Het gebruik van mengmonsters voor de diagnose van maagdarmparasieten bij huisdieren

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Het gebruik van mengmonsters voor de diagnose van maagdarmparasieten bij huisdieren door Niels VAN DEN PUTTE Promotoren: Prof. dr. E. Claerebout Dr. B. Levecke Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2014 Niels Van den Putte

2 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar Het gebruik van mengmonsters voor de diagnose van maagdarmparasieten bij huisdieren door Niels VAN DEN PUTTE Promotoren: Prof. dr. E. Claerebout Dr. B. Levecke Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2014 Niels Van den Putte

4 Voorwoord Graag zou ik mijn promotor Prof. dr. E. Claerebout bedanken voor de nodige uitleg over het besproken onderwerp, voor het aanbrengen van nuttige artikels en voor de hulp bij het schrijven en verbeteren van deze literatuurstudie. Verder wil ik ook mijn collega-studenten en familie bedanken voor de steun en ideeën die zij gaven tijdens het werken hieraan.

5 Inhoudsopgave Samenvatting... 1 Inleiding... 2 Literatuurstudie Waarom gepoolde stalen gebruiken en wat zijn hun mogelijke voordelen Poolen van stalen bij andere pathogenen Factoren die de resultaten van gepoolde stalen kunnen beïnvloeden Poolgrootte Aggregatie van wormbesmettingen Detectiemethoden en detectielimieten Toepassingen Screening en behandeling van wormbesmettingen Het gebruik van gepoolde stalen bij FECR Nadelen Onderzoek naar de representativiteit van gepoolde stalen Schapen Methodologie Resultaten Runderen Methodologie Resultaat Kalveren Paarden Methodologie Resultaten Mensen Methodologie Resultaten Bespreking Referentielijst... 20

6 Samenvatting Om besmettingen met maagdarmwormen te diagnosticeren wordt soms gebruik gemaakt van gepoolde meststalen. In deze literatuurstudie wordt aangetoond dat dit duidelijke voordelen kan hebben ten opzichte van diagnose op individuele stalen. Zo is deze techniek goedkoper en minder arbeidsintensief. Vooral voor de inschatting van de mate van besmetting in een kudde is deze techniek goed bruikbaar. De resultaten van de bepaling van het aantal wormeieren op individuele stalen en gepoolde meststalen zijn immers goed vergelijkbaar bij verschillende diersoorten. Wel moet hierbij rekening worden gehouden met de detectielimiet van de gebruikte techniek, de grootte van de pools en de aggregatie van wormeieren binnen een populatie. Poolen van meststalen brengt echter ook nadelen met zich mee. Zo kan hierbij geen gebruik worden gemaakt van Targeted Selective Treatment (TST) en is er een risico op onderschatting van de weidebesmetting. Ook de overeenkomst tussen resultaten van gepoolde meststalen en individuele meststalen in de Fecal Egg Count Reduction (FECR) test is tot op heden nog niet voldoende om betrouwbare FECR testresultaten met gepoolde meststalen te bekomen. 1

7 Inleiding Het onderzoek van individuele meststalen van grote groepen dieren voor de monitoring en de diagnose van maag-darm parasieten bij huisdieren is een tijdrovende en arbeidsintensieve techniek voor laboratoria en een belangrijke kost voor de veehouder. Dit kan een reden zijn voor de veehouder om sneller toevlucht nemen tot blinde behandeling met anthelminthica, wat de resistentie tegen deze producten niet ten goede komt. Ook kunnen dit verloren kosten zijn. Het samenvoegen van meststalen van verschillende dieren tot een gepoold staal en vervolgens de verschillende testen op dit gepoolde staal uit te voeren, zou een oplossing kunnen zijn voor deze problemen. In deze literatuurstudie wordt nagegaan in hoeverre deze mogelijke oplossing al onderzocht is en toegepast wordt. Zo wordt er gekeken of de huidige resultaten van studies hieromtrent gebaseerd zijn op computersimulaties of veldstudies en hoe representatief de resultaten van deze studies zijn in vergelijking met het testen van individuele stalen. Verder worden ook de vooren nadelen van het poolen bekeken en de toepasbaarheid bij de verschillende diersoorten. Ten slotte wordt nagegaan of en hoe deze methode van testen reeds toegepast wordt voor de monitoring en diagnose van maagdarmparasieten. 2

8 Literatuurstudie Gebruikte afkortingen EPG: Eggs Per Gram FEC: Faecal Egg Count FECR: Faecal Egg Count Reduction k: Mate van aggregatie OPG: Oöcysts Per Gram TST: Targeted Selective Treatment TT: Targeted Treatment 1. Waarom gepoolde stalen gebruiken en wat zijn hun mogelijke voordelen Volgens Ward et al. (1997) is de meest courant gebruikte methode voor de diagnose en monitoring van maag-darm parasieten bij huisdieren het mestonderzoek, waarbij wormeieren of (oo)cysten worden opgespoord. Baldock et al. (1990), Nicholls en Obendorf (1994) en Ward et al. (1997) stellen dat het onderzoek van meststalen voor de monitoring van de wormbelasting en de controle op resistentie tegen anthelminthica een veel gevraagde analyse is bij laboratoria. De grote vraag naar controle op resistentie is volgens Nicholls en Obendorf (1994) vooral te wijten aan het groter wordende besef van het bestaan en de gevolgen van resistentie tegen anthelminthica. De eerste studies naar onderzoek van gepoolde stalen, om aan de hogere vraag te kunnen voldoen werden door Baldock et al. (1990) en Nicholls en Obendorf (1994) uitgevoerd bij schapen. Later werd deze problematiek ook bij de meeste andere (nuts)dieren bekend en werden ook hier de mogelijkheden van gepoolde stalen onderzocht. Dit gebeurde onder andere bij runderen (Ward et al. 1997), kalveren (Kuhnert-Paul et al. 2012) en paarden (Eysker et al. 2008). Zelfs humaan werd hier recentelijk onderzoek naar gedaan door Mekonnen et al. (2013). Morgan et al. (2005) en Eysker et al. (2008) stellen dat het testen van individuele stalen vaak te duur is voor de eigenaar van de dieren. Eysker et al. (2005) zien hierin zelfs de reden dat veel paardeneigenaars nog steeds hun paarden blind behandelen met anthelminthica, dus zonder enige vorm van monitoring van de wormbesmetting. De individuele verwerking van deze meststalen is volgens hen een tijdrovende en arbeidsintensieve techniek, waarvoor gepoold testen van meststalen een oplossing zou kunnen bieden. Er zijn echter verschillende redenen om deze meststalen gepoold te onderzoeken. Poolen van meststalen zou targeted anthelminthic treatment (TT) goedkoper kunnen maken en daardoor ook aantrekkelijker voor de paardenhouder. Bij deze TT worden groepen dieren enkel behandeld indien ze een behandeling nodig hebben en niet gebaseerd op een vast tijdsinterval zoals gebruikelijk. De TT zou dan het voordeel hebben dat de frequentie van behandelen verminderd 3

9 kan worden en een refugium kan worden opgebouwd, waardoor resistentie tegen anthelminthica kan worden verminderd. Ook bij mensen zou het wenselijk zijn deze techniek te kunnen gebruiken. Zo zou snel de graad van infectie in een bepaalde populatie kunnen worden bepaald en een overzicht worden verkregen van de aanwezige resistentie tegen anthelminthica (Mekonnen et al. 2013). 2. Poolen van stalen bij andere pathogenen Poolen van stalen voor diagnostische doeleinden werd niet enkel onderzocht voor parasitaire infecties, ook voor andere pathogenen, zowel bij huisdieren als de mens, werd reeds heel wat onderzoek verricht naar het gebruik van gepoolde stalen. Er werd reeds veel onderzoek gedaan naar gebruik van gepoolde fecesstalen voor detectie van Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (paratuberculose) bij runderen. De belangrijkste conclusies uit de onderzoeken omtrent dit onderwerp door Kalis et al. (2000), Tavornpanich (2004), van Schaik et al. (2007) en Raizman et al. (2011) zijn dat gepoolde stalen zeer nuttig zijn voor screening van kuddes die vrij zouden zijn van paratuberculose. Daar fecescultuur de gouden standaard is voor het opsporen van M. avium subsp. paratuberculosis kan zo de hoeveelheid van stalen tot 5 of 10 maal afnemen, afhankelijk van de gebruikte poolgrootte. Voor kuddes die niet vrij worden geacht en men de aangetaste dieren wil opruimen, raden zij aan de individuele ELISA test te gebruiken voor initiële screening gevolgd door fecescultuur van de positief geteste dieren, daar anders 2 maal 3 maanden moet worden gewacht op de resultaten van de fecescultuur. Ook voor andere pathogenen werden reeds eerste onderzoeken naar het gebruik van gepoolde stalen uitgevoerd. In deze studies werden echter nog geen concrete aanbevelingen of toepassingen geformuleerd, maar werd poolen van stalen wel telkens als mogelijk toekomstig alternatief aangehaald. Deze onderzoeken gebeurden voor bepaling van Salmonella spp. in gepoolde fecesstalen (Jordan 2005), boviene virale diarree virus in gepoolde bloedstalen (Muñoz-Zanzi et al. 2000), porciene reproductief en respiratoir syndroom virus in gepoolde serum, bloedswab en spermastalen (Rovira et al. 2007, 2008), Avian pneumovirus in gepoolde serumstalen (Maherchandani et al. 2004) en Chlamydia trachomatis in gepoolde humane endocervicale stalen (Shipitsyna et al. 2007). 3. Factoren die de resultaten van gepoolde stalen kunnen beïnvloeden 3.1. Poolgrootte In veel van de studies naar het gebruik van gepoolde stalen werd het aantal stalen per pool eerder bepaald volgens praktisch nut voor de uitvoering van de studie dan volgens de optimale poolgrootte. Nochtans kan de poolgrootte de betrouwbaarheid van het gepoolde staal zeker beïnvloeden en is verder onderzoek hiernaar vereist voordat gepoolde stalen als betrouwbaar detectiemiddel kunnen worden gebruikt (Eysker et al. 2008). 4

10 Zowel Mekonnen et al. (2013) als Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) vergeleken in hun studie het gebruik van verschillende poolgroottes. Ze deden dit voor poolgroottes van respectievelijk 10, 20 en 60 stalen en 5, 10 en 20 stalen. Beiden vonden een significant positieve correlatie tussen de verschillende poolgroottes en tussen een bepaalde poolgrootte en het gemiddelde van de corresponderende individuele stalen (fig. 4, 7). In de studie van Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) werd de grootste correlatie met individuele stalen gevonden voor een poolgrootte van 20 stalen. Ook in andere studies waar slechts één poolgrootte werd gebruikt die dan werd vergeleken met gemiddelde individuele waarden, werd telkens geen significant verschil gevonden tussen beiden, zoals reeds hoger beschreven bij de verschillende diersoorten. (Baldock et al. 1990, Nicholls en Obendorf 1994, Ward et al. 1997, Morgan et al. 2005, Eysker et al. 2008, Daniel et al. 2012) Waar zowel Mekonnen et al. (2013) als Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) wel een verschil vonden was in de fecal egg count (FEC) waarde tussen de verschillende poolgroottes. Hierin spreken de resultaten uit de twee studies elkaar tegen daar Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) hogere FEC waarden vonden voor de individuele stalen en Mekonnen et al. (2013) hogere FEC waarden vonden bij toenemende poolgrootte. Significante verschillen waren er echter enkel voor pools van 10 onderzocht met de McMaster (15 eieren per gram (EPG)) methode (Rinaldi et al. ongepubliceerde resultaten) en voor pools van 60 voor de diagnose van haakwormen (Mekonnen et al. 2013) Aggregatie van wormbesmettingen Morgan et al. (2005) zien in de grote aggregatie van wormbesmettingen binnen een populatie een duidelijk risico voor het gebruik van gepoolde stalen. Deze aggregatie houdt in dat wormbesmettingen niet uniform verdeeld zijn binnen een populatie dieren. Zo is meestal een klein deel van de populatie verantwoordelijk voor de meerderheid van de uitgescheiden wormeieren en scheidt een groot deel van de populatie slechts een laag aantal wormeieren uit. Zij stellen dat, wanneer slechts een klein deel van de populatie wordt bemonsterd om een beeld van de wormbelasting in volledige populatie te verkrijgen, de kans groot is dat deze belasting wordt onderschat. Dit risico op onderschatting stijgt wanneer de aggregatie van wormbesmettingen binnen de populatie groter wordt en daalt wanneer een groter deel van de populatie wordt bemonsterd. Door deze onderschatting is er een risico dat een populatie dieren die een behandeling nodig heeft, vals wordt gediagnosticeerd als een weinig besmette populatie die geen behandeling behoeft. De grote aggregatie van wormbesmettingen verhoogt ook de kans op overschatting van de besmetting in de populatie. Dit is echter van minder klinisch belang dan een onderschatting. Voor gebruik in de praktijk stellen Morgan et al. (2005) voor dat de keuze van de poolgrootte best kan worden gebaseerd op de mate van aggregatie (k) van de wormbesmetting binnen de onderzochte populatie. Omdat het niet haalbaar is om de mate van aggregatie voor elk bedrijf afzonderlijk te bepalen stellen zij voor bepaalde richtwaarden te bepalen voor gebruik in verschillende situaties, gebaseerd op onder andere leeftijd, diersoort en weidegebruik. Deze richtwaarden voor k kunnen dan gebruikt worden om het aantal individuele stalen per pool te bepalen. Praktisch raden zij aan dat bij lage k waarden, welke een hoge mate van aggregatie inhouden, meerdere individuen in de pools worden opgenomen om voor de onderzochte populatie relevante gegevens te verkrijgen. 5

11 3.3. Detectiemethoden en detectielimieten Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) voerden in hun studie ook een vergelijking uit tussen verschillende detectiemethoden om gastro-intestinale strongyliden op te sporen. Hieruit bleek dat vooral bij lage FEC waarden de Mini-FLOTAC (10 EPG) een hogere sensitiviteit haalde dan McMaster (15 EPG) en McMaster (50 EPG). Bij hogere FEC waarden was dit verschil minimaal. Ook lag de waarde van de FEC steeds hoger bij Mini-FLOTAC (10 EPG) dan bij McMaster (15 EPG) en McMaster (50 EPG). Ongeacht deze verschillen bleken de drie onderzochte technieken bruikbaar, daar ze in 95% van de gevallen een juiste uitslag gaven (Rinaldi et al. ongepubliceerde resultaten). De hogere sensitiviteit van technieken met lage detectielimiet is vooral van belang wanneer de verwachtte besmettinggraad laag ligt, zoals bij gebruik in FECR tests. Voor het bepalen van bijvoorbeeld de FEC wanneer de besmettingsgraad hoog is of bij beslissingen tot behandeling van enkel de dieren met hoge uitscheiding van wormeieren, bijvoorbeeld bij toepassing van Targeted Selective Treatment (TST), is een techniek met lage detectielimiet niet vereist (Rinaldi et al. 2011). 4. Toepassingen Na de hoofdstukken over de bruikbaarheid en specificaties, zullen in dit hoofdstuk enkele mogelijke toepassingen van gepoolde meststalen, welke door de verschillende onderzoekers werden voorgesteld, worden besproken. Sommige hiervan werden reeds effectief toegepast, andere zijn nog maar ideeën welke nog verdere uitwerking vragen Screening en behandeling van wormbesmettingen Voor de screening en de behandeling van wormbesmettingen is het poolen van stalen reeds enkele malen toegepast. Zo vermeldden Baldock et al. (1990) en Nicholls en Obendorf (1994) screening van schapen met gebruik van gepoolde stalen in zuidoost Queensland en in Tasmanië. Verder gebruikten Martínez-Pérez et al. (2012) reeds gepoolde stalen in hun vergelijkende studie over verschillende detectiemethoden voor Fasciola hepatica in schapen. Daarnaast gaven zowel Ward et al. (1997) als Mekkonen et al. (2013) in hun studies aan dat gepoolde stalen gebruikt konden worden bij respectievelijk runderen en mensen, voor een snellere en goedkopere screening naar wormbesmettingen. Een voorstel voor een efficiëntere aanpak van worminfecties bij paarden werd geformuleerd door Eysker et al. (2008). Zij zagen in het gebruik van gepoolde stalen nieuwe mogelijkheden om efficiënter en goedkoper kuddes paarden te screenen voor worminfecties om zo een meer optimale behandeling toe te kunnen passen. Zij stelden voor om per kudde en per leeftijdscategorie een tiental dieren te bemonsteren en de bekomen stalen te poolen. Dit gepoolde staal werd dan onderzocht en wanneer de EPG een vooraf bepaalde afkapwaarde overschreed, werd de hele kudde behandeld. Naast de duidelijke vermindering van het aantal stalen met deze methode vonden Eysker et al. (2008) het wel nadelig dat op deze manier gemakkelijk hoge uitscheiders van wormeieren konden worden gemist. Om dit te vermijden stelden Eysker et al. (2008) een tweede methode voor. Hierbij zouden alle 6

12 paarden worden onderverdeeld in pools en wanneer de EPG van een pool boven de afkapwaarde kwam werden de paarden uit die pool individueel onderzocht. Zo zou de kudde kunnen worden onderverdeeld in hoge en lage uitscheiders, welke respectievelijk meer en minder behandelingen behoeven Het gebruik van gepoolde stalen bij FECR De voornaamste methode om anthelminthicumresistentie bij dieren op te sporen is de fecal egg count reduction test (FECR) (Calvete en Uriarte, 2013). Bij deze FECR test wordt het aantal wormeieren dat een dier uitscheidt voor een behandeling met een anthelminthicum vergeleken met het aantal wormeieren dat een dier op een bepaald tijdstip na de behandeling uitscheidt. Hoe lager het aantal eieren na behandeling in vergelijking met voor de behandeling, hoe effectiever het gebruikte anthelminthicum en hoe minder resistentie aanwezig is (Cabaret en Berrag, 2004). Daar het bewustzijn rond anthelminthicumresistentie en de bijhorende gevolgen steeds groter worden (Nicholls en Obendorf, 1994), werden reeds verschillende studies ondernomen om opsporen van deze resistentie met behulp van gepoolde stalen in de FERC test te evalueren. In de eerste studies naar het gebruik van gepoolde meststalen door Baldock et al. (1990) en Nicholls en Obendorf (1994) werd het gebruik van deze in de FECR test nog betwijfeld. De risico s op fouten bij staalname en verwerking van gepoolde stalen, waarbij ze vooral vreesden voor toevallig onbehandelde dieren, werden door Baldock et al. (1990) te groot gevonden voor gebruik bij FECR. Nicholls en Obendorf (1994) deelden in hun studie naar gepoolde stalen deze mening van Baldock et al. (1990). Latere studies van zowel Daniel et al. (2012), Calvete en Uriarte (2013), Mekonnen et al. (2013) en Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) toonden aan dat het gebruik van gepoolde stalen in FECR testen wel degelijk een mogelijkheid kan zijn. Zo vonden Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) zeer vergelijkbare resultaten voor individuele en gepoolde FECR uitkomsten bij schapen. Dit vonden ze zowel voor de verschillende poolgroottes die ze gebruikten (5, 10 en 20) als voor de verschillende detectiemethoden die ze gebruikten (McMaster15, McMaster50 en Mini-FLOTAC). Een belangrijke bemerking werd echter geformuleerd door Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten). In hun studie lagen alle FECR waarden op of dicht bij 100%. Hierdoor konden ze geen algemeen besluit trekken over de toepasbaarheid van gepoolde stalen in de FECR test. Mekonnen et al. (2013) ondervonden dit in hun studie naar deze toepassing van FECR bij mensen. Zij vonden hoge correlatie tussen gepoolde en individuele FECR resultaten voor A. lumbricoides, waarvoor de FECR waarden tussen 96% en 98% lagen. Voor T. trichiura, waarbij de FECR waarden varieerden tussen 53% en 78%, werd eveneens een significante correlatie gevonden maar lagen de gevonden waarden reeds sterk uit elkaar. Voor haakwormen tenslotte vonden ze FECR waarden tussen 44% en 88% en werd een significant verschil gevonden tussen de individuele waarden en de gepoolde waarden bij pools van 10 en 60. In de studie van Mekonnen et al. (2013) nam de correlatie van gepoolde en individuele FECR waarden dus af met dalende FECR waarden van de individuele stalen. 7

13 In hun simulatie gebaseerde studie over het gebruik van FECR werden door Calvete en Uriarte (2013) enkele mogelijke verklaringen gegeven voor de onnauwkeurigheid van verschillende FECR methoden. Ook formuleerden ze enkele aanbevelingen voor het gebruik van de FECR test in de toekomst. In deze studie vergeleken Calvete en Uriarte (2013) vier verschillende methoden om een FECR test uit te voeren: een FECR test zonder en een met controlegroep en een gepoolde FECR test zonder en een met controlegroep. Het meest gebruikte aantal van 10 stalen per pool zou volgens hen alleen voldoen wanneer een hoge uitscheiding van wormeieren werd verwacht. Indien dit niet het geval is raden ze aan een hoger aantal stalen te gebruiken. Calvete en Uriarte (2013) formuleerden ook enkele aanbevelingen voor het gebruik in de praktijk. Hierin stellen ze dat gepoolde FECR testen een goed alternatief zijn tegenover individuele FECR testen om gevoelige en resistente populaties van parasieten van elkaar te onderscheiden. Daniel et al. (2012) vonden tenslotte dat ook om triclabendazoleresistentie bij leverbot aan te tonen de gepoolde FECR gebruikt kan worden. Zij stelden dat de sensitiviteit van de gepoolde FECR test voldoende was om een vermoeden van resistentie tegen triclabendazole aan te tonen en zo als een snelle screeningsmethode kan worden gebruikt. Wanneer resistentie aanwezig was, raadden ze echter wel aan individuele stalen te gebruiken om de precieze graad van resistentie vast te stellen. Zij vonden immers dat aggregatie van besmettingen en verlies van eieren tijdens het poolen belangrijke factoren waren die de resultaten van de gepoolde stalen konden beïnvloeden. Aggregatie van besmettingen was volgens Daniel et al. (2012) wel niet zo belangrijk als aggregatie van besmettingen bij gastro-intestinale nematoden beschreven door Morgan et al. (2005). Verlies van eieren tijdens het poolen lag volgens Daniel et al. (2012) vooral aan de moeilijkere homogenisatie van gepoolde stalen door het grotere te mengen volume. 5. Nadelen Naast de duidelijke voordelen die gepoold testen van meststalen zou kunnen bieden, worden door verschillende onderzoeken ook mogelijke nadelen aangehaald. Baldock et al. (1990) en Nicholls en Obendorf (1994) twijfelen aan de bruikbaarheid van gepoolde stalen in de fecal egg count reduction (FECR) test. Zij stellen dat één toevallig onbehandeld dier het resultaat van de hele pool kan beïnvloeden en zo het geteste anthelminthicum minder effectief kan doen lijken dan dat het werkelijk is. Er moet dus nauw op toegezien worden dat elk dier dat in de pool wordt gebruikt correct behandeld werd. Ook moet nauwkeurig bijgehouden worden welk dier zich in welke pool bevindt en welk anthelminthicum bij welke pool wordt gebruikt. Morgan et al. (2005) zien in de aggregatie van wormbesmettingen het grootste gevaar voor foute conclusies uit gepoolde stalen. Dit zou vooral gebeuren wanneer met de aggregatie van wormbesmettingen geen rekening wordt gehouden bij het bepalen van het aantal pools en het aantal stalen per pool. Hoe best rekening kan gehouden worden met deze aggregatie werd reeds hoger beschreven. 8

14 Eysker et al. (2008) ten slotte zien twee belangrijke nadelen. Ze stellen dat poolen van stalen een risico inhoud op het onderschatten van weidebesmetting doordat dieren die veel wormeieren uitscheiden gemist zouden kunnen worden. Dit risico achten ze echter klein wanneer het gaat om volwassen dieren. Daarnaast merken ze ook op dat Targeted Selective Treatment (TST), dat de kosten en het gebruik van anthelminthica aanzienlijk kan doen dalen, niet gebruikt kan worden bij gepoolde stalen. Dit doordat bij TST voor elk individu apart moet worden onderzocht of een behandeling nodig is, daar enkel de dieren die een behandeling nodig hebben ook effectief worden behandeld. 6. Onderzoek naar de representativiteit van gepoolde stalen De representativiteit van gepoolde stalen voor het uitvoeren van fecal egg counts (FEC) werd reeds bij verschillende diersoorten onderzocht. Voor een overzicht van de belangrijkste parameters uit deze onderzoeken zie Tabel Schapen Zowel Baldock et al. (1990), Nicholls en Obendorf (1994), Morgan et al. (2005), Daniel et al. (2012) en Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) hebben onderzoek verricht naar de representativiteit van het gebruik van gepoolde stalen bij schapen Methodologie Zowel Baldock et al. (1990), Nicholls en Obendorf (1994), Morgan et al. (2005) en Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) voerden een veldstudie uit om met de McMaster methode het gemiddelde aantal wormeieren per gram (EPG) van meststalen van individuele dieren met de EPG van gehomogeniseerde gepoolde meststalen van een groep van diezelfde individuele dieren te vergelijken. Ze gebruikten hiervoor volgende detectielimieten: 25 voor de individuele stalen en 20, 25 en 33 voor de gepoolde stalen bij een respectievelijke poolgrootte van 5, 4 en 3 stalen (Baldock et al. 1990), 15 voor zowel de individuele als de gepoolde stalen (Nicholls en Obendorf 1994) en 15 en 50 voor zowel de individuele als de gepoolde stalen (Rinaldi et al. ongepubliceerde resultaten). De grootte van de gepoolde groepen varieerde over de verschillende studies tussen 3 en 20. Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) voerden ook een vergelijkbare veldstudie uit met de Mini-FLOTAC methode om de EPG s te vergelijken. Deze methode had een sensitiviteit van 10 EPG (Rinaldi et al. ongepubliceerde resultaten). Baldock et al. (1990) en Morgan et al. (2005) gebruikten fecescultuur gevolgd door de Baermann methode om de voornaamste wormsoorten in hun studie te bepalen. Nicholls en Obendorf haalden de informatie over de meest aanwezige wormsoorten in hun studie uit de resultaten van een monitoringprogramma, uitgevoerd in hetzelfde gebied. Morgan et al. (2005) wilden vooral het effect van aggregatie op gepoolde stalen testen. Zij voerden vooraf aan hun veldproef ook een computersimulatie uit om te kijken of de EPG van een gepoold meststaal van een deel van een kudde schapen representatief kan zijn voor de gehele kudde. Voor 9

15 hun simulatie gingen zij uit van het feit dat de EPG in een gepoold staal gelijk is aan de gemiddelde EPG van een gelijk aantal individueel geteste stalen, hetgeen de overige studies net trachten aan te tonen. Daniel et al. (2012) lieten voor hun onderzoek naar de representativiteit van gepoolde stalen voor de detectie van Fasciola hepatica bij schapen een sedimentatietest uitvoeren in een lokaal laboratorium om het aantal leverbot eieren in het gemiddelde van een groep individuele stalen te vergelijken met het aantal leverbot eieren in een gepoold staal van diezelfde individuen. Er werden telkens 10 stalen onderzocht afkomstig van een kudde van 12 schapen. De gevoeligheid van de test werd niet vermeld Resultaten Baldock et al. (1990), Nicholls en Obendorf (1994), Morgan et al. (2005) en Rinaldi et al. (ongepubliceerde resultaten) stelden allen vast uit hun onderzoeken dat er een grote correlatie is tussen de gemiddelde EPG van individueel geteste stalen en de EPG van het corresponderende gepoolde staal. Dit werd aangetoond door de EPG waarden verkregen uit beide methoden met elkaar te vergelijken (fig. 1, 2, 3, 4). Hieruit concludeerden ze dat het gebruik van de EPG van een gepoold meststaal een goede weergave geeft van de gemiddelde EPG van een groep schapen voor zowel Haemonchus spp. (Baldock et al. 1990, Morgan et al. 2005), Trichostrongylus spp. (Baldock et al. 1990, Nicholls en Obendorf 1994, Morgan et al. 2005) en Teladorsagia spp. (Nicholls en Obendorf 1994, Morgan et al. 2005). Ook voor Fasciola hepatica werd een goede correlatie tussen de fecal egg count (FEC) van gemiddelden van individuen en de FEC van de corresponderende gepoolde stalen gevonden (Daniel et al. 2012). Fig. 1 Spreidingsdiagram (met regressielijn) van de log waarden van de gepoolde EPG s op de log waarden van de gemiddelde individuele EPG s. (uit Baldock et al. 1990) Fig. 2 Spreidingsdiagram (met regressielijn) van de log waarden van de gemiddelde individuele EPG s op de log waarden van de gepoolde EPG s. (uit Nicholls en Obendorf 1994) 10

16 Fig. 3 Spreidingsdiagram (met regressielijn) van de gepoolde EPG waarden op de gemiddelde individuele EPG waarden. (uit Morgan et al. 2005) Fig. 4 Spreidingdiagrammen (met lijnen van gelijkheid) van de gepoolde EPG waarden op de gemiddelde individuele EPG waarden. Bovenaan: pools van 5, Midden: pools van 10, Onderaan: pools van 20. (uit Rinaldi et al. ongepubliceerde resultaten) 6.2. Runderen Door Ward et al. (1997) is een onderzoek uitgevoerd naar de bruikbaarheid van gepoolde meststalen voor maagdarmwormen bij runderen. 11

17 Methodologie Ward et al. (1997) gebruikten voor hun studie meststalen van natuurlijk geïnfecteerde dieren uit 90 kuddes. In 75 van de kuddes waren de runderen 18 maanden, in 12 van de kuddes >18 maanden en van 3 kuddes was de leeftijd niet bekend. Uit elk van de kuddes werden door de eigenaar 10 dieren uitgekozen waarvan meststalen werden genomen voor het onderzoek. Van elk van de individuele stalen bepaalden ze de EPG in 4 g mest door gebruik van de McMaster methode (detectielimiet 25). De gepoolde stalen werden bekomen door per kudde tweemaal 5 individuele stalen van 1 g bij elkaar te voegen en te mengen. Van deze gepoolde stalen van 5 g werd vervolgens de EPG bepaald met de McMaster methode (detectielimiet 20). Om de representativiteit van de gepoolde stalen na te gaan vergeleken ze de gemiddelde EPG van de 10 dieren van elke kudde met de gemiddelde EPG van de 2 gepoolde stalen van dezelfde kudde Resultaat Ward et al. (1997) vonden geen significant verschil in de EPG wanneer ze de gemiddelde log waarden van de individuele en gepoolde EPG s vergeleken (fig. 5). Ook wanneer ze de bekomen waarden classificeerden op basis van het al dan niet nodig zijn van een behandeling, met een EPG van 200 als afkap waarde, leverde dit geen significant verschil op tussen de 2 methoden. Ze concludeerden hieruit dat het gepoold testen van stalen een goed alternatief is voor het individueel testen van elk dier. Over invloed van de in de studie meest voorkomende wormspecies, welke bepaald werden door cultuur gevolgd door differentiatie van de larven, namelijk Cooperia spp., Haemonchus placei en Oesophagostomum radiatum, konden ze geen uitspraak doen daar hiervoor niet genoeg stalen werden onderzocht. Fig. 5 Spreidingsdiagram (met lijn van gelijkheid) van het gemiddelde log van de gepoolde EPG op het gemiddelde log van de individuele EPG s (uit Ward et al. 1997) 12

18 6.3. Kalveren Door Kuhnert-Paul et al. (2012) werd een studie uitgevoerd naar de bruikbaarheid van gepoolde meststalen voor de detectie van Eimeria bovis en Eimeria zuernii. bij kalveren. Zij vergeleken hiervoor de OPG waarde (oöcysten per gram faeces) van pools van 5 en 10 stalen met de gemiddelde OPG van de corresponderende individuele stalen. De resultaten die Kuhnert-Paul et al. (2012) bekwamen toonden aan dat de gepoolde OPG waarden niet significant verschilden van de corresponderende individuele OPG waarden. Ze concludeerden hieruit dan ook dat pools van 5 en 10 meststalen een besmetting met pathogene Eimeria spp. kunnen detecteren bij kalveren Paarden Een onderzoek naar de representativiteit van gepoolde meststalen bij paarden werd uitgevoerd door Eysker et al. (2008) Methodologie In de studie van Eysker et al. (2008) werden in totaal 109 paarden opgenomen verspreid over 2 boerderijen. Deze werden per boerderij onderverdeeld in 4 leeftijdscategorieën (#boerderij A; #boerderij B): jaarlingen (3; 4), 2-jarigen (15; 1), 3-jarigen (4; 1) en volwassen paarden (35; 46). Van ieder paard werd wekelijks een meststaal genomen tussen 6 en 14 weken na een behandeling met ivermectine. De individuele stalen werden onderzocht met de McMaster methode met een detectielimiet van 50. Per leeftijdscategorie en per bedrijf werden de stalen ook gepoold onderzocht. Dit gebeurde na homogenisatie van de individuele stalen tot 1 gepoold staal. Hiervan werden dan 2 substalen genomen en beide met de McMaster methode onderzocht resulterend in een gecombineerde detectielimiet van 50. De poolgrootte varieerde tussen 3 en 10. Verder werden ook larvale culturen uitgevoerd van gepoolde stalen om deze met de gegevens uit andere de stalen te vergelijken en om de verschillende wormspecies betrokken in de studie te bepalen. De correlatie tussen de individuele en gepoolde stalen werd bepaald door middel van verschillende computerprogramma s Resultaten Eysker et al. (2008) vonden hoge correlaties tussen de EPG van gemiddelden van de individuele stalen en de corresponderende EPG van gepoolde stalen (fig. 6). Tussen de EPG van gepoolde stalen en de opbrengsten van de corresponderende larvale culturen van de gepoolde stalen werden eveneens hoge correlaties gevonden. Verder bleek uit de larvale cultuur dat cyathostominae larven, naast enkele Trichostrongylus axei larven op boerderij A en enkele Strongyloides westeri larven op boerderij B, de overgrote meerderheid van de gecultiveerde larven uitmaakten. 13

19 Fig. 6 Spreidingsdiagram (met lijn van gelijkheid) van de gepoolde EPG waarden op de gemiddelde individuele EPG waarden (uit Eysker et al. 2008) 6.5. Mensen Mekonnen et al. (2013) onderzochten de representativiteit van gepoolde ontlastingsstalen bij mensen Methodologie In de studie van Mekonnen et al. (2013) werden 840 schoolkinderen, verdeeld over 3 leeftijdscategorieën, onderzocht op de aanwezigheid van door de bodem overgedragen worminfecties ( soil transmitted helminths ). Dit gebeurde door middel van fecesonderzoek met behulp van de McMaster methode (detectielimiet 50 EPG) op zowel individuele als gepoolde stalen. Er werden pools van 10, 20 en 60 stalen gemaakt en hiervan werd telkens de FEC vergeleken met de gemiddelde FEC van de corresponderende individuele stalen. De verschillende leeftijdscategorieën waren vooral bedoeld voor het bepalen van eventuele verschillen in de prevalentie van verschillende wormsoorten bij verschillende leeftijdscategorieën. De volgende leeftijdscategorieën werden onderscheiden: van 5 t.e.m. 9 jaar, van 10 t.e.m. 13 jaar en van 14 t.e.m. 18 jaar. De indeling volgens leeftijd werd niet gebruikt om gepoolde stalen te vergelijken met individuele stalen Resultaten Voor zowel Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura en haakwormen, de drie onderzochte species in deze studie, vonden Mekonnen et al. (2013) een significante correlatie tussen de gemiddelde FEC van de individuele stalen en de FEC van de gepoolde stalen. Ook voor de verschillende poolgroottes werd een significante correlatie gevonden tussen de gemiddelde FEC van individuele en gepoolde stalen (fig. 7). Wanneer men vervolgens per species het gemiddelde van alle individuele waarden ging vergelijken met het gemiddelde van alle waarden per poolgrootte werd ook hier geen significant verschil gevonden, met uitzondering van pools van 60 stalen bij A. lumbricoides. Hierbij lag de gemiddelde FEC van alle pools van 60 significant hoger dan bij de individuele stalen. Mekkonen et al. (2013) concludeerden dan ook dat het poolen van stalen een waardevolle techniek zou kunnen zijn in de verschillende toepassingen van het parasitologisch ontlastingsonderzoek, hoewel ze verder onderzoek op dit gebied noodzakelijk achten voordat het in de praktijk kan worden toegepast. 14

20 Fig. 7 Spreidingdiagrammen (met lijnen van gelijkheid) van de gepoolde FEC waarden op de gemiddelde individuele FEC waarden. Kolommen: A: A. lumbricoides, B: T. trichiura, C: Haakwormen. Rijen: Boven: pools van 10 stalen, Midden: pools van 20 stalen, Onder: pools van 60 stalen. (uit: Mekkonen et al. 2013) Tabel 1. Overzicht van de belangrijkste parameters uit de verschillende onderzoeken omtrent representativiteit van gepoolde stalen. Onderzoek Diersoort Diagnostische Detectielimiet van techniek gepoold staal Poolgrootte 20 EPG 5 Baldock et al. Schaap McMaster 25 EPG 4 (1990) 33 EPG 3 Nicholls en Obendorf (1994) Schaap McMaster 15 EPG 10 Morgan et al. (2005) Schaap McMaster - 10 Daniel et al. (2012) Schaap Sedimentatie - 10 Rinaldi et al. McMaster 15 EPG 10, 15 en 20 (ongepubliceerde Schaap McMaster 50 EPG 10, 15 en 20 resultaten) Mini-FLOTAC 10 EPG 10, 15 en 20 Ward et al. (1997) Rund McMaster 20 EPG 10 Kuhnert-Paul et al. Rund (2012) (kalveren) McMaster - 5 en 10 15

21 Eysker et al. (2008) Mekonnen et al. (2013) Paard McMaster 50 EPG 3 tot 10 Mens McMaster 50 EPG 10, 20 en 60 16

22 Bespreking Na het overzicht en bespreking van de beschikbare literatuur omtrent poolen van meststalen voor parasitologisch onderzoek zullen hier enkele algemene opmerkingen en conclusies omtrent deze literatuur besproken worden. Een eerste opmerking is dat er nog niet veel onderzoek naar het gebruik van gepoolde meststalen voor parasitologisch onderzoek is verricht. De meeste studies omtrent poolen van meststalen omvatten het gebruik ervan voor de diagnose van paratuberculose bij runderen. De bevindingen in deze studies dat gepoolde stalen tot op heden vooral nuttig zijn voor screening van groepen dieren komen wel grotendeels overeen met de bevinden in de parasitologische studies over gepoolde stalen. Ook hier is tot op heden de voornaamste toepassing die wetenschappelijk is onderbouwd de screening van groepen dieren. Het meeste onderzoek op parasitologisch vlak gebeurde bij schapen. Dit omdat de problematiek van anthelminthicumresistentie zich het eerst voordeed bij schapen en daar nu in bepaalde regio s reeds een zeer groot probleem vormt. Bij andere diersoorten begint anthelminthicumresistentie ook op te komen maar is deze problematiek momenteel nog van minder belang dan in de schapensector, maar mag zeker niet onderschat worden. De opkomst van deze resistentie en het grotere belang dat hier de voorbije jaren aan werd gehecht heeft mede gezorgd dat de vraag naar detectie van resistentie en de monitoring van wormbesmettingen binnen bedrijven sterk is gestegen. Daar de huidige technieken echter vaak te duur en te arbeidsintensief zijn voor de gestegen vraag naar deze diensten, moet gezocht worden naar nieuwe methoden op gebied van staalname en detectie van wormbesmettingen en resistentie tegen anthelminthica. Poolen van meststalen is slechts één van de mogelijke oplossingen die hiervoor zouden kunnen worden aangewend. In de oudere studies omtrent poolen van meststalen lag vooral de nadruk op het nagaan van de bruikbaarheid van gepoolde stalen om de mate van wormbesmetting binnen een bedrijf of kudde te bepalen. Met andere woorden of het gemiddeld aantal wormeieren in individuele stalen vergelijkbaar was met het aantal wormeieren in één gepoold staal. In de recentere studies werd hiernaast vaak ook aandacht besteed aan het gebruik van gepoolde stalen voor opsporen van resistentie. Voor het nagaan van wormbesmettingen binnen een bedrijf of kudde werden in alle studies positieve resultaten gevonden. Wanneer men voldoende pools maakt, deze pools niet te groot maakt en een techniek gebruikt met een voldoende lage detectielimiet zal dit in de meeste gevallen een zeer betrouwbaar beeld geven van de algemene besmettingsgraad. Waar men hier wel voor moet opletten is de aggregatie van wormbesmettingen welke een belangrijke invloed op de resultaten kunnen hebben zoals Morgan et al. (2005) aangaven. Een goed gebruik van gepoolde stalen zou kunnen zijn zoals voorgesteld door Eysker et al. (2008). Hierbij worden alle aanwezige dieren ingedeeld in een pool en worden enkel van de positieve pools de individuele stalen onderzocht. Zo kan na een aantal onderzoeken een duidelijk onderscheid gemaakt worden tussen hoge en lage uitscheiders van wormeieren en kan de behandelingsfrequentie hieraan worden aangepast. Deze richtlijnen, 17

23 geformuleerd door Eysker et al. (2008), worden reeds aanbevolen aan paardenhouders door de parasietenwijzer van de Universiteit Utrecht. Wat betreft het opsporen van resistentie tegen anthelminthica met gepoolde meststalen zijn de meningen in de literatuur verdeeld. Wanneer er weinig resistentie aanwezig is lijkt poolen een representatieve techniek (Rinaldi et al. ongepubliceerde resultaten, Mekonnen et al. 2013). Wanneer er wel resistentie aanwezig is verschillen de resultaten van de gepoolde testen vaak significant van de individuele stalen (Mekonnen et al. 2013). Calvete en Uriarte (2013) raden in hun overzichtartikel over het gebruik van FECR testen het gebruik van gepoolde stalen aan als de meest gebruiksvriendelijke techniek om resistente van gevoelige populaties te onderscheiden. De beste techniek blijft volgens hen wel nog steeds de individuele FECR test, waarmee de resistentie ook gekwantificeerd kan worden. Dat deze FECR nog moeilijk met goede nauwkeurigheid toe te passen is met gepoolde stalen is zeker van belang voor gebruik in de praktijk. Er wordt immers vooral in het kader van resistentiebepaling naar nieuwe technieken gezocht om deze goedkoop en snel op te volgen. Verder onderzoek over hoe gepoolde stalen goed gebruikt kunnen worden in FECR testen is dus noodzakelijk voordat gepoolde stalen routinematig gebruikt kunnen worden in praktijkomstandigheden. De verwerking van de gepoolde stalen is volgens veel auteurs ook een belangrijke stap in het verkrijgen van een representatief resultaat. Dit zou dus ook een rol kunnen spelen in de tegenvallende representativiteit van gepoolde stalen tegenover individuele in de FECR test. Zo moeten de stalen steeds goed worden gehomogeniseerd, liefst met toevoeging van water (Mekonnen et al. 2013). Deze homogenisatie is vooral belangrijk vanwege de aggregatie van wormeieren beschreven door Morgan et al. (2005) (Mekonnen et al. 2013). Verder worden ook correctere resultaten verkregen met gebruik van de Mini-FLOTAC techniek welke een lagere detectielimiet heeft (10 EPG) (Rinaldi et al. ongepubliceerde resultaten) in vergelijking met de gangbare McMaster technieken waarbij de detectielimiet meestal varieert tussen 15 en 50 EPG. Bij technieken met een hogere detectielimiet kunnen daarom best voldoende substalen onderzocht om kleine besmettingen niet over het hoofd te zien. Naast het gebruik voor diagnose van maag-darm nematoden en leverbot zouden gepoolde stalen ook voor diagnose van andere parasitaire infecties (schurft, verschillende protozoa) nuttig kunnen zijn. Op dit vlak is echter nog zeer weinig onderzoek naar de relevantie hiervan gebeurd. Cox et al. (2005) gebruikten in hun studie naar de bijdrage van feces van dieren in omgevingsbesmetting wel gepoolde stalen voor opsporen van Cryptosporidium spp. en Giardia spp. in meststalen van verschillende diersoorten. Ook poolen van stalen voor diagnose van parasitaire infecties bij honden en katten is nog weinig onderzocht. Voor de detectie van Toxoplasma gondii bij katten werden in de studie van Wallace (1971) onder andere gepoolde stalen gebruikt. Concreet kan besloten worden dat zowel bij schapen, runderen, paarden en mensen screening van wormbesmettingen kan gebeuren met gepoolde meststalen en dit zowel voor de courante maag-darm 18

24 nematoden (alle) als voor leverbot (schapen en runderen). Voor toepassing in de resistentiebepaling is meer onderzoek noodzakelijk. 19

25 Referentielijst Baldock F.C., Lyndal-Murphy M., Pearse B. (1990). An assessment of a composite sampling method for counting strongyle eggs in sheep faeces. Australian Veterinary Journal 67, Cabaret J., Berrag B. (2004). Faecal egg count reduction test for assessing anthelmintic efficacy: average versus individually based estimations. Veterinary Parasitology 121, Calvete C., Uriarte J. (2013). Improving the detection of anthelmintic resistance: Evaluation of faecal egg count reduction test procedures suitable for farm routines. Veterinary Parasitology 196, Cox P., Griffith M., Angles M., Deere D., Ferguson C. (2005). Concentrations of pathogens and indicators in animal feces in the Sydney watershed. Applied and Environmental Microbiology 71, Daniel R., van Dijk J., Jenkins T., Akca A., Mearns R., Williams D.J.L. (2012). A composite faecal egg count reduction test to detect resistance to triclabendazole in Fasciola hepatica. Veterinary Record 171:153. Eysker M., Bakker J., van den Berg M., van Doorn D.C.K., Ploeger H.W. (2008). The use of ageclustered pooled faecal samples for monitoring worm control in horses. Veterinary Parasitology 151, Jordan D. (2005). Simulating the sensitivity of pooled-sample herd tests for fecal Salmonella in cattle. Preventive Veterinary Medicine 70, Kalis C.H.J., Hesselink J.W., Barkema H.W., Collins M.T. (2000). Culture of strategically pooled bovine fecal samples as a method to screen herds for paratuberculosis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 12, Kuhnert-Paul Y., Schmäschke R., Daugschies A. (2012). Suitability of composite faecal samples for detection of pathogenic Eimeria species. Der Praktische Tierarzt 93, Maherchandani S., Muñoz-Zanzi C.A., Patnayak D.P., Malik Y.S., Goyal S.M. (2004). The effect of pooling sera on the detection of avian pneumovirus antibodies using an enzyme-linked immunosorbent assay test. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 16, Martínez-Pérez J.M., Robles-Pérez D., Rojo-Vázquez F.A., Martínez-Valladares M. (2012). Comparison of three different techniques to diagnose Fasciola hepatica infection in experimentally and naturally infected sheep. Veterinary Parasitology 190, Mekonnen Z., Meka S., Ayana M., Bogers J., Vercruysse J., Levecke B. (2013). Comparison of Individual and Pooled Stool Samples for the Assessment of Soil-Transmitted Helminth Infection Intensity and Drug Efficacy. PLoS Neglected Tropical Diseases 7(5), e2189. Internetreferentie: (geconsulteerd op 13 november 2013). Morgan E.R., Cavill L., Curry G.E., Wood R.M., Mitchell E.S.E. (2005). Effects of aggregation and sample size on composite faecal egg counts in sheep. Veterinary Parasitology 131, Muñuoz-Zanzi C.A., Johnson W.O., Thurmond M.C., Hietala S.K. (2000). Pooled-sample testing as a herd-screening tool for detection of bovine viral diarrhea virus persistently infected cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 12,

26 Nicholls J., Obendorf D.L. (1994). Application of a composite faecal egg count procedure in diagnostic parasitology. Veterinary Parasitology 52, Raizman E.A., Wells S.J., Muñoz-Zanzi C.A., Tavornpanich S. (2011). Estimated within-herd prevalence (WHP) of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in a sample of Minnesota dairy herds using bacterial culture of pooled fecal samples. Canadian Journal of Veterinary Research 75, Rinaldi L., Coles G.C., Maurelli M.P., Musella V., Cringoli G. (2011). Calibration and diagnostic accuracy of simple flotation, McMaster and FLOTAC for parasite egg counts in sheep. Veterinary Parasitology 177, Rinaldi L., Levecke B., Bosco A., Ianniello D., Pepe P., Charlier J., Cringoli G., Vercruysse J. Comparison of individual and pooled faecal samples in sheep for the assessment of gastrointestinal strongyle infection intensity and anthelmintic drug efficacy using McMaster and Mini-FLOTAC. (ongepubliceerde resultaten). Rovira A., Cano J.P., Muñoz-Zanzi C. (2008). Feasibility of pooled-sample testing for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antibodies on serum samples by ELISA. Veterinary Microbiology 130, Rovira A., Clement T., Christopher-Hennings J., Thompson B., Engle M., Reicks D., Muñoz-Zanzi C. (2007). Evaluation of the sensitivity of reverse-transcription polymerase chain reaction to detect porcine reproductive and respiratory syndrome virus on individual and pooled samples from boars. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 19, Shipitsyna E., Shalepo K., Savicheva A., Unemo M., Domeika M. (2007). Pooling samples: the key to sensitive, specific and cost-effective genetic diagnosis of Chlamydia trachomatis in low-resource countries. Acta Dermato-Venereologica 87, Tavornpanich S., Gardner I.A., Anderson R.J., Shin S., Whitlock R.H., Fyock T., Adaska J.M., Walker R.L., Hietala S.K. (2004). Evaluation of microbial culture of pooled fecal samples for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in large dairy herds. American Journal of Veterinary Research 65, van Schaik G., Pradenas M.F., Mella A.N., Kruze J.V. (2007). Diagnostic validity and costs of pooled fecal samples and individual blood or fecal samples to determine the cow- and herd-status for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Preventive Veterinary Medicine 82, Wallace G.D. (1971). Isolation of Toxoplasma gondii from the feces of naturally infected cats. The Journal of Infectious Diseases 124, Ward M.P., Lyndal-Murphy M., Baldock F.C. (1997). Evaluation of a composite method for counting helminth eggs in cattle faeces. Veterinary Parasitology 73,