Naam: Studentnummer: Opleiding:..

Transcriptie

1 EINDTETS Biochemie (8RA00) en TENTAMEN Biochemie (8S135) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld :00 12:00 (totaal 100 punten, plus max. 5 extra voor bonus) 6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! Geef uw antwoorden direct op dit tentamen. In principe volstaat de gegeven ruimte; gebruik indien nodig de achterkant van de specifieke opgave. Schrijf naam en studentnummer bovenaan iedere pagina! 1 Peptiden en eiwitten (~25 minuten; 20 punten) Een biochemicus, tevens heavy metal aficionado, ontdekt in een Engels slachthuis een nieuw peptide en stelt vast dat de moleculaire structuur eruit ziet zoals onderstaand. a. Geef de 1-lettercode van de aminozuren in het peptide in de corresponderende volgorde. (4P) CARCASS b. Een gedeelte van bovenstaand peptide blijkt ook te kunnen cycliseren, afhankelijk van de externe omstandigheden; buiten de cel is het peptide cyclisch en binnen de cel niet. Legt u uit hoe deze twee toestanden tot stand komen. Gaat u daarbij in op de aminozuren die hier een cruciale rol spelen en via welk mechanisme dit gebeurt. (4P) De redox toestand van de omgeving bepaald de toestand van het peptide (binnen de cel reductief, buiten de cel oxidatief). Door de veranderende redox omgeving wordt er een zwavelbrug tussen de twee cysteines in het peptide gevormd en verbroken. Als de zwavelbrug / disulfidebrug gevormd wordt ontstaat een cyclisch peptide. In gereduceerde toestand (zoals getekend) is het peptide lineair.

2 c. U behandelt bovenstaand peptide met een enzym dat peptide bindingen direct na een arginine hydrolyseert. Het blijkt dat dit enzym de lineaire vorm van het peptide veel sneller omzet dan de cyclische vorm. Verklaart u deze observatie en gaat u daarbij in op de herkenning en binding van het peptide door het enzym. (4P) Het enzym hydrolyseert peptide bindingen direct C-terminaal van de arginine. De arginine ligt precies in het gedeelte van het peptide dat een substantiële conformatie verandering ondergaat na cyclisatie. De binding van het substraat (het peptide) door het enzym gaat door middel van de binding aan de zijstaarten van de omliggende aminozuren in de specificiteitspockets (S pockets) van het enzym. Het vouwen in een cyclische vorm zorgt blijkbaar voor een oriëntering van de peptide zijstaarten (en/of backbone) welke niet compatibel is met de positionering van de S pockets van het enzym. Hierdoor is de vorming van het enzym substraat complex sterk verlaagd en daarmee de omzettingssnelheid / kcat. d. SDS-PAGE en SEC (size exclusion chromatography ook wel gel-filtratie chromatografie genoemd) zijn alle twee scheidingsmethoden die scheiden op basis van grote. Conceptueel verschillen de twee methoden echter sterk; bij SDS-PAGE lopen de kleinste moleculen het snelst door het scheidingmateriaal, terwijl bij SEC juist de grote moleculen het snelst door het scheidingsmateriaal lopen. Legt u dit verschil uit door in te gaan op het fundamentele scheidingsmechanisme van beide technieken. (4P) Bij SDS-PAGE worden de moleculen (typisch eiwitten) door een vernet / gecrosslinkt polymeernetwerk getrokken door middel van een elektrisch veld (electrophorese). Kleinere moleculen diffunderen makkelijker door een polymeernetwerk dan grote moleculen en lopen dus sneller door het scheidingsmateriaal. Bij SEC vloeien de moleculen door een scheidingsmateriaal bestaande uit poreuze polymeerbolletjes. Kleine moleculen diffunderen makkelijker en dieper in de poreuze bolletjes en worden daardoor vertraagd. Grote moleculen passen niet of minder goed in de poreuze bolletjes en lopen dus met het vloeistof front mee naar beneden zonder vertraging.

3 e. Een mutatie in de binnenkant van een eiwit waarbij een glycine residue in een valine gemuteerd is leidt tot een verkeerd gevouwen eiwit. Echter, het eiwit vouwt weer correct, als op een nabijgelegen positie een isoleucine in een alanine verandert. Legt u uit hoe uws inziens deze tweede mutatie leidt tot het terugkeren van de capaciteit van het eiwit om correct te vouwen. (4P) De eerste mutatie verhindert het correct vouwen van het eiwit omdat een valine meer plek inneemt dan een glycine (en daarom moet het eiwit een andere vorm / conformatie aannemen). De tweede mutatie herstelt de vouwing, door een compensatie van het volume dat aan de binnenkant van het eiwit moet worden opgevuld; alanine is kleiner dan isoleucine.

4 2 Enzymactiviteit (~25 minuten; 20 punten) a. Vul de ontbrekende term in op de stippellijn. (5P) i. Enzymen versnellen de reactiesnelheid door de van de reactie te verlagen. activeringsenergie ii. Een reactie kan alleen spontaan verlopen als ΔG is. negatief iii. Een. inhibitor heeft vaak een moleculaire structuur die overeenkomt met het substraat en bindt vaak reversibel aan de actieve site van het enzym. competitieve iv. In trypsine bevat de S1 specificiteitspocket een welke een interactie aangaat met een lysine of arginine aminozuur van het substraat. Aspartaat (eventueel glutamaat of negatief geladen aminozuur ook goed rekenen). v. In een serine protease wordt de tetraëdrische overgangstoestand gestabiliseerd in het.. xyanion gat. b. Hoe kan er kinetisch onderscheid worden gemaakt tussen competitieve en noncompetitieve inhibitie? In andere woorden, leg in twee korte zinnen uit hoe de twee vormen van inhibitie de kinetiek van de reactie beïnvloeden. (4P) Competitieve inhibitie vergroot de (apparent) K M (en niet Vmax). (De competitieve inhibitie kan overkomen worden door de aanwezigheid van een grote hoeveelheid substraat) Noncompetitieve inhibitie verlaagd de Vmax (en niet K M ). (De noncompetitieve inhibitor vormt een inactief EI complex, waaraan het substraat nog wel kan binden, maar niet door omgezet wordt). c. Welk nucleofiel wordt door zowel serine-, cysteine-, metallo-, als aspartylproteasen geactiveerd? (3P) Water / H 2

5 d. Beschrijf in een paar zinnen wat overgangstoestand analoga (transition state analogs) zijn en waarom deze verbindingen goede inhibitoren (remmers) kunnen zijn van enzymen. (4P) vergangstoestand analoga lijken qua structuur (maar niet qua reactiviteit) heel erg op de overgangstoestand zoals deze optreedt in het katalytische proces. Deze analoga binden zeer sterk in de katalytische site, omdat een enzym per definitie een hoge affiniteit heeft voor de overgangstoestand (want daarmee wordt de activeringsenergie van de reactie verlaagd). Door deze hoge affiniteit (en door hun afwezige reactiviteit) zijn het goede inhibitoren. e. Een enzymatische reactie wordt doorgevoerd bij verschillende substraatconcentraties en de initiële snelheid van substraatomzetting wordt bij de verschillende substraatconcentraties bepaald (zie tabel). Bereken/bepaal K M en V max voor dit enzym. U mag hiervoor het voorgedrukte grafiek element gebruiken. (4P) Substraatconcentratie [S] ( M) Initiële snelheid (V 0 ) ( mol/minuut) /K M ~ M -1 K M = 33 M 1/V max ~ 0.02 minuut/ mol V max = 50 mol/minuut

6 3 Membranen en hun eiwitten (~20 minuten; 15 punten) a. Teken de dwarsdoorsnede van een micel en van een membraanbilaag waarin u schematisch laat zien hoe de individuele moleculen hierin georiënteerd zitten en verklaart u kort uw tekening (waarom zitten de moleculen zo georiënteerd als door u getekend). (5P) Micel Bilaag De twee alkyl-/vetzuurstaarten van de phospholipide geven het molecuul de vorm van een staafje (in plaats van een conus/kegel vorm zoals bij een vetzuur welke een micel vormt) waardoor de pakking van het phospholipide in een bilaag optimaal is (en niet past in een micel met een erg hoge ronding).

7 b. Sommige transmembraaneiwitten overspannen middels een enkele alfa-helix het celmembraan. Zou een alfa-helix bestaande uit enkel leucines of een alfa-helix bestaande uit enkel asparagines hiervoor het meest geschikt zijn? Leg uw antwoord uit. (5P) De alfa-helix bestaande uit enkel leucines. In een alfa-helix zitten de polaire amide-bindingen van de hoofdketen aan de binnenkant van de helix en de zijstaarten van de aminozuren steken naar buiten. Deze zijstaarten bepalen dus het karakter van de helix en zijn in contact met de hydrofobe omgeving van het membraan. Leucine, met een apolaire zijstaart, gaat dus energetisch gunstige interacties aan met het membraan en asparagine, met een polaire zijstaart, niet. c. De biosynthese van ATP gebeurt met behulp van het transmembraaneiwit ATP synthase. Qua structuur en werkingsmechanisme vertoont de ATP synthase grote overeenkomsten met het eiwit DNA helicase. Beschrijft u deze conceptuele overeenkomst zo precies mogelijk. (5P) Beide eiwitten/enzymen bevatten een hexamere ring van eiwitdomeinen (met 3-voudige rotationele symmetrie) welke 3 verschillende bindingstoestanden/affiniteiten voor ATP en ADP + P i hebben en waarbij deze verschillende affiniteiten gekoppeld zijn aan conformatieveranderingen in de domeinen. De functionaliteit van beide eiwitten komt tot uiting door deze conformatieveranderingen geïnduceerd door de 3 verschillende bindingstoestanden voor ATP en ADP + P i. (niet gevraagd) In het geval van de DNA helicase wordt dubbelstrengs DNA uit elkaar getrokken door de conformatieveranderingen onder consumptie van ATP, terwijl bij de ATP synthase de conformatieveranderingen (geïnduceerd door de proton gradiënt) de synthese van ATP bewerkstelligen.

8 4 ver DNA (~20 minuten; 15 punten) a. Teken de repeterende moleculaire eenheid van de hoofdketen (backbone) van DNA (u mag de structuur van de base dus weglaten, geef echter wel aan waar deze zich op de hoofdketen bevindt). Laat in de tekening duidelijk zien hoe de monomeren aan elkaar verbonden zitten. (6P) Base CH 2 H P Base CH 2 H P b. DNA replicatie kan eenvoudig in een reageerbuis in een biochemisch lab gedaan worden met behulp van de zogenaamde polymerase chain reaction (PCR). Welke moleculaire componenten (reagentia, katalysator, etc.) heeft u nodig om deze reactie te kunnen doorvoeren? (3P) -DNA (dubbelstrengs, maar kan eventueel ook enkelstrengs zijn) -(DNA) primers -alle vier de deoxyribonucleoside triphosphaten (datp, dctp, dgtp, (d)ttp) -een warmte stabiele DNA polymerase (-Mg2 + )

9 c. Bij de replicatie van DNA in cellen is naast DNA polymerase ook een RNA polymerase nodig (ook wel primase genoemd). Leg uit waarom dit zo is. Met andere woorden, wat is de rol van de RNA polymerase in het DNA replicatie proces? (3P) DNA polymerase kan niet uit het niets beginnen met de synthese van een oligonucleotide op een templaat. De DNA polymerase heeft een beginpunt / een bestaande keten met een vrije 3 H groep nodig, gehybridiseerd op het templaat, welke hij kan verlengen met nieuwe dexoyribonucleotiden. De RNA polymerase maakt dit beginstukje / primer voor de DNA polymerase. d. Topoisomerase inhibitoren worden gebruikt voor de behandeling van sommige kankers. Legt u uit waarop dit principe zich baseert. (3P) Tijdens de replicatie van DNA wordt het dubbelstrengs DNA uit elkaar getrokken tot enkelstrengs DNA (met de DNA helicase). Hierdoor ontstaat er in het daarvoor liggende dubbelstrengs DNA supercoiling. Topoisomerases heffen deze supercoiling op door het gespannen DNA te ontspannen door de extra ingebrachte draaiingen terug te brengen. Zouden de topoisomerases dit niet doen, dan zou dit leiden tot een knoop van DNA, waardoor de separatie van de twee strengen stopt, de ketens breken en de cellen dood gaan. Door topoisomerases te blokkeren middels de topoisomerase inhibitoren wordt cel deling dus geblokkeerd en zullen de cellen apoptose ondergaan.

10 5 Van DNA naar RNA (~10 minuten; 10 punten) a. Vergelijk DNA polymerase met RNA polymerase met betrekking tot de volgende eigenschappen: (met andere woorden hoe komen ze overeen en hoe verschillen ze) (4P) i) Monomeer (substraat) ii) Richting van nucleïnezuur synthese iii) Nauwkeurigheid iv) Noodzaak voor een primer i) DNA verwerkt deoxyribonucleotiden; RNA verwerkt ribonucleotiden ii) Beiden van 5 3 richting iii) DNA polymerase werkt met een hogere nauwkeurigheid dan de RNA polymerase (door het additionele editing systeem) iv) DNA polymerase (I) heeft een primer nodig; RNA polymerase niet. b. We kennen verschillende soorten RNA moleculen. Beschrijf kort wat mrna, trna en rrna zijn, wat voor structuur ze vormen en wat hun rol is. (6P) mrna is messenger RNA, een lineair ongevouwen keten; het resultaat van de transcriptie van een DNA gen in RNA. mrna is de drager van de genetische informatie die uitgelezen moet worden en getranslateerd in eiwit moleculen, het templaat voor eiwit synthese. trna is transfer RNA en draagt een geactiveerd aminozuur (in relatie met een anticodon) en brengt dit naar het ribosoom om ingebouwd te worden in de groeiende eiwitketen. trna s zijn relatief klein (75 nucleotiden) en hebben een klaverblad structuur met een gecontroleerde afstand tussen anticodon en aminozuur om zo universeel door het ribosoom geprocesseerd te worden. Ieder aminozuur heeft zijn eigen trna(s). rrna is ribosomaal RNA en de hoofdcomponent van het ribosoom (samen met eiwitten). Er zijn een aantal verschillende rrna moleculen die gezamenlijk en met de eiwitten de kleine en grote subunit van het ribosoom vormen. Hierin speelt het rrna een katalytische rol.

11 6 Van RNA naar eiwit (~20 minuten; 20 punten) a. Geef een mogelijke nucleotide sequentie voor de coderende DNA streng van onderstaande peptide sequentie. Geef daarbij aan waar zich de 5 en 3 uiteinden bevinden. (5P) Lys-Trp-Pro-Val 5 -AA(A/G)TGGCCNGTN-3 N is iedere DNA base b. Waarom is een enkele (single) nucleotide deletie of insertie in een gen potentieel dodelijk? (5P) Er zit geen punctuatie in de genetische code; deze wordt continue uitgelezen vanaf het startcodon. Iedere set van 3 basen codeert voor 1 aminozuur in de eiwit sequentie. ok als er dus slechts 1 base minder of meer is leidt dit tot een compleet andere set van codes (alle daaropvolgende basen worden als het ware 1 positie opgeschoven), wat resulteert in een nonsens sequentie en een nonfunctioneel eiwit. Als dit eiwit kritisch belangrijk is (wat veel meeste eiwitten zijn), dan leidt dit dus tot een non-functioneel organisme.

12 c. Aminoacyl-tRNA synthetasen zijn de enige component in het hele proces van de genexpressie welke de genetische code decoderen. Legt u dit uit. (4P) Deze enzymen lezen het trna anticodon uit en beladen het trna met het overeenkomstige aminozuur. En zetten dus nucleïnezuurinformatie om in eiwitinformatie. (het ribosoom koppelt nucleïnezuurinformatie aan andere nucleinezuurinformatie codonanticodon). c. Wat is de rol van het aminozuur zelf in het op de juiste plek plaatsen van de beladen aminoacyl-trna op het codon? (4P) Geen. Alleen de anticodon-codon interactie is verantwoordelijk voor de juiste trna selectie. d. In het ribosoom wordt de groeiende eiwitketen steeds overgedragen op het nieuw aangeleverde aminoacyl-trna. p welk molecuul wordt de eiwitketen overgedragen als het stopcodon op het mrna is bereikt? (2P) Water / H 2 Bonusvraag (~1 minuut; max. 5 punten extra) Waarvoor kregen in 2012 Brian Kobilka en Robert Lefkowitz de Nobelprijs voor de Scheikunde? Voor de studie naar G-eiwit gekoppelde receptoren