De onderstaande aminozuursequentie maakt deel uit van een eiwit dat een rol speelt bij bezuinigingen op onderwijs en onderzoek.

Transcriptie

1 TENTAMEN BIOCHEMIE (8S135) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld :00 17:00 (totaal 100 punten + 5 bonuspunten) 6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! 1 (~30 minuten; 26 punten) In rood zijn de antwoorden aangegeven. N.B. voor sommige vragen zijn ook andere antwoorden mogelijk / goed. De onderstaande aminozuursequentie maakt deel uit van een eiwit dat een rol speelt bij bezuinigingen op onderwijs en onderzoek. a. Geef de 1-lettercode van deze 9 aminozuren in de corresponderende volgorde. (4P) VVDENPVDA b. Bovenstaande aminozuursequentie is onder deel van een loop/ beta-turn in het eiwit. Welk aminozuur uit bovenstaand peptide speelt een cruciale rol in de vorming van de beta-turn en welk aminozuur (die er nu niet in zit) had u eigenlijk ook nog verwacht te vinden in de sequentie. Legt u uw antwoord uit. (4P) De ringstructuur van proline maakt het aminozuur conformationeel minder flexibel en verhindert waterstofbrugvorming zoals noodzakelijk voor alfahelices en beta-sheets. De specifieke conformatie van proline faciliteert de draaiing van de hoofdketen in de loop. Glycine is het kleinste en meest flexibele aminozuur, deze eigenschap faciliteert in grote mate het maken van de compacte turn en voorkomt afstoting van de zijstaarten van aminozuren. c. Teken de moleculaire structuur van een beta-turn bestaande uit minimaal 4 aminozuren en geeft u daarbij het verloop van de waterstofbruggen aan. (4P)

2 d. U wilt onderzoeken of bovenstaand eiwit voorkomt in een bepaald celtype. Hiervoor past u de techniek van Western-Blotting toe. Legt u uit, hoe deze techniek werkt (waarbij u ervan uit mag gaan dat u de eiwitten al met SDS-PAGE gescheiden hebt). Hoe zorgt u ervoor dat u specifiek alleen uw eiwit aankleurt (maw, hoe detecteert u specifiek bovenstaand eiwit en hoe komt u aan het reagens hiervoor)? (4P) Na het scheiden van de eiwitten op grootte dmv SDS-PAGE worden de eiwitten eerst uit de gel overgedragen op een blotpapier (zodat de eiwitten beschikbaar geraken voor het blotten). Vervolgens wordt dit papier met eiwitten erop geïncubeerd met een antilichaam dat specifiek is / selectief bindt aan het eiwit van interesse. Na incubatie en wassen wordt het specifiek gebonden bandje / eiwit gevisualiseerd, bijv. doordat het antilichaam gemerkt / gelabeld was een fluorescente groep of radioactiviteit, of middels een sandwich assay met een gelabeld antilichaam. e. U bent nog steeds gefascineerd door bovenstaand eiwit en u wilt dit eiwit zuiver in handen krijgen. Het blijkt dat het eiwit veel repeterende eenheden van bovenstaande aminozuursequentie bevat. Beschrijf hoe u middels kolomchromatografie uw eiwit zou zuiveren. Gaat u hierbij in op het type kolomchromatografie dat u hiervoor selecteert, verklaart u kort hoe de techniek functioneert en verklaar waarom u de door u gekozen type kolomchromatografie zou gebruiken. (4P) De reperterende eeheid bevat als geladen aminozuur 3 keer een zuur aminozuur en geen basisch aminozuur. Als dit motief vaak in het eiwit terugkomt, betekent dit dat het eiwit dus sterk negatief geladen zal zijn bij physiologische ph. Hiervan kan door middel van ion-exchange chromatografie gebruikt worden gemaakt, meer specifiek anion exchange chromatografie. Hierbij wordt het eiwitmengsel over een positief geladen kolommateriaal geelueerd. Het negatief geladen doeleiwit zal aan het kolommateriaal binden en langzamer elueren als de andere eiwitten. (eventueel vervolgens het eiwit van de kolom af elueren met sterk ionische buffer).

3 Beschouw nogmaals de bovenstaande aminozuursequentie: 1f. U wilt dit peptide enzymatisch knippen/hydrolyseren bij de covalente amide binding aangegeven door de pijl. U heeft hiervoor het DNA van het enzym trypsine tot uw beschikking, welke u genetisch kan veranderen. Welke verandering (aminozuur puntmutatie) voert u door en waar bevindt zich deze verandering in het enzym, zodat het enzym de aminozuursequentie van opgave 1 knipt op de aangeven plek. Legt u uw antwoord uit (4P). Trypsine knipt normaal gesproken na een positief geladen aminozuur (lysine of arginine), omdat trypsine in zijn S1 selectiviteitspocket een negatief geladen aminozuur heeft welke coördineert met de positief geladen zijstaart van K of R. We willen nu knippen na een negatief geladen aminozuur, dus moeten we de S1 pocket zo aanpassen dat daarin een positief geladen aminozuur (bijv. K) voorkomt welke kan coördineren aan de E en daardoor het enzym laten knippen na de E. 1g. Verwacht dat uw nieuwe enzym volledige selectiviteit vertoont voor knippen in de aminozuursequentie alleen op de plek van de pijl? Legt u uw antwoord uit. (2P) Waarschijnlijk zal het enzym ook een bepaalde reactiviteit vertonen na aspartaat (D), omdat deze ook een carboxylaat als zijstaart functionaliteit heeft. Deze is echter korter en zal dus iets minder of beter een ionische interactie aan kunnen gaan met de S1 pocket, afhankelijk daarvan hoe diep deze is.

4 2 (~10 minuten; 14 punten) Nu beschouwen we het enzym trypsine in zijn algemeenheid (dus zonder verdere betrekking op de aminozuursequentie van opgave 1). a. De actieve site van het enzym trypsine bestaat uit een zogenaamde katalytische triade. Beschouw een punt-mutatie in de katalytische triade van trypsine waarbij de aspartaat van de katalytische triade is gemuteerd tot een alanine. Hoe verwacht u dat deze mutatie de maximale omzettingssnelheid (V max ) van trypsine zal beïnvloeden? Verklaar uw antwoord met behulp van een of meerdere tekeningen van de peptidehydrolyse gekatalyseerd door de (gemuteerde) triade. (8P) De katalytische triade bestaat uit een aspartaat, histidine en serine, waarbij de alcohol groep van de serine de uiteindelijke nucleofiel is in de reactie. Deze wordt geactiveerd door polarisatie van de hydroxyl groep middels de histidine. De aspartaat helpt bij het correct positioneren van de histidine en (meest belangrijk) maakt de histidine een betere proton acceptor door waterstofbrug vorming en elektrostatische effecten. Mutatie van de aspartaat tot een alanine, zal dus de activatie / nucleophiliciteit van de serine verlagen. Hierdoor is de serine minder reactief en wordt de kcat verlaagd en daarmee de Vmax (bij gelijk blijvende enzymconcentratie). b. Dezelfde effecten op de kinetiek van het enzym als van bovenstaande puntmutatie kunnen ook verkregen worden met behulp van een trypsine inhibitor. Wat voor type inhibitor leidt tot dezelfde effecten op V max als bovenstaande punt mutatie. Legt u kort uit. (3P) Mutatie verandert niet de affiniteit voor substraat (KM blijft gelijk), maar verlaagd de Vmax. Hetzelfde effect kan veroorzaakt worden door een nietcompetitieve inhibitor. c. Teken een conceptuele dubbel-reciprocale plot (Lineweaver-Burk plot) voor het enzym trypsine in af- en aanwezigheid van deze inhibitor? Geef duidelijk aan wat de assen representeren en welke veranderingen er op treden door de inhibitor. (3P)

5 3 (~20 minuten; 15 punten + 5 punten bonus) Membranen spelen een belangrijke rol in cellen en zijn opgebouwd uit specifieke lipiden en eiwitten. a. De lipiden in membranen ondergaan snelle laterale diffusie, maar langzame transverse diffusie (flip-flop). Lipiden die aan een eiwit vastzitten, zogenaamde GPI (glycosylphosphatidylinositol) ankers, ondergaan echter helemaal geen transverse diffusie. Legt u dit uit. (4P) Om transverse diffusie te ondergaan moet het gehele lipide door het membraan heen, inclusief polaire kopgroep. Dit is energetisch ongunstig, omdat de polaire kopgroep, welke coördineert aan watermoleculen, de watermoleculen los moet laten moet desolvateren. Dit leidt tot een hoge energiebarrière. De additie van een zeer grote polaire kopgroep, zoals in het geval van de GPI, introduceert een additionele nog veel grotere energie barriere, die het onmogelijk maakt om transverse diffusie te ondergaan. b. Een ionkanaaleiwit vergemakkelijkt het transport van ionen over een membraan, maar doet dit alleen voor specifieke ionen. Leg uit hoe een ionkanaal er schematisch uitziet (maak eventueel gebruik van een tekening) en verklaar (op moleculair niveau) hoe deze het transport van ionen over een membraan vergemakkelijkt, terwijl er toch geen water mee door het membraan gaat. Verklaar tevens hoe een ionkanaal selectiviteit voor een specifiek ion, bijvoorbeeld K +, bewerkstelligd. (6P) Een ionkanaal zit volledig door een membraan heen en maakt daarbij contact met zowel de binnen- als de buitenkant van het compartiment. Het ionkanaal heeft 1. een watertunnel waarmee de dikte van het membraan wordt verkleind en 2.een dunner kanaal waarin coördinerende functionele groepen (hetero-atomen) de solvaterende rol van het water overnemen en de ionen op kunnen nemen en transporteren over het membraan. De selectiviteit wordt daarbij bewerkstelligd door de exacte positionering van deze hetero-atomen in relatie tot de ionische radius van het cation (in dit geval K+) welke wordt doorgelaten en het verschaffen van het juiste aantal noodzakelijke coördinerende groepen.

6 c. De biosynthese van ATP (adenosine trifosfaat) gebeurt met behulp van het transmembraaneiwit ATP synthetase. Dit enzym synthetiseert ATP vanuit ADP en P i en heeft in het enzym verschillende bindingstoestanden/affiniteiten voor substraat en product. Welk eiwit dat geïnvolveerd is in DNA replicatie kent u dat ATP als energiebron gebruikt, maar ook gebruik maakt van verschillende bindingstoestanden/affiniteiten voor ATP en zijn hydrolyse producten? (2P) (DNA) Helicase d. Legt u uit wat de overeenkomsten zijn tussen beide enzymen van vraag 3c met betrekking tot de resulterende veranderingen in de enzymen in de verschillende bindingstoestanden. (3P) Beide enzymen zijn hexameren met drie verschillende bindingstoestanden voor ATP/ADP. Omzetting van ATP in ADP en Pi (voor de helicase) of van ADP + Pi in ATP (voor de ATP synthetase) leidt tot conformatie veranderingen in het eiwit, waarbij dus ook de subunits in drie verschillende conformaties voorkomen. Bonusvraag: De Nobelprijs voor de chemie is dit jaar toegekend aan de opheldering van de werking van GPCRs. Waarvoor staat de afkorting GPCR? (2P) Leg kort uit hoe GPCRs hun signalen doorgeven de cel in (ga daarbij ook kort in op de activatie van de eiwitten waaraan GPCRs in de cel binden). (3P) G-Protein Coupled Receptor / G-eiwit gekoppelde receptoren G-eiwitten zitten in het celmembraan en binden een signaalmolecuul aan de buitenkant van de cel. Hierdoor ondergaan ze een conformatie verandering waardoor de aan de binnenkant van de cel voorkomende, en aan de GPCR gebonden, G-eiwitten geactiveerd worden: ze wisselen GDP uit voor GTP. De G-eiwitten activeren vervolgens andere eiwitten totdat ze gedeactiveerd worden door GTP hydrolse.

7 4 (~30 minuten; 20 punten) a. Teken een Watson en Crick basepaar naar keuze. Teken daarbij in ieder geval beide basen en het waterstofbrugpatroon tussen de basen (de suiker mag u dus weglaten). (4P) \ b. Noem tenminste drie enzymen die betrokken zijn bij de replicatie van DNA in de cel en leg uit welke rol deze enzymen hebben / wat ze doen. (6P) bijvoorbeeld (maar meer antwoorden mogelijk): DNA polymerase: adderen de monomeren (dntps) aan de nieuwe DNA keten DNA helicase: trekt de dubbel helix uit elkaar, zodat de enkele strands beschikbaar geraken als templaat Topoisomerase: ontvouwt de supercoiling die ontstaat door de separatie van de DNA dubbel helix c. U wilt het DNA tussen de twee hieronder getoonde sequenties amplificeren met behulp van PCR. Kies uit de lijst van acht primers, welk paar u hiervoor nodig heeft. (4P) 3 -GACCTGTGGAAGC CATACGGGATTGA-5 5 -CTGGACACCTTCG GTATGCCCTAACT-3 1) 5 -GACCTGTGGAAGC-3 5) 5 -CATACGGGATTGA-3 2) 5 -GTATGCCCTAACT-3 6) 5 -CTGGACACCTTCG-3 3) 5 -AGTTAGGGCATAC-3 7) 5 -CGAAGGTGTCCAG-3 4) 5 -GCTTCCACAGGTC-3 8) 5 -TCAATCCCGTATG-3 3, 6

8 d. Beschrijf het principe van de PCR aan de hand van de amplificatie van een specifiek stukje dubbelstrengs DNA uit een chromosoom tijdens de eerste en tweede cyclus. Geef hierbij de karakteristieken van iedere stap aan (wat gebeurt er, wat reageert er, en waarom wordt een bepaalde temperatuur gekozen), en laat duidelijk zien welke producten er in iedere stap worden gevormd. (6P) Verwarm tot 95 graden om het dubbelstrengs DNA te smelten Bij 55 graden equilibreren om de primers te laten binden Bij de optimale temperatuur voor de DNA polymerase, ca 72 graden, de templaatreactie starten, primers worden verlengd. Proces nog een keer herhalen leidt tot onderstaande produchten. T~ 55 C T~ 75 C T~ 95 C

9 5 (~15 minuten; 10 punten) a. Uw collega-student(e) amplificeert een stuk eukaryotisch DNA coderend voor een bepaald eiwit met de Polymerase Chain Reaction (PCR) en gebruikt daarvoor direct eukaryotische DNA als templaat. Hij/zij brengt dit geamplificeerde DNA in een plasmide en gebruikt deze voor eiwitexpressie in bacteriën. Tot zijn/haar verbazing leidt deze aanpak echter niet tot een correcte expressie/synthese van het betreffende eiwit in de bacteriën. U bent niet verbaasd. Legt u uit waarom deze aanpak niet heeft gefunctioneerd. (5P) Eukaryotische genen zijn opgebouwd uit intronen en exonen. Deze intronen worden normaal gesproken verwijderd uit het mrna en alleen de exonen coderen voor het uiteindelijke eiwit. Dit proces heet mrna splicing. Prokaryoten kennen geen intronen en hebben het DNA voor de eiwitten continu gecodeerd. Dientengevolge bezitten prokaryoten ook niet de moleculaire componenten voor het splicing proces. Het inbrengen van eukaryotisch DNA leidt daarom tot een mrna waarin zich ook intron genetische informatie bevindt die bij translatie leidt tot een onzin eiwit / terminatie dmv stopcodons. b. Wat is volgens u dan de beste manier om een eukaryotisch gen tot expressie te brengen in een bacterie? Met andere woorden, beschrijf de verschillende stappen die nodig zijn om vanuit eukaryotisch DNA een recombinant plasmide te maken welke tot functionele eiwitexpressie in bacteriën leidt. (5P) Beschrijf onderstaand proces:

10 6 (~20 minuten;15 punten) a. Veronderstel dat u een stuk DNA behandeld met een chemisch mutageen (een stof die leidt tot mutaties in het DNA). U vindt dat in het uiteindelijke eiwit dan een proline op een specifieke positie gemuteerd wordt tot een leucine of een serine. Verder behandelen met het mutageen leidt tot een phenylalanine op deze positie in het eiwit (zie schema hieronder). Pro Ser/Leu Phe Verklaart u de gevonden mutaties aan de hand van een voorstel voor mogelijke codons die coderen voor deze vier aminozuren. (3P) Als Pro door CCC wordt gecodeerd leidt een mutatie tot CUC (Leu) of UCC (Ser), een volgende mutatie in beiden leidt tot UUC (Phe) of, Als Pro door CCU wordt gecodeerd leidt een mutatie tot CUU (Leu) of UCU (Ser), een volgende mutatie in beiden leidt tot UUU (Phe) b. Transfer RNAs (trnas) zijn noodzakelijk voor de eiwitsynthese. Noem drie verschillende biomoleculen welke in de cel kunnen binden /een interactie aan gaan met trna moleculen en geef van ieder van deze componenten kort aan hoe ze aan trna binden en wat hun rol is. (6P) Bijvoorbeeld: trna synthetase: herkent de specifieke trna en belaadt deze met een aminozuur EF-Tu: bindt aan beladen trna, voorkomt vroegtijdige hydrolyse van de amino acyl binding en transporteert de trna naar het ribosoom (alwaar deze het trna loslaat onder hydrolyse van GTP). Ribosoom: bindt aan trna in drie verschillende toestanden en zorgt voor de overdracht van de groeiende peptideketen op een trna.

11 c. Een trna welke met een verkeerd aminozuur beladen is wordt toch zonder problemen geprocesseerd door het ribosoom en het verkeerde aminozuur wordt probleemloos ingebouwd in de groeiende peptideketen. Legt u uit waardoor dit komt. (2P) Het ribosoom heeft geen controle mechanisme om te kijken of het anticodon overeenkomt met het aminozuur. Het uitlezen van de codons en de eiwitsynthese zijn in het ribosoom ontkoppeld. Deze koppeling wordt alleen gemaakt door het trna waar zowel het anti-codon als het aminozuur aan vast zitten. Maw, na beladen van het trna met het aminozuur, is er geen controlemechanisme meer. d. Maak de link. Geef aan welke moleculaire componenten in de linker kolom horen bij welk proces in de rechter kolom. (4P) 1. RNA polymerase a) Replicatie 2. DNA polymerase b) Transcriptie 3. Ribosome c) Translatie 4. dntp 5. NTP 6. trna 7. mrna 8. rrna 9. RNA primer 10. promoter a) 2, 4, 9 b) 1, 5, 10 c) 3, 6, 7, 8