Naam: Studentnummer: Opleiding:..

Transcriptie

1 EINDTOETS Moleculaire Cel Biologie (8RB01) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld & Dr. M. Merkx :00 12:00 (totaal 100 punten, plus max. 5 extra voor bonus) 6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! Geef uw antwoorden direct op dit tentamen. In principe volstaat de gegeven ruimte, maar gebruik indien nodig de achterkant van de specifieke opgave. Schrijf naam en studentnummer bovenaan iedere pagina! 1 Kwaliteitscontrole (~20 minuten; 15 punten) a. Editing is een mechanisme dat zowel in replicatie als in translatie gebruikt wordt om het aantal fouten in de synthese van respectievelijk DNA en eiwitten zo klein mogelijk te houden. Leg uit hoe editing werkt tijdens DNA replicatie en hoe en waar editing wordt gebruikt tijdens translatie. (5P) DNA replicatie; DNA polymerases hebben een polymerase (P) en een editing (E) site. Wanneer een base na inbouw in de groeiende DNA keten in de P-site niet gehybridiseerd blijft aan de template strand (bijvoorbeeld als gevolg van tautomerisatie) kan de volgende base niet efficiënt worden ingebouwd. Er vindt dan een conformatieverandering plaats waardoor het uiteinde van de nieuw gevormde DNA keten naar de editing site wordt verplaatst en de 3 ->5 exonuclease activiteit de niet-complementaire base verwijdert. Translatie: t-rna synthetase bevatten ook een editing site. Na koppeling van een aminozuur aan het 3 -uiteinde van een t-rna vindt ook hier een conformatieverandering plaats en controleert het enzym of het aminozuur dat gekoppeld is niet te klein is. Als dit zo is past het in de editing site en wordt de ester binding tussen aminozuur en t-rna weer gehydrolyseerd. b. Met 3 basen per codon zijn er 64 verschillende codons mogelijk. Hiervan coderen er 61 voor de 20 natuurlijke aminozuren en 3 worden gebruikt als stopcodon. Cellen bevatten echter minder dan 61 verschillende trnas. Leg uit hoe in het ribosoom toch elk van die 61 codons kan worden vertaald naar het juiste aminozuur. (5P) Dit is het gevolg van wobble base pairing. Bij de binding tussen codon op het mrna en het anticodon van het trna moeten de eerste 2 basen complementair zijn, maar voor de 3 de base is dit vaak minder strikt. Op deze positie bevindt zich in het anticodon vaak een I, welke met verschillende basen kan binden. Het gevolg hiervan is dat 1 trna meerdere codons kan herkennen. Deze codons coderen natuurlijk wel allemaal voor hetzelfde aminozuur.

2 c. Stel dat u een bacterie zou willen maken waarin 1 van de 64 codons codeert voor een stopcodon, en waarin elk aminozuur slechts wordt gecodeerd door 1 codon. Dit zou u in staat stellen om naast de 20 nu gebruikte aminozuren nog 43 andere aminozuren te coderen en te laten inbouwen in eiwitten. Noem twee dingen welke we minimaal moeten aanpassen in deze bacterie om dit mogelijk te maken? (5P) Veel antwoorden zijn mogelijk: - Je moet 63 verschillende trna s hebben - Je hebt 63 verschillende trna synthases nodig die elk een specifeke combinatie van trna en aminozuur herkennen - Om ervoor te zorgen dat de E.coli eiwitten dezelfde aminozuurvolgorde behouden moet je de DNA sequentie van E. coli aanpassen waarbij je voor elk van de 20 natuurlijke aminozuren dus maar 1 codon kunt gebruiken - Je moet de Release Factoren uitschakelen die 2 van de 3 stop codons, die je niet meer wilt gebruiken herkennen - Je zou wellicht de synthese van die 43 andere aminozuren moeten inbrengen, al zou je deze aminozuren ook gewoon aan de cellen kunnen toevoegen. - Het ribosoom mag geen wobble base paring meer toelaten

3 2 Van DNA naar Eiwit (~25 minuten; 20 punten) In een aquariumwinkel komt u een exotische vis tegen die een felle rode fluorescentie laat zien onder belichting met groen licht. U herinnert zich uit het college moleculaire celbiologie dat rood fluorescente eiwitten gewild zijn in de celbiologie als alternatief voor GFP, maar dat de huidige rood fluorescente eiwitten nog niet erg fel zijn. U besluit een poging te wagen om te zien of u het gen dat verantwoordelijk is voor de rode fluorescentie kunt isoleren en tot expressie kunt brengen in bacteriën. Omdat u hoopt dat het DNA dat codeert voor het rood fluorescente eiwit sterk lijkt op de sequentie van reeds bekende fluorescente eiwitten, besluit u het meteen serieus aan te pakken en het complete genoom van de rood fluorescente vis te sequencen. a. Leg uit hoe dideoxy sequencing werkt. (5P) Dit is de klassieke manier van DNA sequencing die ontwikkelt is door Sanger. Bij deze techniek heb je een ssdna template nodig, een primer, de 4 deoxyribonucleoside trifosfaat (dattp, dttp, dctp, en dgtp) en een DNA polymerase en tenslotte van 1 van de 4 ribonucleosides ook de dideoxy variant, bijvoorbeeld ddatp. Deze ddatp heeft geen OH groep op de 3 positie. Als deze ribonucleotide wordt ingebouwd stopt de reactie. Tijdens de polymerisatie reactie worden daarom verschillende lengtes DNA fragmenten gevormd, die echter allemaal de A als laatste base hebben aan de 3 kant van de keten. Door de reactie 4 uit te voeren met telkens een andere dideoxy ribonucleoside trifosfaat en de fragmenten vervolgens op grootte te scheiden kun je op een gel of na kolomchromatografie aflezen wat de DNA sequentie van de template was. Helaas kunt u geen gen ontdekken dat homologie vertoont met een reeds bekend fluorescent eiwit. Als alternatief besluit u het RNA uit de rood fluorescente cellen te isoleren en daarmee een cdna bibliotheek te maken. b. Wat is cdna en hoe maak je cdna? (5P) cdna staat voor complementair DNA. cdna is de vertaling van mrna in DNA. cdna wordt gemaakt door het enzym reverse transcriptase te gebruiken met mrna als template en een poly-t als primer. Hierdoor ontstaat in eerste instantie een DNA-RNA hybride structuur. Na selective hydrolyse van de RNA strand, wordt in een 2 de polymerisatie reactie dsdna gemaakt. Dit DNA bestaat dus gehaal uit coderend DNA zonder intron sequenties, omdat deze er in de synthese van mrna al zijn uitgespliced.

4 c. Elk cdna wordt gekloneerd in een plasmide, welke vervolgens wordt getransformeerd in bacteriën. Teken schematisch een plasmide en geef aan welke onderdelen minimaal aanwezig moeten zijn voor succesvolle transformatie van het plasmide en expressie van het cdna in de bacterie. (5P) Plaatje moet de volgende onderdelen bevatten: - Origin of replication (anders kan het plasmide niet worden vermenigvuldigd in de bacterie) - Gen voor antibiotica resistentie (voor selectie van bacterieen die het plasmide hebben opgenomen) - Het cdna - Een promotor aan de 5 kant van het cdna zodat een RNA polymerase van de bacterie het gen herkent en er transcriptie van het cdna zal plaatsvinden) Eureka! U hebt een bacterie kolonie gevonden op uw voedingsbodem die onder belichting met groen licht een sterke rode fluorescentie vertoont. U isoleert het plasmide en heldert de DNA sequentie op van het gen dat codeert voor het rood fluorescente eiwit. d. In tegenstelling tot veel andere fluorescente eiwitten blijkt het door u gevonden fluorescente eiwit ook bij lage ph nog fluorescent. Als eerste toepassing wilt u het daarom gebruiken om de lysosomen in een HeLa cel zichtbaar te maken. Leg uit wat u nog moet aanpassen aan het eiwit om ervoor te zorgen dat het eiwit in deze cellen in de lysosomen terecht komt. (5P) Lysosomale eiwitten worden via co-translationeel transport op ribosomen gemaakt op het ER en in het ER gevouwen. Vervolgens worden ze via vesculair transport naar de Golgi getransporteerd, waar een bepaalde eiwit sequentie bepaald dat ze van een mannose-6-fosfaat groep worden voorzien. Dit is een signaal voor verder vesculair transport naar de lysosomen. Het eiwit moet dus worden voorzien van een N-terminale ER-targeting sequentie en een sequentie die voor modificatie met een mannose-6-fosfaat groep zorgt.

5 3 Controle over transcriptie en translatie (~20 minuten; 15 punten) a. In een eukaryotische cel kan het proces van DNA tot actief eiwit tijdens elke stap gereguleerd worden. Plaats (de nummers van) de onderstaande controleprocessen op de plek in bijgevoegd figuur. (3P) 1. translationele controle 2. mrna degradatie controle 3. eiwitactiviteit controle 4. RNA transport en lokalisatie controle 5. RNA processering controle 6. transcriptionele controle b. Plaats 1 van onderstaande termen bij iedere definitie (slechts 1 antwoord correct). (4P) chromatine immunoprecipitatie gen-regulerend eiwit homeodomein DNA affiniteitchromatografie helix-loop-helix motief histon eiwit leucine zipper helix-turn-helix motief zink vinger 1. Een eiwit welke bindt aan een specifieke DNA sequentie en daarmee de expressie van een gen beïnvloed. gen-regulerend eiwit 2. Structuurmotief in veel DNA bindende eiwitten waarin twee -helices van verschillende eiwitten bij elkaar worden gehouden in een coiled-coil. leucine zipper 3. Methode gebaseerd op het cross-linken van eiwitten aan DNA in levende cellen welke gebruikt wordt om te bepalen welke gebieden op het DNA door een specifiek eiwit worden bezet. chromatine immunoprecipitatie 4. DNA-bindingsmotief waarin een -helix en -sheet bij elkaar worden gehouden door een metaalion. zink vinger

6 c. Transcriptie kan gereguleerd worden door liganden die binden aan gen-regulerende eiwitten. De combinatie van een ligand met een eiwit kan transcriptie activeren, maar ook blokkeren. Beschrijft u schematisch/conceptueel hoe transcriptie van een gen negatief gereguleerd kan worden met behulp van een gen-regulerend eiwit en een ligand. Maakt u eventueel gebruik van een schematische schets om uw antwoord te ondersteunen. (4P) Een van de twee aangegeven concepten. Dan wel duidelijk getekend, dan wel de processen duidelijk uitgelegd zoals in de ondersteunende tekst in de figuur aangegeven. d. Regulatie van de translatie van het eiwit ferritine wordt onder andere gecontroleerd door de interactie tussen een hairpin structuur in het mrna, genaamd iron-response element (IRE), en het iron-response protein (IRP) welke daaraan bindt. Als IRE is gebonden aan IRP is translatie geblokkeerd. Om goed te functioneren moet het IRE dicht bij het 5 einde van het mrna gepositioneerd zijn. Als het meer dan 60 nucleotiden hiervan verwijderd is kan IRE niet langer translatie inhiberen. Legt u uit via welk mechanisme / hoe IRE samen met IRP translatie blokkeert er waarom naar uw inzicht daarbij de positie van het IRE in het mrna zo cruciaal is. (4P) Gebonden IRP interfereert met de translatie door de stabiele associatie van de kleine ribosomale sub-eenheid aan het mrna te blokkeren; de eerste stap in de initiatie van translatie. (De kleine ribosomale sub-eenheid bindt aan de 5 cap structuur en scant dan het mrna af tot er een geschikt AUG start codon is gevonden om de translatie te starten.) Wanneer er een IRP is gebonden nabij de 5 cap kan de kleine ribosomale sub-eenheid niet binden. Als IRP binding verder downstream (>60 nucleotiden) is, door een veranderde locatie van de IRE, kan de kleine ribosomale sub-eenheid wel binden aan het 5 uiteinde van het mrna. Blijkbaar is in dat geval het ribosoom sterk genoeg gebonden om de gevouwen IRE en gebonden IRP te ontvouwen en verwijderen.

7 4 De celcyclus (~20 minuten; 15 punten) U bent onlangs benoemd tot directeur van het nationale ballet en gefascineerd geraakt door de overeenkomst tussen de voorstellingen (kindermatinee en avondprogramma) en de celcyclus. Elke keer loopt het theater vol, de lichten gaan uit, het gordijn aan de kant, de dansers dansen, het gordijn valt, de lichten gaan aan en het theater loopt leeg. En tussen iedere voorstelling is er een periode van rust van langere of kortere duur (namiddag of nacht). Een goed gedefinieerde, zich herhalende sequentie, net als de celcyclus. a. Ook in de celcyclus komen rustperiodes (gaps) voor tussen de S en M fasen. Noem twee redenen waarom er van deze rustperiodes zijn in de celcyclus. (4P) -Cellen gebruiken de rustperiodes om te groeien/om bouwstenen aan te maken voor de processen in de S en M fase. Bouwstenen voor DNA synthese, nieuwe organellen, etc. Als dit niet zou gebeuren zouden cellen steeds kleiner worden. -Cellen gebruiken de rustperiodes (vooral de G1) om aanwezig te blijven zonder verder te delen. De afwezigheid van groeisignalen laat de cellen als het ware overwinteren. Hiervoor zijn de rustperiodes goed geschikt. -Cellen gebruiken de rustperiodes om de interne en externe omgeving te controleren, om er zeker van te zijn dat de omstandigheden gunstig zijn om de grote veranderingen van S en M fase te kunnen ondergaan. b. Tijdens het kindermatinee blijken er het dubbel aantal G1 bezoekers in de zaal te passen als in de avond (twee kinderen per stoel). Eenzelfde soort fenomeen zien we bij de celcyclus m.b.t. de hoeveelheid DNA in de cel. In de flow cytometrie figuur hiernaast is de correlatie tussen het G2 + M aantal cellen en de hoeveelheid DNA (door al het DNA fluorescent aan te kleuren) tegen elkaar uitgezet. Geef in S de figuur aan waar u het signaal verwacht van cellen in ieder van de volgende fasen: G 1, S, G 2 en M. (3P) Uitleg (niet gevraagd): The peak with the lowest fluorescence corresponds to cells in G1, which are diploid. The peak with the highest fluorescence corresponds to cells in G2 and M, which have finished replication and are tetraploid (and thus have twice the fluorescence of G1 cells). Cells in S phase, which are replicating their DNA, are between diploid and tetraploid and thus have intermediate levels of fluorescence.

8 c. Schets een soortgelijke figuur als bovenstaand waarin de celdistributie staat aangegeven nadat de celcyclus is geblokkeerd in de G 1 fase (bijvoorbeeld door een medicijn). (3P) d. Noem en beschrijf in een paar zinnen 2 conceptueel verschillende manieren waarmee de activiteit van cycline-cdk complexen wordt gereguleerd. (5P) -De activiteit van cycline Cdk complexen kan worden gereguleerd door phosphorylering en dephosphoryleringsreacties. Activatie door phosphorylering van de Cdk; Inhibering door dubbele phosphorylering van Cdk (en natuurlijk de terugwerkende mechanismen door dephosphorylering.) (Eventueel ook nog activiteitsregulatie van de Cdk modificerende enzymen door (de)phosphorylering) -De activiteit van cycline Cdk complexen kan worden gereguleerd door binden van en Cdk inhibitor (CKI) eiwitten. Binden van een CKI aan een Cdk-cycline complex leidt tot inactivatie. -De activiteit van cycline Cdk complexen kan worden gereguleerd door gereguleerde synthese en proteolyse van de verschillende cyclines, en ook CKIs.

9 5 Kanker, Signaaltransductie en Apoptose (~25 minuten; 20 punten) a. Mouse mammary tumor virus (MMTV) is een oncogeen virus dat tot borstkanker in muizen leidt wanneer het integreert in het genoom. U wilt weten of dit virus zelf een oncogeen bevat of dat het er een genereert na integratie in het genoom. U isoleert 26 verschillende borstkankers van muizen blootgesteld aan MMTV en bepaald de plek van de retrovirale integratie. In 18 van de 26 tumoren wordt de integratie gevonden binnen een 20 kilobase segment van het muisgenoom. Het blijkt dat bij deze 18 tumoren een RNA van het muisgenoom tot expressie komt, welke in niet geïnfecteerde cellen niet tot expressie komt. Wat vertellen deze observaties u m.b.t. de vraag of het MMTV een oncogeen bevat of een oncogeen genereert na integratie. Leg uw antwoord kort uit. (5P) De observaties zijn hele sterke indicaties dat MMTV een oncogeen genereert na integratie in het genoom van de muis. Het is heel onwaarschijnlijk dat MMTV puur door toeval zo vaak zou integreren in dezelfde regio van het genoom. Tevens wordt er een uniek transcript gegenereerd van de regio waar het virus geïntegreerd wordt, wat suggereert dat een gen wordt aangezet als respons op de naburige geïntegreerde virale sequenties. b. Het Arf eiwit inhibeert het Mdm2 eiwit, welke weer het p53 eiwit inhibeert. De relatie tussen deze 3 eiwitten is gerepresenteerd in de figuur hiernaast. Dit is een voorbeeld van een dubbel-negatief mechanisme: Arf is een inhibitor van een inhibitor van p53. Verwacht u dat een Arf-knockout muis meer of minder gevoelig is voor het ontwikkelen van een tumor dan een normale muis? Leg uw antwoord kort uit. (5P) Een Arf-knockout muis zal naar verwachting meer gevoelig zijn voor de ontwikkeling van een tumor dan een wild-type muis. In de afwezigheid van Arf zal het Mdm2 meer actief zijn/worden. Dit overactieve Mdm2 zal vervolgens de p53 meer onderdrukken dan normaal. De consequentie van een Arf knockout is dus gereduceerde p53 activiteit. Hierdoor zal p53 minder in staat zijn abnormale cellen tot een cel cyclus arrest of apoptose te laten overgaan. Als gevolg zullen meer pre-kanker cellen van de celdood ontsnappen en worden meer tumoren gevormd.

10 c. Beschouw onderstaande signaleringscascade. Leg uit wat er gebeurt bij iedere genummerde stap in de signaleringscascade en wat het uiteindelijke cellulaire gevolg is (roze blokje). (10P) Een extracellulair overlevingssignaal bindt, dimerizeert en activeert een Receptor Tyrosine Kinase (RTK). 2. De gedimerizeerde activeert zichzelf middels cross-phosphorylatie. 3. De gephosphoryleerde RTK fungeert als dockings platform en recruteert en activeert een PI 3-kinase. De PI 3-kinase is hierdoor nu actief en membraangebonden en kan daardoor PIP 2 phosphoryleren tot PIP Twee van deze PIP 3 binden aan de PH domeinen van PDK1 en Akt en fungeren als dockingsplatform om deze twee eiwitten dicht bij elkaar te brengen en te activeren. 5. Akt wordt dubbel gephosphoryleerd door PDK1 en mtor en daardoor geactiveerd. 6. Door de phosphorylering ondergaat Akt een conformatie verandering en het geactiveerde Akt laat los van het membraan. 7. Het actieve Akt phosphoryleert het Bad eiwit. 8. Gephosphoryleerd Bad laat het inhibitor eiwit los en wordt zelf weggehaald uit de actieve cascade door binding aan een eiwit. 9. Het apoptose inhibitor eiwit komt vrij en wordt actief. 10. Apoptose wordt geinhibeerd, waardoor de cellen overleven.

11 6 Immunologie en celdood (~20 minuten; 15 punten) a. Veel immunologische processen vinden plaats middels contactafhankelijke signalering (bijvoorbeeld T of B cel activatie, of herkenning van geïnfecteerde cellen door T cellen). Noem twee redenen waarom dit zich uw inziens evolutionair zo heeft ontwikkeld in plaats van, bijvoorbeeld, via paracrine signalering. (4P) -Door contactafhankelijke signalering kunnen selectief alleen die cellen herkend of geactiveerd worden welke de juiste complementaire componenten bevatten. -Door contactafhankelijke signalering kan een signaal veel sterker doorgegeven worden middels interacties van coreceptoren en middels multivalente effecten: Er zijn altijd meerdere signalen nodig om over een activeringsdrempel heen te komen. Door direct cel contact wordt dit lokaal heel effectief gedaan. -Door contactafhankelijke signalering kunnen selectief alleen geïnfecteerde cellen gedood worden. Paracrine signalering zal leiden tot veel collateraal schade. -Door contactafhankelijke signalering wordt eventuele additionele paracrine signalering efficiënter en selectiever. b. T cel receptoren en B cel receptoren hebben een sterke moleculaire overeenkomst, maar ook een conceptueel verschil. Beschrijf kort de moleculaire overeenkomst tussen T cel en B cel receptoren en het verschil tussen beide type receptoren. (4P) Zowel T cel receptoren als B cel receptoren maken gebruik van Immunoglobine (achtige) domeinen om hun receptoren op te bouwen. Daarbij bestaat de functionele antigen bindende kopgroep in beide gevallen uit twee variabele domeinen (welke weer gevolgd worden in beide gevallen uit twee constante domeinen). T cel receptoren hebben slechts een antigen bindende kopgroep, terwijl B cel receptoren er 2 hebben. (T cel receptoren hebben hun multivalente effect door meerdere receptoren tegelijk te kunnen laten binden. Voor B cel receptoren is het van belang 2 kopgroepen te hebben, omdat deze B cel receptoren in een verder ontwikkelingsstadium tot expressie komen als oplosbare antilichamen, waarvoor de 2 kopgroepen dan als bivalent platform dienen.)

12 c. Een T cel receptor en een MHC (major histocompatibility complex) eiwit binden allebei aan dezelfde epitoop van een pathogeen, toch herkennen ze daarbij andere moleculaire elementen. Legt u uit waarom dit zo is en waarom dit noodzakelijk is. (4P) -Dit is noodzakelijk om dat de T cel receptor en het MHC eiwit tegelijkertijd aan het antigen moeten binden. Dit kan alleen als de twee receptoren andere / ruimtelijke tegenovergestelde elementen van het antigen herkennen. Anders zouden de twee receptoren met elkaar in competitie zijn om aan het antigen te binden en er geen functionele interactie tussen de T cel en de geïnfecteerde cel plaats kunnen vinden. -MHC eiwitten binden algemeen aan peptide fragmenten en gebruiken daarvoor de backbone als herkenning. T cel receptoren zijn selectief en gebruiken daarvoor de zijstaarten van het epitoop. d. Alle onderdelen van een antilichaam zijn belangrijk voor de functie. De variabele kopgroepen herkennen bijvoorbeeld het antigen. Wat is de voornaamste rol van de twee constante ketens (Fc) van Immunoglobine G (IgG) bij het opruimen van een bacterie? Leg kort het gedeelte van dit proces uit waarin de Fc regio een belangrijke rol speelt. (3P) De constante regios / staarten van IgG binden aan specifieke receptoren op bijvoorbeeld macrofagen. Deze Fc receptoren zorgen ervoor dat een met antilichaam gedecoreerde bacterie meervoudige (en dus sterk) gebonden kan worden door de macrofaag en geïngesteerd en opgeruimd wordt. Binding van de Fc keten aan de Fc receptor leidt tevens tot activatie van intracellulaire pathways in de macrofaag welke het phagocytose proces activeren.

13 Bonusvraag (~5 minuten; 5 punten) Welke twee humane eiwitten worden door het papillomavirus in hun werking gestoord waardoor er baarmoederhalskanker kan ontstaan? (namen volstaan) Rb en p53