt die op de fill-flotac geplaatst werd. Er werd steeds gezorgd dat een meniscus op de vulopening van beide kamers aanwezig was om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Na 10 minuten werd de Mini-FLOTAC met behulp van de sleutel gedraaid zodat deze kon worden afgelezen. Dit gebeurde onder de lichtmicroscoop onder een vergroting van 100x, waarbij telkens beide kamers werden afgelezen. De EPG-waarde werd bekomen door het aantal getelde wormeieren in beide kamers te vermenigvuldigen met 5. Deze vermenigvuldigingsfactor werd als volgt bekomen: 5 g feces verdund met 45 ml vloeistof = 0,1 g feces per ml suspensie; 2 x 1 ml suspensie wordt onderzocht = 2 ml; 0,1 g/ml x 2 ml = 0.2 g feces dat wordt onderzocht; om het aantal eieren uit de onderzochte hoeveelheid om te zetten naar het aantal eieren per gram (EPG) moet het getelde aantal eieren dus vermenigvuldigd worden met 5. (Tabel 4) 3.2. Tijdsduur bepaling Voor de bepaling van de tijdsduur van de Mini-FLOTAC procedure werd deze onderverdeeld in 6 tijdsblokken: een eerste tijdsblok voor de duur van afwegen en labelen van het staal, een tweede voor het toevoegen van verzadigde zoutoplossing, homogeniseren van het staal en vullen van de Mini- FLOTAC. De derde tijdsblok bedroeg telkens 10 minuten daar dit de tijd is die werd gewacht tussen 17

25 het voorbereiden en het aflezen van het staal. De vierde was de tijd nodig voor het eventuele bijvullen van de Mini-FLOTAC en het draaien met behulp van de sleutel. De vijfde bedroeg de tijd nodig voor het aflezen van beide kamers van de Mini-FLOTAC onder de microscoop met een 100x vergroting. De zesde tenslotte was de tijd nodig voor afwassen van de gebruikte materialen. (Tabel 4) Tabel 4. Overzicht van de uitgevoerde Mini-FLOTAC techniek Stap Handeling Tijdsblok 1 Afwegen staal 1 2 Toevoegen zoutoplossing en homogeniseren van het staal 3 10 mengbewegingen 4 Vullen eerste kamer van de Mini-FLOTAC mengbewegingen 6 Vullen tweede kamer van de Mini-FLOTAC 7 10 minuten wachten 3 8 Draaien van de Mini-FLOTAC met behulp van de sleutel 4 9 Aflezen van het staal onder de microscoop 5 10 Afwassen van benodigde materialen 6 4. Statistische analyse Alle statistische berekeningen werden uitgevoerd in Microsoft Excel en SPSS Statistics Diagnostiek: kwalitatief Alle 100 stalen werden met behulp van beide technieken onderzocht op Strongyliden. Er werden 56 positieve resultaten bekomen, dit resultaat werd in verdere berekeningen gebruikt als gouden standaard. Van deze 56 positieve stalen konden er 55 gediagnosticeerd worden met behulp van Mini- FLOTAC en 46 met behulp van McMaster. De 78 paardenstalen werden met behulp van beide technieken onderzocht voor Parascaris equorum. Hier werden 5 positieve resultaten bekomen. Dit resultaat werd in verdere berekeningen gebruikt als gouden standaard. Van deze 5 positieve stalen konden er 5 gediagnosticeerd worden met behulp van Mini-FLOTAC en 4 met behulp van McMaster. Deze 78 paardenstalen werden met behulp van beide technieken ook onderzocht voor Anoplocephala perfoliata. Hier werden 3 positieve resultaten bekomen. Dit resultaat werd in verdere berekeningen gebruikt als gouden standaard. Van deze 3 positieve stalen konden er 3 gediagnosticeerd worden met behulp van Mini-FLOTAC en 2 met behulp van McMaster. De 6 schapenstalen werden met behulp van beide technieken onderzocht voor Trichuris ovis. Hier werden 2 positieve resultaten bekomen. Dit resultaat werd in verdere berekeningen gebruikt als 18

26 gouden standaard. Van deze 2 positieve stalen konden er 2 gediagnosticeerd worden met behulp van Mini-FLOTAC en 1 met behulp van McMaster. De 22 schapen-, geiten- en runderstalen werden met behulp van beide technieken onderzocht voor Eimeria spp. Hier werden 6 positieve resultaten bekomen. Dit resultaat werd in verdere berekeningen gebruikt als gouden standaard. Deze 6 positieve stalen werden zowel met de Mini-FLOTAC techniek als met McMaster techniek gediagnosticeerd. Deze 22 schapen-, geiten- en runderstalen werden met behulp van beide technieken ook onderzocht voor Nematodirus spp. Hier werden 2 positieve resultaten bekomen. Dit resultaat werd in verdere berekeningen gebruikt als gouden standaard. Van deze 2 positieve stalen konden er 2 gediagnosticeerd worden met behulp van Mini-FLOTAC en 1 met behulp van McMaster. Voor alle 100 stalen werd tenslotte de verhouding van het aantal vals negatieve resultaten met de McMaster techniek tot de bekomen EPG met de Mini-FLOTAC techniek berekend Diagnostiek: kwantitatief Om de kwantitatieve diagnostische eigenschappen van beide technieken te vergelijken werd de correlatie tussen beide bepaald door middel van een tweezijdige Pearson correlatie met een significantieniveau van 0,01. Hiervoor werd voor alle stalen de totale EPG bekomen met de McMaster techniek en de totale EPG bekomen met de Mini-FLOTAC techniek voor eenzelfde staal met elkaar vergeleken Tijd Om de tijd nodig voor beide technieken te vergelijken werd voor elke stap in de uitvoering van de technieken de gemiddelde tijd hiervoor nodig bepaald en de bijhorende standaardfout. Voor deze gemiddelden werd vervolgens gekeken of ze significant van elkaar verschilden door middel van een tweezijdige gepaarde T-test met een significantieniveau van 0,05. De tijd voor aflezen van beide technieken werd vervolgens nog uitgebreider onderzocht door deze voor beide technieken uit te zetten in verhouding met de EPG van elke staal Kostenbaten analyse Voor het maken van een kostenbaten analyse werd de extra tijd nodig voor het uitvoeren van een techniek per extra positief staal dat deze opleverde onderzocht. Ook werd voor een combinatie van beide technieken berekend of hierdoor tijd kon worden bespaard terwijl toch een zo groot mogelijk aantal positieve stalen kon worden gediagnosticeerd. 19

27 Resultaten 1. Besmettingsgraad In Tabel 5 wordt een overzicht gegeven van het aantal positieve stalen per onderzochte parasiet en per diersoort. De parasieten onderzocht in deze masterproef zijn: Strongilyden spp., Parascaris equorum, Anoplocephala perfoliata, Trichuris ovis, Eimeria spp. en Nematodirus spp. (Fig. 12). Tabel 5. Aantal positieve stalen per parasiet en per diersoort Strongilyden spp. Parascaris equorum Anoplocephala perfoliata Trichuris ovis Eimeria spp. Nematodirus spp. Paard 44/78 5/78 3/78 Rund 4/11 3/11 2/11 Geit 5/5 1/5 1/5 Schaap 3/6 2/6 1/6 0/6 20

28 Fig. 12 : Overzicht van de verschillende parasieteneieren/-oöcysten onder de microscoop. Linksboven: Strongilyden spp.; Rechtsboven: Parascaris equorum (Bron: Links midden: Anoplocephala perfoliata (Bron: Rechts midden: Pijl: Trichuris ovis (Bron: Linksonder: Eimeria spp. (Bron: Rechtsonder: Nematodirus spp. (Bron: 21

29 2. Vergelijking Mini-FLOTAC en McMaster In dit onderdeel zullen de Mini-FLOTAC en McMaster techniek met elkaar worden vergeleken over de verschillende diersoorten heen. Er gebeurt zowel een vergelijking op basis van kwalitatieve en kwantitatieve diagnostiek, als op basis van de tijd nodig voor beide technieken. Ten slotte zal er een kostenbaten analyse worden gemaakt om de voor en nadelen van beide technieken tegenover elkaar af te kunnen wegen Diagnostiek: kwalitatief Eerst werd gekeken naar de mogelijkheid om parasitisme met elke onderzochte parasiet te detecteren met elk van beide technieken. Hiervoor werd telkens de gevoeligheid van beide technieken voor de diagnose van elke parasiet bepaald (Tabel 6). Tabel 6. Overzicht van de gevoeligheden van beide technieken voor de onderzochte parasieten Parasiet Strongyliden Parascaris equorum Anoplocephala perfoliata Trichuris ovis Eimeria spp. Nematodirus spp. Aantal onderzochte stalen Gevoeligheid Mini- FLOTAC Gevoeligheid McMaster % 82% % 80% % 67% 6 100% 50% % 100% % 50% Uit Tabel 6 hierboven blijkt dat de gevoeligheid van de Mini-FLOTAC, met uitzondering van Eimeria spp., steeds hoger ligt dan deze van de McMaster. Uit Tabel 7 blijkt dat dit verschil in gevoeligheid afhankelijk is van de grootte van de besmetting van het staal. In deze tabel wordt het aantal vals negatieve stalen bekomen met de McMaster techniek vergeleken met de aanwezige besmettingsgraad, uitgedrukt in EPG (Eieren Per Gram feces), zoals bepaald met de Mini-FLOTAC techniek. Hieruit blijkt dat hoe hoger de EPG in een staal is, hoe minder kans er bestaat op het bekomen van een vals negatief resultaat met de McMaster techniek. Zo worden voor besmettingen van minder dan 55 EPG tot 50% vals negatieve resultaten bekomen met de McMaster techniek. Vanaf een besmetting van meer dan 150 EPG werden in deze masterproef geen vals negatieve resultaten met de McMaster techniek meer vastgesteld. 22

30 Tabel 7. Verhouding van het aantal vals negatieve resultaten met McMaster tot de EPG bekomen met Mini-FLOTAC. EPG Mini-FLOTAC > McMaster Diagnostiek: kwantitatief Wanneer voor elk staal de totale EPG bekomen met de Mini-FLOTAC en McMaster techniek met elkaar werden vergeleken, werd een correlatie van 98,8% bekomen (Fig. 13). De EPG die in deze masterproef werd bekomen met behulp van beide technieken is dus zeer vergelijkbaar. Een gepaarde T-test uitgevoerd op dezelfde totale EPG voor beide technieken toonde een gemiddeld verschil van 18 EPG aan tussen beide technieken met een standaardfout van /- 12,71 EPG. Het 95% betrouwbaarheidsinterval bedroeg [-7,22 EPG tot 43,22 EPG], waaruit blijkt dat er geen significant verschil is tussen beide technieken in bekomen EPG waarden, daar 0 vervat zit in dit betrouwbaarheidsinterval. Fig. 13 : Spreidingsdiagram met trendlijn. X-as: Totale EPG bekomen met McMaster Y-as: Totale EPG bekomen met Mini-FLOTAC 23

31 2.3 Tijd Als eerste werd de gemiddelde tijdsduur nodig voor elke stap bij de McMaster en Mini-FLOTAC techniek met elkaar vergeleken, alsook de totale tijd nodig voor beide technieken (Tabel 8). Voor het wegen werd zoals verwacht geen significant verschil gevonden tussen beide technieken (95% betrouwbaarheidsinterval [-7,84s tot 0,08s]), daar dit voor beide technieken op dezelfde manier gebeurde. Het klaarmaken van het staal voor aflezen hield voor McMaster in: het verdunnen, homogeniseren en zeven van het staal en het vullen van de McMaster telkamer (Tabel 3). Voor Mini- FLOTAC was dit: het verdunnen en homogeniseren van het staal en het vullen en draaien van de Mini-FLOTAC (Tabel 4). Voor dit klaarmaken van het staal werd wel een significant verschil in tijdsduur gevonden tussen McMaster en Mini-FLOTAC (95% betrouwbaarheidsinterval [34,88s tot 45,04s]). Ook voor het aflezen van het staal (alle stalen; 95% betrouwbaarheidsinterval [-453,22s tot - 334,22s]) en voor het afwassen van het staal (95% betrouwbaarheidsinterval [-54,55s tot -47,03s]) werd een significant verschil tussen beide technieken gevonden. De totale tijdsduur nodig voor beide technieken tenslotte, was ook significant verschillend (95% betrouwbaarheidsinterval [-468,41s tot - 348,45s]). Tabel 8. Gemiddelden met standaardfout van de tijd nodig voor elke stap bij beide technieken McMaster Mini-FLOTAC Wegen 0 min 44 s /- 1,91 s 0 min 48 s /- 1,85 s Klaarmaken 3 min 04 s /- 2,88 s 2 min 24 s /- 2,53 s Aflezen (alle stalen) 2 min 10 s /- 9,02 s 8 min 44 s /- 33,68 s Aflezen (negatieve stalen) 1 min 44 s /- 5,65 s 5 min 35 s /- 15,97 s Aflezen (positieve stalen) 2 min 36 s /- 16,11 s 10 min 40 s /- 47,89 s Afwassen 0 min 37 s /- 1,43 s 1 min 28 s /- 2,32 s Totaal 6 min 35 s /- 12,06 s 13 min 24 s /- 36,31 s Vervolgens werd gekeken naar de tijd die nodig is voor het aflezen van beide technieken in verhouding tot de totale EPG OPG van elk staal (Fig. 14). Hieruit blijkt dat de Mini-FLOTAC techniek steeds meer tijd vergt dan de McMaster techniek. Dit verschil in tijdsduur tussen beide technieken is reeds aanwezig vanaf een negatief staal en wordt ook steeds groter naarmate de totale EPG of OPG van een staal groter wordt. 24

32 Fig. 14 : Tijd nodig voor het aflezen van een staal in verhouding tot de totale EPG OPG. X-as: Bekomen EPG of OPG; Y-as: Tijd nodig voor aflezen van het staal in seconden; Groen: waarden Mini-FLOTAC trendlijn; Blauw: waarden McMaster trendlijn 2.4. Kostenbaten analyse Hierboven werden zowel de diagnostische mogelijkheden van beide technieken onderzocht als tijdsduur die nodig is voor het uitvoeren ervan. Hieruit bleek dat de Mini-FLOTAC techniek betere resultaten haalde op het vlak van aantal gediagnosticeerde besmettingen tegenover de McMaster techniek. Deze McMaster techniek bleek aan de andere kant dan weer significant sneller te zijn in uitvoering dan de Mini-FLOTAC techniek. Om deze twee aspecten met elkaar te kunnen vergelijken zal een kostenbaten analyse worden gemaakt. In Tabel 8 wordt een overzicht gegeven van enkele parameters die belangrijk zijn om in beschouwing te nemen in deze analyse. 25

33 Tabel 9. Gebruikte parameters in kostenbaten analyse McMaster Mini-FLOTAC Verschil Aantal positieve stalen 51/100 62/100 11/100 Totale tijd nodig voor analyse van alle 100 stalen 10 h 58 min 52 s 22 h 19 min 35 s 11 h 20 min 43 s Totale tijd nodig voor aflezen van alle 100 stalen 3 h 37 min 26 s 14 h 33 min 38 s 10 h 56 min 12 s Totale tijd nodig voor analyse van alle 100 stalen zonder aflezen 7 h 21 min 26 s 7 h 45 min 57 s 24 min 31 s Gemiddelde tijd nodig voor analyse van 1 staal 6 min 35 s 13 min 24 s 6 min 49 s Gemiddelde tijd nodig voor aflezen van 1 staal 2 min 10 s 8 min 44 s 6 min 34 s Gemiddelde tijd nodig voor analyse van 1 staal zonder aflezen 4 min 25 s 4 min 40 s 15 s Uit Tabel 9 blijkt dat de verschillen in tijdsduur tussen beide technieken, wanneer men het aflezen buiten beschouwing laat, zeer klein zijn. Zo duurt dit voor één staal gemiddeld slechts 15 seconden langer voor Mini-FLOTAC dan voor McMaster. Toch is dit verschil significant (95% betrouwbaarheidsinterval [7,27 s tot 22,15 s]. De verschillen in tijd van aflezen zijn daarentegen veel groter en zijn ook significant, zoals hoger vermeld. Omdat beide onderdelen van de technieken een significant tijdsverschil hebben zal in de kostenbaten analyse gebruikt worden gemaakt van de totale tijd nodig voor elke techniek, in plaats van enkel te kijken naar de tijd nodig voor het aflezen. Het eigenlijke doel van deze kostenbaten analyse is dus te kijken hoeveel extra tijd nodig is voor het uitvoeren van de Mini-FLOTAC techniek om één extra positief staal te kunnen diagnosticeren in vergelijking met de McMaster techniek. Uit Tabel 8 blijkt dat om 11 extra positieve stalen te diagnosticeren met de Mini-FLOTAC techniek er 11 h, 20 min en 43 s extra tijd nodig was in vergelijking met de McMaster techniek. Wanneer dit wordt omgezet naar de extra tijd nodig om één extra positief staal te diagnosticeren met de Mini-FLOTAC techniek, bedraagt deze 1 h, 1 min en 53 s. Anders bekeken heb je 11% meer kans om een positief staal te diagnosticeren wanneer je de Mini- FLOTAC techniek gebruikt, welke gemiddeld 6 min en 40 s langer duurt per staal dan de McMaster techniek. Een andere mogelijke methode is om in plaats van alle stalen met één van beide technieken te onderzoeken, een combinatie van beide technieken te gebruiken. Hierbij zouden eerst alle stalen kunnen onderzocht worden met de McMaster techniek waarbij vervolgens de stalen met een negatief resultaat opnieuw worden onderzocht met de Mini-FLOTAC techniek (Fig. 15). De benodigde tijd hiervoor, wanneer deze methode zou worden toegepast op de 100 onderzochte stalen in deze 26

34 masterproef, alsook de tijd nodig om alle stalen met slechts één van beide technieken te onderzoeken wordt weergegeven in Tabel 10. Fecesstaal McMaster techniek Positief EPG van staal gekend Negatief Mini-FLOTAC techniek Positief EPG van staal gekend Negatief Staal wordt beschouwd als negatief Fig. 15 : Schema voor het gebruik van een combinatie van beide technieken Tabel 10. Vergelijking tussen de tijd nodig voor het onderzoeken van stalen met één techniek en het onderzoeken van stalen met een combinatie van beide technieken. Mini-FLOTAC McMaster Combinatie Tijd nodig voor alle negatieve stalen 6 h 22 min 42 s 4 h 49 min 50 s 9 h 43 min 46 s Tijd nodig voor alle positieve stalen 15 h 56 min 53 s 6 h 9 min 2 s 9 h 39 min 10 s Totale tijd nodig 22 h 19 min 35 s 10 h 58 min 52 s 19 h 22 min 56 s 27

35 Bespreking 1. Kwalitatieve diagnostiek Zoals blijkt uit voorgaande resultaten kan de Mini-FLOTAC techniek een meerwaarde bieden ten opzichte van de McMaster techniek bij het diagnosticeren van besmettingen met gastro-intestinale parasieten bij de onderzochte diersoorten. Zo werden voor alle onderzochte parasieten, met uitzondering van Eimeria spp. vals negatieve resultaten bekomen met de McMaster techniek. Voor de meeste parasieten was de prevalentie echter zo laag of werden van de gastheerdiersoorten zo weinig stalen onderzocht dat geen sluitende conclusies over de diagnostische meerwaarde van de Mini- FLOTAC techniek kunnen worden getrokken. Voor Strongilyden spp., met een prevalentie van 56% over de verschillende diersoorten, werden wel duidelijke verschillen tussen de twee technieken opgemerkt. Hier werden met de McMaster techniek 10% van de stalen vals negatief gediagnosticeerd, tegenover 1% vals negatieve diagnosen met de Mini-FLOTAC techniek. Hierdoor lijkt de Mini-FLOTAC techniek de aangeraden methode om de diagnose van besmetting met Strongilyden spp. te stellen. Het vergelijken van de sensitiviteit van beide technieken is echter niet eenvoudig doordat er geen goede gouden standaard bestaat. Een mogelijke oplossing hiervoor is de resultaten van verschillende diagnostische technieken te combineren, waarbij een staal als positief wordt beschouwd wanneer met minimaal één van de gebruikte technieken een positief resultaat wordt bekomen. Dit is ook de methode die in deze masterproef werd gebruikt, door het combineren van de positieve resultaten van de McMaster techniek en de Mini-FLOTAC techniek tot een gouden standaard. Een nadeel van deze methode is dat wordt aangenomen dat de specificiteit van de gebruikte diagnostische technieken gelijk is aan 100%. Een andere mogelijkheid is de nood aan een gouden standaard te omzeilen door bijvoorbeeld gebruik te maken van Bayesiaanse statistiek. Vervolgens werd gekeken naar de EPG die werd bekomen met de Mini-FLOTAC techniek op de stalen die vals negatief werden gediagnosticeerd met de McMaster techniek. Hieruit bleek dat hoe lager de EPG was, hoe groter de kans dat een staal vals negatief werd gediagnosticeerd met de McMaster methode. De voornaamste reden hiervoor is dat de detectielimiet van de gebruikte Mini- FLOTAC procedure 5 EPG bedraagt, terwijl deze van de gebruikte McMaster procedure slechts 50 EPG bedraagt. Hierdoor zullen theoretisch alle besmettingen tussen 5 en 50 EPG wel door de Mini- FLOTAC techniek worden gediagnosticeerd, maar niet door de McMaster techniek. Uit de bekomen resultaten blijkt ook dat een groot deel van de vals negatieve resultaten met de McMaster techniek, namelijk 75%, zich net tussen deze twee waarden bevindt. Deze groep van vals negatieve resultaten zijn dus te verwachten op basis van eigenschappen van de twee gebruikte technieken. Naast het feit dat deze vals negatieve resultaten te verwachten zijn, moet men zich ook afvragen wat de diagnostische meerwaarde is van deze resultaten. Zo geeft de website aan dat voor individuele meststalen van paarden niet moet worden behandeld wanneer de EPG lager is dan 200 (Tabel 11). Wanneer deze waarde zou gebruikt worden als drempelwaarde om een paard te ontwormen zou voor alle paardenstalen onderzocht in 28

36 deze masterproef met beide technieken tot dezelfde beslissing worden gekomen. Er werden namelijk geen vals negatieve resultaten bekomen met de McMaster techniek bij besmettingen met een EPG hoger dan 150. Tabel 11. Beslisboom om een individueel paard al dan niet te ontwormen (Bron: Een duidelijk voordeel van de lagere detectielimiet van de Mini-FLOTAC techniek is wanneer wordt gekeken naar anthelminthicumresistentie met behulp van de Fecal Egg Count Reduction (FECR) test. Hierbij worden zowel voor als na een behandeling met een anthelminthicum meststalen onderzocht op aanwezige wormeieren om de procentuele reductie hiervan na een behandeling te kunnen bepalen. Hoewel in de stalen onderzocht na de behandeling vaak slechts enkele eieren aanwezig zijn is het toch belangrijk deze diagnosticeren omdat ze zouden kunnen wijzen op een begin van resistentie tegen het gebruikte product (Calvete en Uriarte, 2013). 2. Kwantitatieve diagnostiek Ondanks de groep van vals negatieve resultaten bekomen met de McMaster techniek is er een zeer goede correlatie van 98.8% tussen beide technieken. Deze wijst er op dat geen van beide technieken een systematische over- of onderschatting geeft van de besmettingsgraad ten opzichte van de andere. 3. Tijd Uit de resultaten van de benodigde tijdsduur voor beide technieken kan worden afgeleid dat het uitvoeren van de Mini-FLOTAC techniek significant langer duurt dan het uitvoeren van de McMaster techniek. De stap die het meeste invloed heeft op de variatie in tijdsduur nodig voor een bepaalde techniek, is de tijd nodig om een klaargemaakt staal af te lezen. Alle andere stappen zijn immers gestandaardiseerde handelingen waar niet zoveel variatie op zit. De reden waarom de Mini-FLOTAC techniek langer duurt dan de McMaster techniek zit dan ook vooral vervat in het significante verschil in tijdsduur voor het aflezen van beide technieken. Verder duurt ook het afwassen van het benodigde 29

37 materiaal significant langer bij de Mini-FLOTAC techniek, maar het klaarmaken van het staal duurt significant korter. Dat het klaarmaken van het staal sneller gaat bij de Mini-FLOTAC techniek heeft vooral te maken met het gebruik van de Fill-FLOTAC (Fig. 16), omdat deze het proces sterk vereenvoudigd. Zo moet voor de McMaster techniek het staal gehomogeniseerd en gezeefd worden met behulp van een spatel en een zeefje, waarbij het staal telkens moet worden overgegoten en dient het staal met een pasteurpipet in de telkamer te worden gebracht. De Fill-FLOTAC combineert dit doormiddel van het deksel dat op het potje, waar het staal in wordt afgewogen, kan worden geschroefd. Enerzijds zit hierin een mengstaafje vervat waarmee de inhoud van het potje kan worden gehomogeniseerd, als het gesloten is, door er draaiende en op en neer gaande bewegingen mee te maken. Anderzijds is in het deksel ook een zeef ingebouwd en kan een plastic tip op het deksel worden aangebracht waardoor het staal in de Mini-FLOTAC kan worden gebracht, waarbij het eerst door de zeef in het deksel passeert. Hoewel in deze masterproef dit niet is gedaan zou de Fill-FLOTAC ook gebruikt kunnen worden in een McMaster protocol, waardoor dit sneller zou kunnen worden uitgevoerd, en het tijdsverschil in voorbereiding tussen beide technieken waarschijnlijk kleiner zou worden. Een nadeel van deze Fill- FLOTAC is dat bij het gebruik ervan voor schapen- of geitenfeces, welke normaal gezien keutels zijn, deze vaak niet goed worden gehomogeniseerd. Dit komt omdat de keutels door het mengstaafje tegen de bodem van het potje worden gedrukt waar ze vervolgens blijven plakken en dus niet worden gehomogeniseerd. Bij dergelijke stalen kunnen de keutels dus best vooraf reeds in het potje worden verkruimeld met bijvoorbeeld een spatel voordat de flotatievloeistof wordt toegevoegd. Dit probleem stelt zich minder bij de McMaster techniek daar de keutels bij deze techniek tijdens het zeven handmatig worden verkruimeld met de spatel. Bij beide technieken duurt de voorbereiding van een dergelijk staal hierdoor vaak iets langer dan van andere stalen Fig. 16 : Fill-FLOTAC: 1. Plastic tip; 2: Mengstaafje; 3. Potje met gehomogeniseerd staal 30

38 Het afwassen van het benodigde materiaal duur langer voor de Mini-FLOTAC techniek omdat hier meer materiaal voor nodig is dat wordt hergebruikt in vergelijking met de McMaster techniek. Zoals eerder vermeld duurt het aflezen van een staal langer voor de Mini-FLOTAC techniek dan voor de McMaster techniek, maar zit in deze stap ook de grootste variatie in tijdsduur tussen de verschillende stalen. Deze tijd nodig om een staal af te lezen zal vooral afhangen of een staal positief of negatief is en, indien het positief is, hoe zwaar de besmetting is. Hiernaast kunnen echter ook andere factoren een rol spelen zoals klaarheid van het staal en de aanwezige vuilpartikels, welke beide het aflezen van een staal kunnen bemoeilijken. Wanneer eerst wordt gekeken naar het verschil tussen positieve en negatieve stalen, is het logisch dat de tijd om een negatief staal af te lezen constanter is dan deze van een positief staal. Voor negatieve stalen is echter al een gemiddeld verschil van iets minder dan vier minuten tussen beide technieken zoals blijkt uit Tabel 8. Hieruit kan worden geconcludeerd dat het aflezen van de Mini-FLOTAC standaard al ongeveer vier minuten langer duurt dan het aflezen van de McMaster telkamer. Dit verschil is te verklaren doordat bij de Mini-FLOTAC een grotere oppervlakte wordt bekeken onder de microscoop in vergelijking met een McMaster telkamer. Ook blijkt uit Tabel 8 dat dit verschil in tijdsduur van het aflezen opvallend groter is voor positieve stalen. Dit verschil bedraagt hier namelijk iets minder dan acht minuten. Uit figuur 14 blijkt ook dat, naarmate de totale besmetting van een staal stijgt, de tijd nodig voor het aflezen van een staal met Mini-FLOTAC ook sterk stijgt, terwijl dit voor het aflezen van een staal met McMaster vrijwel constant blijft. Hierdoor wordt het verschil in tijdsduur van aflezen tussen beide technieken steeds groter naarmate de totale besmetting stijgt. Een reden hiervoor is dat door de tienmaal lagere detectielimiet van de Mini-FLOTAC methode ook tienmaal zoveel eieren en/of oöcysten zullen geteld moeten worden in eenzelfde staal in vergelijking met de McMaster techniek. Vervolgens worden andere factoren, die het aflezen van het staal kunnen bemoeilijken en dus de tijd van het aflezen verlengen, vergeleken tussen de beide technieken. De klaarheid van het staal is meestal vergelijkbaar tussen beide technieken (Fig. 17), hoewel de Mini- FLOTAC soms iets donkerder is wanneer deze wordt afgelezen. Bij beide technieken is de klaarheid van het staal echter steeds voldoende om een goede aflezing van het staal toe te laten. 31

39 Fig. 17 : Verschil in klaarheid tussen beide technieken bij eenzelfde staal. Links: Mini-FLOTAC Rechts: McMaster Vuildeeltjes komen voor bij het aflezen van stalen met elk van beide technieken, maar hebben een duidelijk sterkere invloed bij de Mini-FLOTAC techniek. Bij deze zijn deze vuildeeltjes namelijk steeds in grotere getale aanwezig en liggen ze dichter op elkaar dan bij McMaster preparaten (Fig. 18). Ook komen bij Mini-FLOTAC grotere vuildeeltjes voor dan bij McMaster. Dit laatste is te verklaren door de iets grotere poriegrootte van de zeef van de Fill-FLOTAC in vergelijking met de zeefjes gebruikt voor de McMaster techniek. Wanneer een grote hoeveelheid vuildeeltjes aanwezig is zoals in figuur 18, kan het lastig worden om een staal met de Mini-FLOTAC af te lezen doordat deze vuildeeltjes het grootste deel van het beeld vullen en de wormeieren en/of oöcysten kunnen maskeren. Fig. 18 : Verschil in vuildeeltjes tussen beide technieken bij eenzelfde staal. Links: Mini-FLOTAC Rechts: McMaster Het grootste verschil tussen beide technieken in moeilijkheden bij het aflezen zit in de aanwezigheid van luchtbellen in het staal. Microscopische luchtbellen zijn aanwezig bij het aflezen van beide technieken. Ze komen echter in veel grotere aantallen voor bij het aflezen van de Mini-FLOTAC dan bij het aflezen van de McMaster telkamer, waar ze slechts sporadisch voorkomen (Fig. 19). Bij de Mini-FLOTAC zit er variatie op het 32

40 voorkomen van luchtbellen, waarbij sommige stalen zeer veel luchtbellen bevatten en andere slechts enkele per veld. Een deel van deze luchtbellen kon worden vermeden wanneer bij het vullen het staal traag in de Mini-FLOTAC werd gebracht, maar ook dan werden soms nog stalen met een groot aantal luchtbellen aangetroffen. De nadelen van deze microscopische luchtbellen is dat ze zoals de eerder vermelde vuildeeltjes een groot deel van het beeld kunnen vullen, maar ook dat wormeieren of oöcysten minder goed opvallen tussen grote hoeveelheden luchtbellen en soms zelfs amper zichtbaar zijn wanneer ze in een cluster luchtbellen liggen. Fig. 19 : Microscopische luchtbellen. Links: Mini-FLOTAC; Rechts: McMaster Macroscopische luchtbellen zijn normaal nooit aanwezig in de McMaster telkamer (Fig. 20), wanneer deze op een correcte manier wordt gevuld. In de Mini-FLOTAC daarentegen komen ze regelmatig voor onder de afleesrasters, in wisselende hoeveelheden (Fig. 21). De macroscopische luchtbellen bij Mini-FLOTAC ontstaan niet bij het vullen, maar ontstaan pas wanneer de Mini-FLOTAC wordt gedraaid met behulp van de sleutel om deze te kunnen aflezen. Deze luchtbellen zijn niet bij elk staal aanwezig, en wanneer de Mini-FLOTAC goed werd gevuld en rustig wordt gedraaid ook meestal niet in grote aantallen. Het veelvuldig gebruik van een Mini-FLOTAC systeem kan ook bijdragen tot een groter aantal luchtbellen. Door slijtage komt het dan vaak voor dat vloeistof tussen de basis en de afleesdisk loopt bij het vullen, wat erop wijst dat deze niet meer zo nauw aansluiten als zou moeten. Toch zijn deze luchtbellen niet volledig te vermijden door een goede voorbereiding van het staal en het gebruik van nieuwe Mini-FLOTAC systemen en hebben ze een duidelijke invloed op het aflezen hiervan. Dit is omdat op de plaats waar de lucht zit, normaal gezien vloeistof hoort te zitten, waardoor uiteindelijk een kleinere hoeveel staal wordt bekeken dan zou moeten en een foute inschatting van de EPG of OPG kan worden bekomen. 33

41 Fig. 20 : Gevulde McMaster telkamer, geen macroscopische luchtbellen zichtbaar. Fig. 21 : Links: Mini-FLOTAC met duidelijke grote macroscopische luchtbellen onder de afleesrasters; Rechts: Mini-FLOTAC met slechts enkele kleine luchtbellen onder de afleesrasters Een laatste bemerking in verband met de tijdsduur nodig voor beide technieken is het verschil in tijd dat moet worden gewacht bij beide technieken. Deze tijd bedraagt 10 minuten voor de Mini-FLOTAC techniek en 2 minuten voor de McMaster techniek en zorgt ervoor dat de wormeieren en oöcysten genoeg tijd te hebben om te stijgen in de flotatievloeistof om zo duidelijk afgelezen te kunnen worden. Deze tijd werd in alle voorgaande berekeningen niet in rekening gebracht omdat wanneer zoals in deze masterproef verschillende stalen na elkaar worden onderzocht deze van weinig betekenis is. Tijdens het wachten kan immers al worden begonnen met de voorbereiding van het volgende staal of kan een reeds voorbereid staal worden afgelezen. Wanneer bijvoorbeeld slechts één staal moet worden onderzocht, moet deze tijd wel worden gewacht en kan dit een reden zijn om voor de McMaster techniek te kiezen, hoewel de totale tijdsduur nodig voor het onderzoeken van slechts één enkel staal met Mini-FLOTAC zeker ook haalbaar is. 4. Kostenbaten analyse De resultaten van de kostenbaten analyse geven aan dat om een extra positief staal te bekomen door het gebruik van de Mini-FLOTAC techniek, er ongeveer 1 uur langer nodig is dat wordt gespendeerd 34