Chymotrypsine. Deze heeft een S1 pocket waarin grote, aromatisch zijstaarten passen. Waarschijnlijk past de zijstaart van X daar ook in.

Transcriptie

1 1 Peptiden en eiwitten (~30 minuten; 20 punten) a. Geef de 1-lettercode van de volgende supersnelle, maar recent ook haperende, aminozuursequentie. De sequentie bevat een non-proteïnogeen aminozuur welke de 1- lettercode X heeft. (4P) MAXVERSTAPPEN Indien u zag dat het peptide uit de bocht gevlogen was MAXVERSTAPPEQ ( 5P) b. U wilt met een protease de amidebinding tussen het 3 e en 4 e aminozuur van bovenstaand peptide hydrolyseren. Zou u dit met trypsine of chymotrypsine proberen uit te voeren? Leg uw antwoord kort uit. (2P) Chymotrypsine. Deze heeft een S1 pocket waarin grote, aromatisch zijstaarten passen. Waarschijnlijk past de zijstaart van X daar ook in. c. Bovenstaand peptide is goed in het inhalen op een tweebaansweg. Schets schematisch het waterstofbruggenpatroon van een parallelle -sheet. Teken daarbij minstens 2 peptideketens waarbij iedere peptideketen uit tenminste 4 aminozuren bestaat (u mag in de tekening de zijstaarten van de aminozuren eventueel weglaten). (4P)

2 d. De reactie genoemd onder 1b blijkt in aanwezigheid van het correcte enzym spontaan te verlopen bij 298 K. Welke onderstaande set van thermodynamische parameters zou dan correct kunnen zijn voor deze reactie? Leg uw antwoord kort uit. (2P) I. H = 84 kj mol -1 ; S = +125 J mol 1 K 1 II. H = +84 kj mol -1 ; S = 125 J mol 1 K 1 I, want G is negatief ( J mol 1 ); bij II is G positief e. Maak met behulp van een aantal tekeningen duidelijk hoe het moleculaire mechanisme van de hydrolyse van een amidebinding door een serine-protease verloopt. Teken hierbij iedere keer de aminozuren van de actieve site (en natuurlijk het substraat / water) en laat duidelijk zien wat hun rol is. (8P)

3 2 Enzymactiviteit (~25 minuten; 20 punten) a. Het aminozuur asparagine is noodzakelijk voor kankercellen om te prolifereren. Het enzym asparaginase wordt gebruikt als anti-kanker medicijn. Asparaginase hydrolyseert asparagine tot aspartaat en ammonia. De bijgevoegde illustratie toont de Michaelis-Menten curves voor twee verschillende soorten asparaginase. De pijl geeft de concentratie van asparagine in bloed plasma aan (de omgeving van de te behandelen kankercellen). Welk van de twee enzymen zal een beter chemotherapeuticum zijn? Betrek in uw antwoord de V max en K M van de enzymen en welke hier de belangrijkste parameter is en waarom. (4P) Enzym 2. Ondanks het feit dat enzym 1 een hogere Vmax heeft als enzym 2, heeft enzym 2 een grotere/hogere activiteit bij de physiologisch relevante substraat concentratie, omdat enzym 2 een lagere Km heeft voor het substraat. b. U voert drie sets van enzymreacties uit met hetzelfde enzym (bij dezelfde concentratie, temperatuur, etc.): 1) zonder inhibitor, 2) met een competitieve inhibitor en 3) met een noncompetitieve inhibitor. Teken de te verwachten Michaelis-Menten curves voor deze drie sets van enzymreacties. Teken ook de gecorreleerde Lineweaver Burk plots. Vergeet niet aan te geven wat er op de assen staat en wees zo precies mogelijk in het aangeven wat wel en wat niet verandert (met de verschillende inhibitoren). (6P) Experimentele conditie V max K M competitieve inhibitor Gelijk Wordt groter non-competitieve inhibitor Neemt af Gelijk

4 c. Een cofactor en een apo-enzym vormen gezamenlijk het holo-enzym. Wat zijn de twee belangrijkste klassen van cofactoren? (2P) Metaalionen/metalen en coenzymen d. Wat is de drijvende kracht achter de ATP synthese via het ATP-synthase enzym. (2P) De protongradiënt over het (binnenste ER) membraan heen (waar de ATP synthase zich bevindt als transmembraan eiwit). e. De biosynthese van ATP gebeurt met behulp van het transmembraaneiwit ATP-synthase. Qua structuur en werkingsmechanisme vertoont de ATP-synthase grote overeenkomsten met het eiwit DNA-helicase. Beschrijft u deze conceptuele overeenkomsten zo precies mogelijk. (4P) Beide eiwitten/enzymen bevatten een hexamere ring van eiwitdomeinen (met 3-voudige rotationele symmetrie) welke 3 verschillende bindingstoestanden/affiniteiten voor ATP en ADP + P i hebben en waarbij deze verschillende affiniteiten gekoppeld zijn aan conformatieveranderingen in de domeinen. De functionaliteit van beide eiwitten komt tot uiting door deze conformatieveranderingen geïnduceerd door de 3 verschillende bindingstoestanden voor ATP en ADP + P i. (niet gevraagd) In het geval van de DNA helicase wordt dubbelstrengs DNA uit elkaar getrokken door de conformatieveranderingen onder consumptie van ATP, terwijl bij de ATP synthase de conformatieveranderingen (geïnduceerd door de proton gradiënt) de synthese van ATP bewerkstelligen. f. Nieuw gesynthetiseerd ATP wordt normaal gesproken uit de mitochondriën verwijderd. Wat zou er gebeuren met de activiteit van het ATP-synthase enzym als het ATP zich zou ophopen in de mitochondriën? (2P) Dan zal de productiesnelheid van ATP steeds langzamer worden (er stroomt dan dus ook minder H+ de mitochondrien in) en uiteindelijk zou zich een evenwicht instellen waarbij er effectief geen H+ meer de mitochondrien terugvloeit en de concentratie ATP constant hoog is. (Alhoewel dit effectief kan betekenen dat de ATP synthase soms ook ATP omzet in ADP en daarbij een proton naar buiten pompt, gaat de reactie niet overall de andere kant oplopen, omdat er ook een ophoping van H+ is in het middelste compartiment.)

5 3 Membranen en hun eiwitten (~20 minuten; 20 punten) a. P-type ATPasen zijn belangrijke eiwitten welke ionen tegen de concentratiegradiënt in over een membraan kunnen pompen. Geef door middel van een aantal schematische tekeningen aan hoe een Ca 2+ ATPase functioneert. Laat daarbij duidelijk (conceptueel) zien welke conformationele veranderingen er optreden en welke veranderingen in Ca 2+ -binding het enzym daarbij ondergaat. Betrek in uw antwoord alle 4 relevante eiwitdomeinen van de Ca 2+ ATPase (transmembraan, A, P, N). U mag uw tekeningen ondersteunen met tekstuele uitleg. (10P) Schematische weergave van:

6 b. Naast ATP hydrolyse bestaat er nog een tweede vorm van energie welke gebruikt kan worden om conformatieveranderingen in eiwitten te induceren en actief verbindingen over het membraan heen te transporteren / pompen. Geef aan welke vorm van energie dit is en leg het principe kort uit. (5P) De concentratiegradiënt van een andere verbinding kan ook dienen als drijvende kracht, door deze te koppelen met het transport van de beoogde verbinding. Hiervoor wordt de andere verbinding (bijvoorbeeld een ion) getransporteerd naar de lagere concentratie (levert energie) om de beoogde verbinding tegen de concentratiegradiënt in te transporteren (kost energie) met hetzelfde transmembraaneiwit / pomp. (symporters of antiporters). Eventueel licht /hv ook goed keuren, indien correct uitgelegd. c. Phosphatidyl serine is een belangrijk lipide in eukaryotische membranen. Onderstaand is een voorbeeld van een phosphatidyl serine getekend. De structuur is -an sich- chemisch correct, maar zoals getekend biochemisch niet aanwezig in eukaryotische cellen. Er zitten vier fouten in deze structuur met betrekking hoe een phosphatidyl serine van eukaryotische cellen er normaal gesproken uitziet. Geef aan wat de fouten zijn en teken een chemische variant van dit phosphatidyl serine zoals deze wel in eukaryotische cellen voor zou kunnen komen. (5P)

7 4 Over Nucleïnezuren en DNA (~25 minuten; 20 punten) a. Teken de volledige moleculaire structuur van het nucleotide 3 -damp. (4P) Of iedere andere correcte ionisatievorm. b. De grafiek rechts toont het effect van zout (NaCl) op de smelttemperatuur van een bacterieel dubbelstrengs DNA. Verklaart u dit effect. (4P) Bij hogere zoutconcentraties neemt de smelttemperatuur toe. De DNA backbone is negatief geladen, wat leidt tot ladingsafstoting en destabilisatie van de dubbel helix (en smelten). Zout neutraliseert deze negatieve lading en afstoting, waardoor de dubbel helix gestabiliseerd wordt. c. Er is voor DNA synthese in een eukaryotische cel naast datp, ook ATP nodig. Geef de naam van 2 processen/eiwitten, gerelateerd aan eukaryotische DNA synthese, waarbij ATP nodig is. (2P) -Topo-isomerase (II) activiteit -DNA helicase activiteit. -DNA ligase -Primase

8 d. De restrictie enzymen KpnI en Acc65I herkennen en knippen dezelfde sequentie van 6 basenparen (zie figuur). Echter, de producten van het knippen door KpnI kunnen niet geligeerd (geplakt) worden aan de producten gevormd door knippen met Acc65I. Leg uit hoe dit komt. (4P) Alhoewel de twee enzymen dezelfde sequentie knippen, breken ze verschillende bindingen. Knippen met KpnI of met Acc65I geeft overhangen aan verschillende strands (3 versus 5 ). Deze uiteinden zijn niet complementair / vertonen geen overlap. e. Hoe beïnvloedt de verandering van de hybridisatietemperatuur tijdens de PCR de nauwkeurigheid van de DNA amplificatie? (2P) Bij hoge hybridisatietemperaturen zullen alleen (bijna) exacte matches tussen primer en target DNA stabiel zijn, omdat (bijna) alle basen partners moeten vinden om de dubbelhelix te stabiliseren en dus ook slechts een of weinig genen geamplificeerd worden. Bij lagere temperatuur zijn meer mismatches toegestaan om toch hybridisatie te hebben. Hierdoor zullen eventueel ook (andere) genen/stukken DNA geamplificeerd worden met minder sequentieovereenkomst. f. U wilt het DNA tussen de twee hieronder getoonde sequenties amplificeren met behulp van de PCR. Kies uit de lijst van acht primers, welke u hiervoor nodig heeft. (4P) 3 -GCGATATGCG ATATGCGATAT-5 5 -CGCTATACGC TATACGCTATA = lange tussenliggende DNA sequentie 1) 5 -GCGATATCGC-3 5) 5 -GCGATATGCG-3 2) 5 -TATAGCGTATA-3 6) 5 -ATATGCGATAT-3 3) 5 -TATA-3 7) 5 -CGCTATACGC-3 4) 5 -ATAT-3 8) 5 -ATATCGCATAT-3 2 en 7

9 5 Over RNA (~10 minuten; 10 punten) a. Van een stukje dubbelstrengs prokaryotisch DNA is de volgende sequentie bekend voor de templaat streng. 5 -CCGGATGTTTCACCTATAGAC-3 Geef de sequentie van het overeenkomstige mrna als dit dubbelstrengs DNA met een RNA polymerase wordt uitgelezen. Geeft u hierbij ook de 5 en 3 posities aan. (2P) 3 -GGCCUACAAAGUGGAUAUCUG-5 of 5 -GUCUAUAGGUGAAACAUCCGG-3 b. De basen van een enkelstrengs RNA bestaan voor 20% uit U. Wat kunt u zeggen over de individuele percentages van de andere basen in dit enkelstrengs RNA? (1P) Niks c. Naast de katalytische reactie van de verlenging van een groeiende mrna keten, is de RNA polymerase ook nog verantwoordelijk voor een aantal andere processen gerelateerd aan mrna synthese. Noem er twee. (2P) Bijv. Zoeken naar de promoter locaties; ontvouwen van een kort stukje DNA; detectie van terminatie signalen; coördineren van post-transcriptionele processen d. Wat voor type chemische reactie vindt er plaats tijdens mrna splicing? (2P) (twee) transesterificaties (omesteringen van fosfaatesters). e. Geef een functie van small nuclear RNA (snrna) in het spliceosoom. (2P) Binden/herkennen splice posities; binden/herkennen branch posities; (mede)vormen katalytische centrum; maskeren katalytische centrum. f. Uit één en hetzelfde eukaryotische gen kunnen toch verschillende eiwitten ontstaan. Wat is de naam van dit principe / proces. (1P) Door alternatief splicen / alternative splicing.

10 6 Van RNA naar eiwit (~15 minuten; 10 punten) a. Welk(e) eiwitpolymeer(en) worden mogelijk gecodeerd door de mrna sequentie poly(aac)? Let op, reading frame niet bekend! (2P) polyasn (AAC), polythr (ACA), polygln (CAA) b. Geef een mogelijke nucleotidensequentie voor de coderende DNA streng van onderstaande peptide sequentie. Geef daarbij aan waar zich de 5 en 3 posities bevinden. (4P) Trp-Pro-Lys-Val 5 -TGGCCNAA(A/G)GTN-3 c. Eukaryotisch mrna heeft meestel meerdere AUG codons. Hoe bepaalt het ribosoom welke daarvan het startcodon is? (2P) Het ribosoom (onderste deel) bindt eerst aan de 5 -cap en schuift vanuit die positie over het mrna tot het bij het eerste AUG codon terecht komt. d. Wat wordt, in de context van eiwitsynthese, bedoeld met een geactiveerd aminozuur? (2P) Een aminozuur welke (correct) gekoppeld is aan zijn corresponderende trna (als geactiveerde ester). Bonusvraag (~1 minuut; max. 5 punten extra) Welke chemicus kreeg maar liefst twee keer de Nobelprijs uitgereikt voor biochemische ontdekkingen (1 e in 1958 voor onderzoek naar de structuur van eiwitten, in het bijzonder insuline; 2 e in 1980 voor bijdragen aan de bepaling van de basenvolgorde in nucleïnezuren). (Frederick) Sanger