1 Peptiden en eiwitten (~20 minuten; 20 punten)

Transcriptie

1 1 Peptiden en eiwitten (~20 minuten; 20 punten) a. Beschouw bovenstaand peptide, recent van ons heengegaan. Geef de 1-lettercode van de aminozuren in dit peptide.(2p) PRINCE b. Bovenstaande aminozuursequentie is afgebeeld in niet-geïoniseerde vorm. Wat is echter de netto lading van dit peptide bij een fysiologische ph 7? (2P) 0; Pro +1; Arg +1; Glu -2 = 0 c. Bovenstaand peptide wordt behandeld met het enzym chymotrypsine. Wat verwacht u dat er gebeurt? (2P) Niks; dit peptide is geen substaat voor chymotrypsine d. Het peptide vouwt in een -helix. Schets schematisch het waterstofbruggenpatroon van een -helix (u mag in de tekening de zijstaarten weg laten). (4P)

2 d. De peptidesequentie van vraag 1a blijkt een veelvoorkomend onderdeel van het eiwit keratine in haar, maar dan meestal wel in geoxideerde toestand (cystine in plaats van cysteine). Na uw ingenieursstudie besluit u een kapsalon te beginnen (u was niet zo goed in de vakken, maar excelleerde in de skills ). U gaat met uw biochemiekennis over deze peptidesequentie een permanent(je) zetten bij een klant met lang stijl haar, die graag krullen wil. Wat voor type chemische reacties doet u op het haar van uw klant (eventueel met behulp van krulspelden), en waarom? (4P) U maakt gebruikt van de cysteine in de peptide sequentie. Deze kan namelijk intermoleculaire dissulfide bindingen vormen. Deze covalente bindingen verstevigen de structuur van eiwitten en eiwitassemblages. In het geval van een permanent moeten eerst de bestaande dissulfide bindingen worden verbroken dmv reductie, waarna het haar opnieuw gestyled kan worden en de dissulfide bindingen opnieuw vastgelegd worden dmv oxidatie. e. Uw werk in de kapsalon is sociaal zeer bevredigend, maar u wilt toch wat meer wetenschappelijke uitdaging. U gaat daarom samples nemen van de hoofdhuid van uw nietsvermoedende klanten. U isoleert de eiwitten uit het sample en analyseert deze met behulp van SDS-PAGE. Legt u in een paar zinnen uit, hoe SDS-PAGE werkt. Verklaart u daarbij ook op welk principe de scheiding van de eiwitten baseert. (4P) SDS-PAGE scheidt eiwitten op basis van grootte. Eiwitten worden gedenatureerd met behulp van SDS (waarbij er gemiddeld 1 SDS molecuul aan 2 aminozuren in het eiwit bindt). Hiermee krijgt het eiwit een overall negatieve lading. De eiwitten worden opgebracht op een (polyacrylamide) gel en dmv gel electrophorese door de gel heen getrokken. Ieder eiwit ondervindt gemiddeld dezelfde kracht omdat de lading correleert met de grootte van het eiwit, maar omdat de gel vernet is lopen de kleinere eiwitten er sneller doorheen. f. U blijkt toch niet de nieuwe Rob Peetoom te zijn (voor de kalende mannen onder u: bekende kapper) en u heeft additionele inkomsten nodig. U besluit daarom uw heimelijke experiment te gelde te maken en aan te bieden als een testmethode voor detectie van hoofdhuidschimmel. U detecteert hierbij via Western-Blotting de aanwezigheid van een eiwit van de schimmel. Hiervoor heeft u een antilichaam nodig. Leg dit uit. (2P) Na het scheiden van de eiwitten op grootte dmv SDS-PAGE moet u specifiek uw eiwit visualiseren. Hiervoor heeft u een antilichaam nodig dat specifiek aan uw eiwit bindt en tevens een moleculaire marker bevat welke gevisualiseerd kan worden.

3 2 Enzymactiviteit (~30 minuten; 20 punten) a. Restrictie-enzymen binden ongeveer even sterk aan DNA sequenties welke ze niet knippen als aan DNA sequenties welke ze wel knippen. Verklaart u deze paradox. Gaat u in uw antwoord in op de interactie tussen van het enzym met het DNA en de vorm van het substraat en daaraan gerelateerde vrije energie. (5P) De daling van de vrije energie bij binding van een te knippen DNA sequentie is groter dan bij een niet te knippen sequentie. De totale daling van de vrije energie is echter minder, vanwege de energetisch ongunstige verstoring van de DNA dubbel helix (kink). Door deze verstoring van de dubbel helix, komt de backbone van het DNA echter terecht in de actieve site van het enzym en kan de hydrolyse reactie plaats vinden. Bij de niet te knippen DNA sequenties ligt de backbone te ver weg van de actieve site en wordt daardoor niet geknipt. b. Proteasen hebben meestal meerdere soorten van posities / pockets / plekken welke allen een andere rol spelen in het proces van peptide binding hydrolyse. Noem twee van dit soort protease onderdelen (met een verschillende functie) en leg in 1-2 zinnen uit wat de rol/functie is van deze onderdelen en hoe ze functioneren. (4P) -Selectiviteitspockets: zorgen voor de selectieve herkenning van de substraten. Dit doen ze door secundaire interacties aan te gaan met de aminozuurzijstaarten rondom de te knippen binding. -Oxyanion gat: dit onderdeel zorgt voor de stabilisatie van de (tetraedische) overgangstoestand(en) van de hydrolyse reactie. Dit doet het door het oxyanion te coördineren middels H-proton gebonden aan heteroatomen (met de delta plus lading). -Reactive site: op deze plek vind de eigenlijke hydrolysereactie plaats. Dit gebeurt door het activeren van een nucleofiel (of meerdere) (uiteindelijk water) en eventueel ook electrofiel. c. De Michaelis-Menten vergelijking is: V 0 = V max ([S]/([S] + K M )) Benoem alle parameters (2P): V 0 = Initial velocity V max = [S] = K M = Maximum velocity Substrate concentration Michaelisconstante

4 d. U voert een enzymreactie uit bij verschillende substraatconcentraties in af- en aanwezigheid van een inhibitor (zie tabel) Bepaal K M en V max voor dit enzym in af- en aanwezigheid van de inhibitor. (6P) Substraatconcentratie [S] ( M) Initiële snelheid (V 0 ) ( mol/minuut) Geen inhibitor Met inhibitor Zonder inhibitor: Vmax = 47.6 mol/min en K M = 1.1x10-5 M Met inhibitor: Vmax = 47.6 mol/min en K M =3.1x10-5 M e. Welke type inhibitie is dit? (2P) Competitief f.hoe noemen we de rechte lijn kinetische plot van 1/ V 0 versus 1/S? (1P) Lineweaver-Burk plot of double-reciprocal plot

5 3 Membranen en hun eiwitten (~20 minuten; 20 punten) a. Wat is de typische configuratie van onverzadigde dubbele bindingen in de vetzuurstaarten van phospholipiden? Leg tevens uit waarom dat belangrijk is voor de eigenschappen van cellulaire membranen. (4P). Cis. Trans-dubbele bindingen hebben ongeveer dezelfde lineaire conformatie als een verzadigde alkylstaart en zullen daarmee weinig invloed hebben op de eigenschappen van een membraan (en daarmee relatief nutteloos). Cis-dubbele bindingen hebben een gekinkte/gebogen conformatie welke de pakking van de vetzuurstaarten in het membraan verstoord en daarmee de fluïditeit van het membraan controleert. b. We kennen transmembraaneiwitten en perifere membraaneiwitten. Beschrijf twee verschillende moleculaire manieren hoe eiwitten perifeer aan membranen kunnen binden. Ga in uw antwoord in op de onderliggende non-covalente interacties. (4P) Bijv. -Gelipideerde eiwitten. Een covalent gebonden lipide groep (of meerdere) zit middels hydrophobe interacties in het membraan. -Middels ionische lading tussen het positief geladen eiwit en de negatief geladen kopgroepen van de lipiden -Middels hydrophobe structuur elementen van de eiwitten (e.g. alfa-helix) welke (gedeeltelijk) inserteren in het hydrophobe deel van het membraan. -Middels binding (ionisch, selectief, etc.) aan andere membraaneiwitten (vaak transmembraan). c. Prince Rogers Nelson is afgelopen april gestorven door een overdosis van het medicijn fentanyl, een morfinomimeticum. Fentanyl is een agonist voor de μ-opioid receptoren, een klasse van GPCRs, en stimuleert dus de daarop volgende signaalcascade. Welke chemische verandering vindt er plaats in -subunit van de trimere G-eiwitten in de cel, na stimulatie van de overeenkomstige GPCR met fentanyl? (2P) De -subunit zal GDP uitwisselen voor GTP.

6 d. De biosynthese van ATP (adenosine trifosfaat) gebeurt met behulp van het eiwit ATP synthetase. Leg uit hoe dit enzym ATP synthetiseert. Geef daarbij aan: -hoe de ATP synthetase opgebouwd is -het reactiemechanisme van de ATP synthese (geef de reactievergelijking en beschrijf hoe deze reactie in het enzym afloopt) -hoe de ATP synthetase werkt. (6P) -Beschrijving van structuur van ATP synthetase. Belangrijke punten: transmembraaneiwit; centrale deel in membraan draait rond onder stroom van protonen naar binnen doet. Dit induceert conformatie veranderingen in domeinen aan de binnenkant van de mitchondrieen, wat leidt tot het bij elkaar brengen van Pi en ADP en daardoor het overkomen van de overgangstoestand. Beschrijf onderstaande figuren (of teken) en ga in op de 3 bindingstoestanden, aangestuurd door de rotor/ring welke ronddraait aangedreven door de proton flow de cel in. De hexamere ring van eiwitdomeinen (met 3-voudige rotationele symmetrie) heeft 3 verschillende bindingstoestanden/affiniteiten voor ATP en ADP + Pi hebben en waarbij deze verschillende affiniteiten gekoppeld zijn aan conformatieveranderingen in de domeinen. ADP + Pi ATP e. Een ionkanaal bestaat uit twee karakteristieke elementen welke het transport van ionen over membranen vergemakkelijken en selectief maken. Beschrijft deze twee elementen en leg kort uit hoe ze werken. (4P) -Een ionkanaal vormt een waterkanaal waarmee een groot gedeelte van de lipidbilaag wordt overspannen. Op deze manier vergemakkelijkt het ionkanaal het iontransport: het maakt het membraan als het ware dunner. -Het ionkanaal heeft een selectiviteitsfilter waarmee het selectief een / bepaalde type van ionen solvateert en daarmee de rol van het water overneemt en door kan laten. Op deze manier is er dus selectief transport van alleen de ionen die worden opgelost door de selectiviteitsfilter.

7 4 Over DNA (~15 minuten; 10 punten) a. Teken het Watson-Crick basepaar Adenine-Thymine. Geef in uw tekening ook duidelijke de waterstofbruggen aan tussen de basen. U hoeft niet de suiker te tekenen, maar geef wel aan waar deze aan de basen zit (bijv. door een R). (5P) b. Beschrijf in een paar woorden het driestaps proces van de relaxatie van DNA supercoiling door een type I topoisomerase. (2P) 1) Only one strand of DNA is cleaved via a reaction of the enzyme with the phosphate ester backbone (tyrosine of TopI). 2) The cleaved DNA strand rotates around the other strand, thus unwinding the supercoils. 3) The DNA break is resealed (making again the same phosphate ester). c. Voor de bepaling van de basenvolgorde van DNA wordt vaak de Sanger sequencing methode gebruikt. Beschrijf in een aantal zinnen het principe van Sanger sequencing. (3P) Sanger sequencing is based upon replication of DNA under conditions in which the chain is terminated by controlled interruption, resulting in various sizes of DNA fragments. By including limited amounts of radioactive bases, strands differing by one base in length can be observed. By reading the bands, the sequence can be determined. (Fluorescent or dye tags can also be used in an automated process.)

8 5 Over RNA (~20 minuten; 15 punten) a. Geef twee functionele verschillen tussen de RNA polymerase en de DNA polymerase. (4P) e.g. -RNA polymerase heeft geen primer nodig om te kunnen beginnen met de synthese -RNA polymerase heeft geen proofreading functionaliteit b. U wilt RNA, maar niet DNA, radioactief labelen in groeiende en zich delende bacteriën. Welk radioactief molecuul doet u bij het groeimedium? (2P) Radioactief (bijvoorbeeld tritium gelabeld) uracil of uridine. (Ribose evt. ook goed) c. Onderstaand stukje dubbelstrengs DNA maakt deel uit van een groter gen en heeft een mis-match basepaar (vetgedrukt). Dit stukje DNA wordt uitgelezen en omgezet in RNA door de RNA polymerase. Wat is de resulterende RNA sequentie (geef ook de 5 en 3 uiteinden aan). (4P) Coderende keten 5 -GGATACTTACAGCCAT-3 3 -CCTATGAATATCGGTA-5 Templaat keten 5 -GGAUACUUAUAGCCAU-3 d. Er zijn verschillende soorten RNA moleculen. Suggereer een scheidingsmethode om al het mrna te scheiden van de andere typen RNA die voorkomen in een eukaryotische cel. Legt u in uw antwoord kort de stappen van deze methode uit. (5P) mrna onderscheidt zich van andere typen RNA doordat alle mrna een lange 3 poly A sequentie hebben. Deze poly A sequentie kan specifiek hybridiseren aan een poly T / poly dt sequentie, iets wat de andere RNAs niet kunnen. We immobiliseren dus een poly T sequentie op een vaste drager (polymere beads bijvoorbeeld) en incuberen ons RNA hiermee. Wegwassen van de niet gebonden RNAs en elutie (bijvoorbeeld door verandering van temperatuur of ph/zout concentratie) geeft de mrnas.

9 6 Van RNA naar eiwit (~20 minuten; 15 punten) a. De aminoacyl-trna synthetase enzymen katalyseren twee reacties. Welke zijn dit? (4P) 1. De vorming van het aminoacyl adenylaat (Activatie van de C-terminus van het aminozuur tot een actieve ester) 2. Reactie van lege trna met aminoacyl adenylaat tot aminoacyl-trna (De belading van het lege trna met een aminozuur. b. Aminoacyl-tRNA synthetasen hebben een ingenieus systeem om ervoor te zorgen dat alleen de aminozuren van het juiste formaat aan de overeenkomstige trna worden gezet. Legt u dit kort uit. (4P) The activation site rejects amino acids that are too large, whereas amino acids that are too small are hydrolyzed off of the trna in the hydrolytic editing site. c. Welke rol speelt het aminozuur zelf in de correcte plaatsing van de beladen trna op het overeenkomstige codon? (2P) None. (Experiments have demonstrated that the amino acid plays a largely negligible role in recognition of charged trnas. The anticodon-codon interactions are principally responsible for properly charged trna selection.)

10 d. Een collega studente vertelt u dat zij in patiëntmateriaal een nieuwe mutatie in hemoglobine heeft gevonden waarbij een lysine is vervangen door een histidine. U glimlacht minzaam en vertelt uw collega dit hoogst onwaarschijnlijk te vinden. Legt u uit waarom deze mutatie onwaarschijnlijk is. (3P). Voor een mutatie van lysine tot histidine, moeten er minimaal twee mutaties in het DNA plaats vinden. (de codons verschillen minimaal twee basen). De kans dat zoiets evolutionair gebeurd (toeval) is heel erg klein. (Dit zou moeten verlopen via een ander aminozuur welke als intermediair tijdens de evolutie in (een subpopulatie) van dezelfde soort is ontstaan. Zeer onwaarschijnlijk gegeven de evolutionaire druk.) e. De twee basismechanismen voor de verlenging van biomoleculen zijn weergegeven in de figuur rechts, waarbij X de activerende groep is welke verwijderd wordt uit het eindproduct. Welk mechanisme (Type 1 of 2) vind in de cel plaats bij: (2P) i DNA synthese ii RNA synthese iii Eiwit synthese Type 1: iii Type 2: i, ii Bonusvraag (~1 minuut; max. 5 punten extra) Welke Nobelprijs winnaar voor de Chemie uit 1993 is dol op surfen en de PCR? Kary Mullis