Recombinant DNA Technieken BMLMBP13

Transcriptie

1 Recombinant DNA Technieken BMLMBP13 Auteur/modulehouder: Cora Groffen September 2012

2 BMLMBP13 Inhoudsopgave Algemene informatie 2 Practicum voorbereiding en uitwerking 4 1.Programma 6 2. Inleiding Het experiment Faag λ Het plasmide Het construct Transformatie van E. coli Isolatie plasmide DNA Electroforese van plasmide DNA De polymerase-kettingreactie (PCR) 15 Protocol 1 Defosforylering en ligatie 17 Protocol 2 Het maken van competente cellen (E.coli) m.b.v. rubidium chloride. Protocol 3 Transformatie 20 Protocol 4 Microbiologische methoden 22 Protocol 5 Isolatie van plasmide DNA m.b.v. de Qiaprep kit 24 Protocol 6 Het gebruik van de Nanodrop spectrofotometer 26 Protocol 7 Het knippen van DNA met een restrictie-enzym 27 Protocol 8 (Kolonie) PCR 29 Protocol 9 Het gieten van de agarose gel: 31 Protocol 10 Het klaarmaken van de DNA samples voor agarosegel electroforese 33 Protocol 11 Het opbrengen van de DNA in een agarose gel 34 Protocol 12 Het beëindigen en bekijken van de agarosegel na de electroforese. 35 Bijlage 1.Veiligheidseisen voor recombinant DNA werk 36 Bijlage 2. Regels voor de verslaglegging bij practica 40 Bijlage 3. Het principe en veiligheid van de Qiagen methode. 41 Bijlage 4. Restrictiekaart van puc Bijlage 5. Nucleotide volgorde van puc Bijlage 6. Gegevens van faag Lambda 47 Bijlage 7. Gegevens van de 100 bp ladder 48 Bijlage 8. Voorbereidingsvragen en uitwerkingsopdrachten 49 Referenties 51 1

3 Algemene informatie MBP13 is een practicum in het tweede jaar van de opleiding Biologie en Medisch Laboratorium onderzoek (BML). Tijdens dit practicum staat DNA centraal. Er zullen verschillende moleculair biologische technieken worden gebruikt zoals digesteren,ligeren,transformeren, DNA isolatie en kwantificering. Daarnaast wordt de exacte grootte van een DNA-plasmide bepaald door te knippen met een restrictie-enzym en een electroforese uitgevoerd met behulp van een agarosegel. Ook wordt de kolonie-pcr methode gebruikt om de grootte van de insertie van het plasmide zo exact mogelijk vast te stellen. Deze module wordt in dezelfde onderwijsperiode gegeven als de theoriemodule BMLMBI12, dit sluit dan ook volledig aan. Verder sluit deze module aan op de module BMLBLP22, BMLBLP42 en BMLMIP12. Deze module maakt ook gebruik van de kennis en vaardigheden die zijn opgedaan bij de andere eerstejaars praktijkmodulen. Omvang: 2 Studiepunten Plaats in de opleiding: 2 e jaar Competentieontwikkeling: Deze module draagt bij aan de ontwikkeling van de competentie Experimenteren, niveau 2 Deze module draagt bij aan de ontwikkeling van de competentie Onderzoeken, niveau 2. Onderwijswerkvorm(en): Practicum van 4 x 5 lesuren. Zelfstudie (voorbereiding, schriftelijke verwerking,voorbereiding toets en toetsing: 36 uur). Leermiddelen: - Handleiding Practicum recombinant DNA technieken BMLMBP13 - Campbell, N.A. and Reece, J.B. (2011). Biology 9th ed., Benjamin Cummings. - Reed, R. e.a. (2007). Practical Skills in Biomolecular Sciences, 3rd edition. Prentice Hall. - Van t Leven, I. (2006). Veiligheid en milieu in Laboratoria, tweede druk. - Van der Laan, R. (2008). Exact communiceren, Syntax media, Arnhem,vierde druk. 2

4 Toetsing: Er wordt beoordeeld op de volgende onderdelen: - Voorbereiding van de practica - De uitvoering van de handelingen met daarbij de mate van zelfstandigheid - Het begrip van berekeningen en verwerking van de resultaten. - Labjournaaltoets in de vorm van open vragen. Alle onderdelen moeten met een voldoende worden afgerond. Aanwezigheidsplicht: Je kunt alleen voor een eindbeoordeling in aanmerking komen als je alle experimenten hebt uitgevoerd. In geval van afwezigheid veroorzaakt door bijzondere omstandigheden wordt naar een oplossing gezocht. Overleg dit zo spoedig mogelijk met de docent. Leerdoelen: - Het werken volgens de algemene veiligheids- en actuele VMT-regels. - Het uitvoeren van verschillende DNA digesties zodat er verschillende fragmenten van faag ontstaan die in de gedigesteerde vector puc18 kunnen worden geligeerd. - Het maken van competente E.coli cellen voor het te transformeren contruct. - Het transformeren van het construct naar een E.coli stam en wel zodanig dat er na het uitplaten van de juiste verdunning op een selectief medium blauwe en witte kolonies worden verkregen. - Het isoleren van plasmide DNA van de transformanten door deze eerst op te groeien en vervolgens het DNA m.b.v. een Qiagen DNA isolatie kit te isoleren. - Het bepalen van de kwantiteit en kwaliteit m.b.v. UV-spectofotometrie en hier de benodigde berekeningen bij maken. - Het uitvoeren van een kolonie PCR van de transformanten zodat duidelijk wordt welk deel van de faag als insert aanwezig is in de vector puc18. - Het bepalen van de grootte van het PCR product en het geïsoleerde plasmide DNA m.b.v. een gel electroferese. Hierbij zal worden bepaald welk % gel moet worden gebruikt en aan de hand van de verkregen fragmenten worden uitgezocht (berekend) welk deel van faag als insert gekloneerd is. - Het bedenken van een onderzoeksvraag met betrekking op de oriëntatie van het gekloneerde fragment en het uitvoeren van dit experiment. - Het juist en kritisch interpreteren van de resultaten en dit zorgvuldig kunnen rapporteren in een labjournaal. - Het verwerken van de experimenten in een meetrapport zodat een duidelijk overzicht ontstaat met de juiste interpretaties, berekeningen en verwerking van de resultaten. - De apparatuur behorend bij de experimenten op de juiste manier bedienen. - Het maken van flow-schema s ter voorbereiding van het practicum en wel zodanig dat er een duidelijk overzicht is van de experimenten die moeten worden uitgevoerd. 3

5 Practicum voorbereiding en uitwerking Practicum benodigdheden: Wat moet je ieder practicum bij je hebben? - de practicumhandleiding - een schrift van A4 formaat (collegecahier), te gebruiken als labjournaal (mag niet losbladig zijn). - een witte laboratoriumjas - een veiligheidsbril - een dun schrijvende watervaste viltstift, om op eppendorf cupjes, platen of glaswerk te schrijven. - tekenmateriaal: potlood (HB), puntenslijper, stuf, liniaal. - lijmstift en schaar - pincet en pipetteerballon De voorbereiding: Hoe moet je het practicum voorbereiden? Er moet vrij veel werk worden uitgevoerd; een goede voorbereiding is dus absoluut noodzakelijk. Er moet daarom een overzichtelijke planning (flowschema) van alle werkzaamheden worden gemaakt. Lees door wat er moet worden gedaan van dag tot dag; zoek voor de voorschriften de betreffende protocollen en/of bijlagen (achter in deze module)en lees dit goed door. De voorbereidingsvragen ( bijlage 8) moeten worden gemaakt, dit kan worden uitgewerkt achter in het labjournaal. Pas als deze opdrachten en vragen zijn gecontroleerd mag je aan het experiment beginnen. Niet voorbereiden betekent dus dat je niet op tijd, of zelfs helemaal niet, aan het practicum kunt deelnemen!!! We vinden de voorbereiding zo belangrijk om een heleboel redenen; er wordt met biologisch materiaal gewerkt en met veel dure reagentia (bv. de restrictie-enzymen of agarose) en ontzettend dure apparatuur. Welk experiment of welke experimenten je voor welke dag moet voorbereiden staat in hoofdstuk 1, Programma van deze handleiding. Iedereen start op dag 1 met de experimenten die bij die dag staan vermeld (als de voorbereiding is goedgekeurd!!!). Vanaf dag 2 wordt niet alleen naar je voorbereiding gekeken maar hangt het starten van een nieuw experiment ook af van je resultaten en je werktempo. De resultaten van alle experimenten moeten eerst met de docent besproken worden voordat je aan een volgend experiment kunt beginnen. De Uitvoering: Bij goed en netjes werken kunnen voor vrijwel alle onderdelen positieve resultaten worden behaald. Zo moeten er transformanten te zien zijn en bij de digesties moet in ieder geval van het marker DNA bandjes in de agarose gel te zien zijn. De resultaten tellen mee in de eindbeoordeling. 4

6 Veiligheid: Er wordt gewerkt met bacteriën waaronder gerecombineerde stammen, enkele potentieel gevaarlijke stoffen en met bijzonder dure enzymen en materialen. Er worden dan ook hoge eisen gesteld aan de netheid van het labwerk.(zie: VMT regels, bijlage1) Uitwerking van de experimenten: Alle experimenten moeten beschreven worden in je labjournaal. Het labjournaal moet meteen, dus tijdens en na het uitvoeren van een experiment worden bijgeschreven. Wat is anders gegaan dan in de handleiding staat beschreven? Wat zijn de resultaten, de berekeningen en de antwoorden van de vragen. Wanneer je labjournaal niet voor een ander leesbaar is of niet bijgehouden wordt betekent dit dat je een experiment opnieuw moet uitvoeren en moet opschrijven. De regels voor het schrijven van je labjournaal staan vermeld in bijlage 2. De uitvoering van een experiment wordt altijd gevolgd door een aantal vragen en opdrachten. Deze moeten in het labjournaal worden gemaakt, start op de laatste pagina. 5

7 1.Programma De experimenten worden per koppel uitgevoerd. Er zal veel moeten worden gedaan in 5 uur. Zorg dus voor een goede voorbereiding en werk goed geconcentreerd door. Maak voor ieder practicum de voorbereidingsvragen en opdrachten. Zie bijlage 8. Practicum 1: Maak een flow schema en de voorbereidingsvragen (bijlage 8). Je werkt per koppel en om op tijd klaar te zijn zullen een aantal werkzaamheden goed moeten worden verdeeld. Zorg dus dat je dit van te voren met elkaar bespreekt en verwerk dit in een flow schema! Noteer natuurlijk in je labjournaal wat er precies is gedaan. Bekijk ook wat je nodig hebt! Platen etc. Er zal worden gecontroleerd of dit is gedaan!!dus niet gemaakt is niet meedoen aan het practicum. Er zal gedigesteerd puc18 DNA (190 ng/ lof 70 ng/ l)en DNA(250 ng/ l) aanwezig zijn. (beiden geknipt met Hind III). De vector zal worden gedefosforyleerd (let op dat je alleen de vector defosforyleert!!), gebruik hiervoor 1 µg puc18 X Hind III (zieprotocol 1). Defosforyleren in volume van 20 µl Hierna wordt de ligatie ingezet (zie protocol 1): 100 ng gedefosforyleerd puc18 X Hind III en 1 g DNA X Hind III (na ligatie wordt dit het construct genoemd). De helft van het ligatiemengsels (10 µl) wordt getransformeerd naar E.coli JM109. Hiervoor dienen competente bacteriën (E.coli JM109) te worden gebruikt. Deze moeten worden gemaakt volgens protocol 2. Transformatie: (zie protocol 3) Gebruik per transformatie 50 µl competente cellen + 10 µl ligatie mengsel. De rest van het lig. mengsel wordt ingevroren bij -20 C, zorg dat je goed codeert!!! Na de transformatie worden de cellen uitgeplaat: I. Construct (ligatie) wordt uitgeplaat op LB/Amp/IPTG-Xgal platen (AXI-platen) µl van het mengsel; -de rest wordt afgedraaid en de pellet na resuspenderen uitgeplaat. ( zo heb je min of meer een verdunde en 1 onverdunde) II. 10 ng puc 18 ongeknipt (70 ng/ l),1 l verdund voor de bepaling van de competentie van de competente JM 109 cellen. (er mag 1 verdunning worden gemaakt voor de hele klas) Hiervan wordt 100 µl onverdund en 100 µl van de 10-1 verdunning uitgeplaat op LB/Amp platen en 100 µl van de 10-4,10-5 en 10-6 verdunning op gedroogde LB platen. De platen gedurende 24 uur bebroeden bij 37 C. 6

8 Let op!: Er moeten gedroogde agar platen worden gebruikt voor het uitplaten. De AXI platen zullen aanwezig zijn maar moeten wel worden gedroogd. Codeer de epjes goed en bewaar ze voor practicum 2 in de vriezer (-20 C). Maak een afspraak voor het opgroeien van de kolonies (zie dag voor practicum2, hieronder) Dag voor practicum 2: (Zie protocol 4) 1 witte kolonie en 1 blauwe kolonie aanstippen met een geel puntje of steriele tandenstoker en doorstrijken op een AXI-plaat en vervolgens in LB/amp overnacht laten groeien (voor een DNA isolatie). Strijk ook een kolonie van de LB/Amp plaat met de puc18 getransformeerde bacteriën (II) door op deze AXI-plaat. (Dus 3 verschillende kolonies op 1 plaat en 2 buizen). Practicum 2: Voorbereiding: zie bijlage 8, opdracht 6 inleveren!. DNA isolatie van de witte en blauwe kolonie mbv Qiagen isolatie kit.(protocol 5) Bepaling van hoeveelheid DNA mbv Nanodrop (protocol 6) Digestie van dit puc18/ construct DNA met Hind III om te bepalen welk fragment er is gecloneerd.( 1 µg) (protocol 7). Dit is digestie A (blauw en wit) Ter controle wordt 1 g DNA ongeknipt gedigesteerd met Hind III. (1 g ) digestie B PCR(protocol 8). -Kolonie PCR inzetten van de doorgestreken blauwe en witte kolonie en van de controle puc18 =transformatie II) - PCR van zelf geïsoleerd DNAwit: - PCR controle Practicum 3: Voorbereiding: zie bijlage 8, opdracht 16 inleveren! -Electroforese op een 1,3 % agarosegel van: * Construct- DNA x Hind III ( DNA van blauwe en van witte kolonie) om de grootte van de insert te bepalen (alles van de digestie A bl. en w.) * Construct DNA ongeknipt. (DNA van blauwe en van witte kolonie) * DNA x Hind III (digestie B) * Ter controle wordt puc ongeknipt meegenomen. (200 ng) * De kolonie PCR van de witte en blauwe kolonie,contr..(pcr bl., PCR w.en PCR con.); PCR van DNA wit en milliq. * marker DNA om te grootte van de fragmenten te kunnen bepalen.( in slot 1 en in laatste slot ). ( 0,5 µg Marker II (0,25 µg/ µl) of 1 µg 100 bp marker (0,25 µg/ µl) 7

9 Totaal zijn er dus 11 slots nodig voor digesties en 2 slots voor de markers. Natuurlijk in slot 1 en laatste slot een marker. Maak na ongeveer 30 minuten een foto en nog een als de kleurstof tot ¾ is gelopen. Tijdens de electroforese kan practicum 4 worden voorbereid of de vragen beantwoord. Practicum 4: Huiswerk: Bedenk voor elk cloneerbaar fragment van λ-dna geligeerd in puc18 met welk enzym de oriëntatie van de insert kan worden bepaald. Maak hiervoor een pipeteerschema. Neem ook controles mee! Gebruik hiervoor het programma nebcutter ( cursus BIF12 behandeld). Laat dit controleren, zet de digestie in en na 1 uur de electroforese. De beschikbare enzymen zullen tijdens les 3 worden doorgegeven. 8

10 2. Inleiding In dit practicum zal aandacht worden besteed aan een aantal veelgebruikte recombinant DNA technieken: isolatie van plasmide DNA, digestie van het plasmide DNA met een restrictieenzym, agarose gelelektroforese, ligatie, transformatie, selectie op recombinante bacteriën, alsmede de PCR reactie. In de hierna volgende tekst zullen de verschillende onderdelen van het practicum worden belicht. 2.1 Het experiment Fragmenten van het DNA van faag λ, verkregen door digestie met een restrictie-enzym zullen door ligatie in het multicopy plasmide puc18 gekloneerd worden (Fig. 1). Figuur 1. Schematische weergave van de klonering van fragmenten van faag λ DNA in het puc18 plasmide. Vervolgens vindt transformatie plaats naar een competent gemaakte E. coli stam en wordt op de aanwezigheid van recombinante bacteriën geselecteerd. Van een aantal van deze bacteriën wordt de lengte van de insertie bepaald door de plasmiden te isoleren, vervolgens te digesteren en op een agarosegel te analyseren. De grootte van de insertie zal aangetoond worden door het plasmide DNA te digesteren en een PCR uit te voeren. In figuur 1 is de klonering van DNA fragmenten van faag λ in puc18 schematisch weergegeven. 9

11 2.2 Faag λ Faag λ is een bacteriofaag die E. coli als gastheer gebruikt. Zijn genoom bestaat uit dubbelstrengs lineair DNA met een lengte van 48,5 kb. Aan de uiteinden bevinden zich een 12-tal enkelstrengs nucleotiden, welke 5' overhangend zijn. Deze worden "cohesive" uiteinden genoemd of kortweg "cos-sites". Deze uiteinden zorgen ervoor dat het lineaire DNA bij binnenkomst van de faag in de gastheercel circulair wordt, waarna het DNA gerepliceerd kan worden.naast het gebruik van faag λ als vector voor de constructie van DNA- of cdna banken (Old and Primrose, 1994) wordt het virale DNA veel gebruikt om lengte referenties van te maken. De nucleotidevolgorde van het virus is geheel bekend (Sanger, 1982), zodat de lengte van de DNA fragmenten exact berekend kan worden. In figuur 2 is voor verschillende restrictie-enzymen de knipplaats op het faag λ genoom weergegeven. Voor dit practicum zal het DNA van faag λ met een restrictie-enzym geknipt worden teneinde de fragmenten voor een klonering te kunnen gebruiken en kan het DNA als marker bij de agarose gelelektroforese worden gebruikt. In bijlage 6 is meer informatie te vinden over de knipplaatsen van faag Lambda. 2.3 Het plasmide Als vector zal in dit experiment het "multicopy" plasmide puc18 worden gebruikt. Figuur 3 laat een schematische weergave van het puc18 plasmide zien. 10

12 Fig. 3. Weergave van de opbouw van het puc18 plasmide (Fermentas.com). Duidelijk aangegeven zijn de ori (origin of replication), het amp gen dat voor resistentie tegen het antibioticum ampicilline codeert, een deel van het lacz gen, dat codeert voor het α-deel van het eiwit ß-galactosidase, en de polylinker of multikloneringsplaats ("polycloning site"). De polylinker bestaat uit een 13-tal unieke restrictiesites die vlak naast elkaar liggen (zie Fig. 4). Fig. 4. De sequentie van de polylinker van puc18 (Fermentas.com). Deze restrictiesites zijn bij uitstek geschikt om in te kloneren. De aanwezigheid van de polylinker in het lacz gen heeft geen invloed op de synthese van een goed functionerend α-deel van het ß-galactosidase. Bij insertie van een DNA-fragment in één van de restrictiesites van de polylinker wordt het leesraam van het ß-galactosidase dusdanig verstoord dat er géén functioneel deel van het ß-galactosidase meer door het lacz gen kan worden geproduceerd. Selectie op het al dan niet functioneren van het eiwit vindt plaats door het plasmide in een E.coli stam te kloneren. In ons geval is dat E.coli JM109. Deze bacterie codeert voor het resterende deel van het ß- galactosidase en complementeert daarmee het α-deel van het eiwit dat door het oorspronkelijke puc18 plasmide wordt gesynthetiseerd. Deze zogenaamde α-complementatie kan niet plaats vinden als er in de polylinker van het puc18 plasmide een insertie van een stuk DNA heeft plaatsgevonden. Of een bacterie in staat is tot α-complementatie kan worden aangetoond met indicatorplaten waarin naast het antibioticum ampicilline de inductor IPTG (isopropylthio-ß-dgalactoside) aanwezig is en het substraat X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactoside). 11

13 Dit zijn AXI platen. Bij complementatie worden de bacterie-kolonies blauw, bij afwezigheid van complementatie blijven ze wit. Deze directe vorm van screening zal bij de klonering van DNA fragmenten van faag λ in het puc18 plasmide gebruikt worden. Kortom: de vector met insert geeft een witte kolonie en de vector zonder insert geeft een blauwe kolonie. 2.4 Het construct Door het DNA te digesteren met HindIII worden verschillende fragmenten verkregen (zie fig. 2). Door nu ook puc18 met HindIII te digesteren kunnen deze fragmenten mbv ligatie in dit plasmide worden gecloneerd (protocol 2). Om te voorkomen dat puc 18 dicht ligeert zonder insert wordt de vector na het knippen gedefosforyleerd. Hierbij wordt een fosfaatgroep aan de 5 kant verwijderd, zodat de vector niet meer zelf kan sluiten. 2.5 Transformatie van E. coli Met een zeer lage frequentie zijn bacteriën, waaronder E. coli, in staat om DNA op te nemen. Dit proces wordt, als het om "naakt" DNA gaat, transformatie genoemd. De efficiëntie van de DNA opname kan sterk verhoogd worden door een goed groeiende, in de logaritmische fase verkerende, bacteriecultuur competent te maken. Er zijn verschillende manieren bekend om cellen competent te maken.dit Wij zullen wij de rubidium chloride methode gebruiken en de E.coli JM109 gebruiken. Na toevoeging van het DNA volgt na een incubatie een hitteschok en kan op de verkregen transformanten worden geselecteerd (Mandel and Higa, 1970). Er is ook een methode ontwikkeld waarbij het gebruik van calciumchloride en de hitteschok overbodig zijn geworden. Chung et al. (1989) beschrijven een methode waarbij goed groeiende bacteriën in een zogenaamde transformatiebuffer worden opgenomen, waaraan direct het DNA kan worden toegevoegd. Na een incubatie van 30 minuten kan op de verkregen recombinanten worden geselecteerd. Met deze methode waarbij PEG, DMSO en Mg 2+ aan de cellen wordt toegevoegd kunnen transformanten per μg plasmide DNA worden verkregen. Door het DNA van het construct hier aan toe te voegen zullen deze E.coli cellen het DNA opnemen. Vervolgens wordt dit uitgeplaat op platen die IPTG/X-GAL en ampicilline bevatten. (zie protocol 3) 2.6 Isolatie plasmide DNA In dit experiment wordt het recombinant puc 18 plasmide, met een faag lambda insertie erin, uit een bepaalde Escherichia coli (E. Coli) stam geïsoleerd. Voor de isolatie wordt van een commerciële kit (Qiagen) gebruik gemaakt. Deze kit bevat alles om in 1-1½ uur een relatief hoge opbrengst aan plasmide DNA te krijgen. Het voorschrift is te vinden in protocol 4. Het principe en de veiligheidsregels in Bijlage 3. Omdat we bij dit experiment geen last willen hebben van ongewenste afbraak van het DNA wordt uitsluitend met gesteriliseerde materialen gewerkt. Al deze materialen en oplossingen zijn via een filter gesteriliseerd of geautoclafeerd. 12

14 2.7 Electroforese van plasmide DNA Voor de analyse van de grootte van plasmiden of de lengte van DNA fragmenten is electroforese een eenvoudige en doeltreffende methode. Als matrix zijn acrylamide- en agarosegels te gebruiken, waarbij de laatste soort op dit practicum zal worden toegepast. Agarose is een polysaccharide dat gewonnen wordt uit zeewier. Het scheidend vermogen van de agarosegel is afhankelijk van het percentage agarose in de gel, dat kan variëren tussen 0,3 en 2% (Fig. 5 en 6). Binnen bepaalde grenzen van de molmassa geldt een lineair verband tussen de migratie van het DNA fragment en de logaritme van de lengte van het fragment. Ieder percentage vertoont een optimale scheiding voor fragmenten van een bepaalde lengteklasse. Gels met een laag agarosepercentage kunnen grote DNA fragmenten beter scheiden dan gels met een hoog agarosepercentage. De electroforese vindt plaats in een buffer van ph 7.8. Onder deze omstandigheden treedt tijdens de electroforese scheiding op basis van grootte i.p.v. op lading. De migratiesnelheid is echter ook afhankelijk van de vorm van het DNA, zoals in figuur 7 wordt weergegeven. Fig. 6. Door gebruik te maken van gels met verschillende concentraties agarose, kan men kan men DNA fragmenten van verschillende groottes beter van elkaar. Hogere concentraties vergemakkelijken de scheiding van kleine fragmenten, terwijl met lage percentages de grotere DNAs beter te zien zijn. 13

15 Plasmide DNA kan na isolatie in verschillende vormen worden aangetroffen: - de covalent gesloten cirkel (ccc = "covalently closed circular") waarbij het DNA een "supercoiled" vorm heeft, - de open circulaire vorm, waarbij in één van de strengen minstens één breuk (een "nick") is ontstaan, - de lineaire vorm, - multimere of "concatenated" vormen, afhankelijk van de vermenigvuldiging van het plasmide in een rec + - of een rec - -stam. Fig. 7. Circulair (ongeknipt) DNA migreren anders in agarosegels dan lineair DNA met de zelfde grootte. Er worden twee vormen onderscheiden van het ongeknipte DNA: supercoiled en nicked circles (linker laantje). Deze migreren respectievelijk sneller en iets trager dan de lineaire vorm (rechter laantje). Bij de isolatie van plasmide DNA kunnen de verschillende vormen in verschillende verhoudingen voorkomen. De genoemde vormen van het plasmide DNA migreren afhankelijk van de electroforeseomstandigheden, elk met een verschillende snelheid door de agarosegel. Dit verschijnsel maakt het onderling vergelijken van de lengtes van verschillende plasmiden nogal moeilijk. Om dit probleem te omzeilen zet men voorafgaande aan de electroforese alle plasmide vormen om in de lineaire vorm door te knippen met een restrictie-enzym. Het DNA kan in de gel zichtbaar gemaakt worden door middel van de mutagene stof ethidiumbromide in combinatie met UV-licht. Ethidiumbromide (Fig. 8) gaat tussen de baseparen van het DNA zitten. Dit wordt intercalatie genoemd. Na bestraling met UV-licht fluoresceert het ethidiumbromide-dna complex en licht het DNA oranjerood op. Het nadeel van deze methode is dat door de aanwezigheid van ethidiumbromide in het DNA bij de replicatie mutaties kunnen ontstaan. Bovendien is dit DNA ook nog onderhevig aan een tweede mutageen effect, nl. de bestraling van het DNA met UVlicht. 14

16 Bekend is dat dit o.a. thymidinedimeren oplevert. Afhankelijk van welke handelingen er na de electroforese van het DNA nog allemaal met het DNA dienen te gebeuren (bv. subkloneren van een uit de gel gesneden DNA fragment) sequenced men het construct soms om er zeker van te zijn dat er geen ongewilde mutaties hebben plaatsgevonden. Voor het werken met ethidiumbromide gelden bepaalde veiligheidsmaatregelen en is enige voorzichtigheid geboden. Zie hiervoor de regels in bijlage De polymerase-kettingreactie (PCR) De polymerase-kettingreactie, kortweg aangeduid met PCR ("polymerase chain reaction"), maakt het mogelijk om in korte tijd in vitro DNA zeer sterk te vermenigvuldigen. Het principe van de reactie is ontleend aan het DNA replicatie proces zoals dat in vivo gebeurt. Dubbelstrengs DNA wordt slechts dan gerepliceerd als het de primer met een 3`-OH groep is gehybridiseerd met het enkelstrengs template DNA (zie figuur 10). Fig.10. De PCR vindt plaats in cycli van denaturatie (melting), hybridisatie (annealing), en polymerisatie (extension). Alhoewel dit startpunt in vivo een RNA primer is, voldoet (in vitro) een DNA oligonucleotide als primer ook. In vitro kan het dubbelstrengs DNA enkelstrengs worden gemaakt door verhitting (denaturatie) waarna (bij een lagere temperatuur) DNA primers aan het enkelstrengs DNA kunnen binden en het DNA polymerase de keten kan verlengen. Deze drie stappen vormen de basis van de PCR: 1) denaturatie van het dubbelstrengs DNA, 2) hechten van de primers, 3) verlenging van de DNA ketens. 15

17 De drie stappen verlopen ieder bij een andere temperatuur (Fig. 11). Fig. 11. Schema van de driestaps temperatuursprofiel van een PCR. Door na stap 3 de temperatuur weer te verhogen tot die van stap 1 denatureert het verkregen dubbelstrengs DNA weer en kan het proces weer van voren af aan beginnen. Dit is de grote kracht van de PCR methode. De vermeerderingscyclus (stappen 1 t/m 3) kan in hetzelfde epje vele malen herhaald worden door de temperatuur te veranderen. Het resultaat is een exponentiële toename van het gesynthetiseerde DNA. Sinds de vondst van een thermostabiel DNA-afhankelijk DNA polymerase, het Taq polymerase afkomstig uit Thermophilus aquaticus, kan de PCR in geautomatiseerde vorm uitgevoerd worden. Inmiddels zijn er een groot aantal verschillende DNA polymerases op de markt die verschillen in stabiliteit, fidelity (in hoeverre ze foutjes in het gesynthetiseerde DNA kunnen corrigeren) en processivity (de lengte van het DNA wat gesynthetiseerd kan worden). Naast het oorspronkelijke Taq polymerase is ook de gekloneerde versie verkrijgbaar en zijn er verwante enzymen uit andere organismen geïsoleerd. Sinds de ontwikkeling van de PCR in 1983 wordt deze methode op vele gebieden toegepast, zoals in de diagnostiek voor het specifiek aantonen van virussen en bacteriën in patiëntenmateriaal, en in de forensische geneeskunde voor bv. het vaststellen van de vader of van de dader of als techniek om bv. gericht mutaties te introduceren. In ons geval zal de PCR worden gebruikt om de grootte van het insert λ DNA in puc18 te bepalen. De primers zijn dan ook zo gekozen dat ze aan weerszijden van de in de digestie gebruikte restrictiesite in de polylinker aan het puc18 DNA hechten. 16

18 Protocol 1. Defosforylering en ligatie Benodigdheden - defosforylering- en ligatiekit: Rapid DNA Dephos & ligation kit (Roche) - 37 C waterbad - 75 C waterbad. - steriel water (milli Q) - steriele pipetpunten Procedure Defosforylering Defosforyleer alleen het geknipte vector DNA volgens onderstaand schema: x µl (1 µg ) puc18/hindiii (190 ng/ l) 2 µl rapid Alkaline Phosphatase buffer (10x) y µl milli Q Meng goed en voeg toe: 1 µl rapid Alkaline phosphatase (1 U/ µl) µl Meng goed en centrifugeer kort. Incubeer 30 minuten bij 37 C. Inactiveer daarna het enzym door het mengsel 2 minuten bij 75 C te plaatsen. Ligatie Gebruik het gedefosforyleerde plasmide direct in de ligatie reactie: 2 µl (100 ng) gedefosforyleerd puc18*hindiii x µl ( 1 µg) λ DNA*Hind III (250 ng/µl) 2 µl 5x dilutiebuffer y µl milli Q µl Meng goed en voeg toe: 10 µl 2x T4 ligatiebuffer 1 µl T4 ligase (5 U/ µl) Meng goed en centrifugeer kort. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Na de ligatie kan het ligatiemengsel direct gebruikt worden voor de transformatie of het kan tot gebruik bij -20 C bewaard worden. Let op : codeer je epjes goed!! 17

19 Protocol 2. Het maken van competente cellen (E.coli) m.b.v. rubidium chloride. Benodigdheden: Alle oplossingen en te gebruiken materialen zijn 20 min. bij 120 C gesteriliseerd (tenzij anders vermeld). Alle oplossingen zijn in demiwater gemaakt. -Overnachtcultuur E. coli JM 109 -LB medium: Per liter: 10 g Trypton, 5 g gist extract, 10 g NaCl ph 7,4. 20 min. 120 C steriliseren (autoclaaf of snelkookpan). NB. indien er agarmedium van gemaakt moet worden, dan pas na toevoegen van de agar steriliseren. - Tfb1, ijskoud 30mM natriumacetaat, 100mM rubidium chloride,10 mm calciumchloride, 50mM manganese chloride, 15 % glycerol; ph 5,8 met verdunde azijnzuur,filter sterileren. Bewaren bij kamertemperatuur. - Tfb2, ijskoud 10 mm MOPS, 75 mm calcium chloride, 10 mm rubidium chloride, 15% glycerol; ph 6,6 met NaOH, filter steriliseren. Bewaren bij kamertemperatuur -Eppendorf buisjes, pipetten en pipetpunten -Spectrofotometer -Schudwaterbad van 37 C -plastic centrifugebuis met dop (Greiner) - CENTRIFUGE WELKE??? Procedure: -1: Haal een losliggende kolonie van een LB plaat en ent die in een buis met 5 ml LB medium. Incubeer overnacht bij 37 C in de shaker (ong. 225 rpm) -2: Maak een 1: 100 verdunning van de overnachtcultuur van JM 109 (KL 1) in 10 ml LB medium in een 100 ml kolf. Dit is al ingezet! -3: Verdun de o/n cultuur 1:100 in LB met 20 mm MgSO 4.! Incubeer bij 37 C in het schudwaterbad totdat de cultuur een A 600 heeft van ca. 0.5 (tussen 0,4 en 0,6) t.o.v. de blanco. Wat is de blanco? Dit duurt ongeveer 3 uur,de cultuur is al ingezet. Gebruik voor het tussendoor meten van de absorbantie bij voorkeur een cuvet die na iedere meting gespoeld wordt met alcohol. -4: Centrifugeer de cultuur 5 min. bij 1500 rpm en 4 C in een steriele Greinerbuis. Schat hier het volume.(=beginvolume) -5: Neem de cellen rustig op in 0,4 van het beginvolume in ijskoude Tfb1.Voor 10 ml is dit dus 4 ml. Resuspendeer de cellen door met de hand te tikken of met een pasteurse pipet op te zuigen en weer te pipetteren. De cellen moeten koud blijven!!! -6: Incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten. -7: Pelleteer de cellen door af te draaien 5 min. bij 1500 rpm en 4 C -8 : Neem de cellen rustig op in 1/25 van het beginvolume in ijskoude Tfb2. Voor een 10 ml cultuur dus 400 l. Je hebt genoeg voor 8 transformaties. 18

20 Als de cellen worden bewaard: minuten op ijs, daarna snel invriezen (vloeibare stikstof). De cellen blijven stabiel bij -70 C gedurende 1 jaar. Een transfomatie met 50 l van deze competente cellen met 2-10 l ligatie mengsel zou tussen de 10 8 en 10 9 kve/ g DNA moeten geven. (Dit noem je de competentie van de cellen). Opdrachten: Bereken de competentie van de gemaakte cellen door na transformatie en bebroeden, de kolonies te tellen van de platen. Bereken ook het percentage transformanten. Vermeld deze gegevens in je labjournaal! 19

21 Protocol 3. Transformatie Bij een geslaagde transformatie van E. coli met het ligatiemengsel is er sprake van een genetisch gemodificeerd organisme (GGO). De Hogeschool Rotterdam heeft een vergunning om met GGO s te werken (zie bijlage 1). Het werken met GGO s mag uitsluitend plaatsvinden in de VMT-ruimte (tijdens het practicum is dat de entkamer) en is aan strikte regels gebonden: bestudeer daarom de Specifieke voorschriften met betrekking tot VMT ruimten in het kader van het werken met GGO s. Vul in het logboek in de entkamer je naam, studentnummer en datum in. Benodigdheden Alle oplossingen en te gebruiken materialen zijn 20 minuten bij 120 C gesteriliseerd (tenzij anders vermeld). Alle oplossingen zijn in demiwater gemaakt. - Competente bacterien E. coli JM109 - LB platen. - LB + Amp platen - LB + Amp, IPTG en X-gal (AXI) platen,deze zullen klaar staan. - LB medium (per liter: 10 g trypton; 5 g gist extract; 10 g NaCl, ph 7.4). 20 minuten bij 120 C steriliseren (autoclaaf, 15 psi). NB. indien er agar medium van gemaakt moet worden, dan pas na toevoegen van de agar steriliseren. - LB agar(lb medium met 15 g agar per liter), agar pas toevoegen nadat het LB medium helder is, daarna steriliseren. De agar lost op tijdens het autoclaveren mg/ml ampicillineoplossing (Amp; -20 C), verdun 1:500 in LB mg/ml IPTG oplossing (-20 C), gebruik 10 μl per 25 ml LB mg/ml X-gal oplossing (-20 C; bewaar in het donker!), gebruik 30 µl per 25 ml LB. - ijsbak - petrischalen - fysiologisch zout (FZ; 9 g NaCl per liter) in buizen van 9 ml - eppendorfbuisjes, koud!, pipetten en pipetpunten - schudwaterbad van 37 C - heat block of waterbad van 42 C - broedstoof van 37 C - Drygalsky spatels Voor het maken van de agar platen: zie bijlage 1 Microbiologische Methoden. Procedure Werk vanaf nu in de entkamer! 1. De competente cellen vers gemaakt gebruiken of net voor gebruik 5 minuten ontdooien op ijs,daarna zo snel mogelijk weer in - 80 C. Zorg dat de cellen nooit warmer dan 4 C worden! 2. Pipetteer per transformatie 50 l competente cellen in een koud eppendorfcupje en 20

22 voer 2 verschillende transformaties uit door toevoeging van onderstaande DNA samples: I. de helft(10 l)van het ligatiemengsel (puc18*hindiii+λ DNA*HindIII, construct of ligatie a.). II. 10 ng puc18 ongeknipt. Werk snel en zorg dat de cellen niet boven de 4 C komen. Voorzichtig mengen door een paar keer tegen het epje aan te tikken. 3. Incubeer 15 minuten op ijs. 4. Heat-shock 90 seconden in waterbad of heat Block van 42 C (niet schudden!) 5. Onmiddellijk 2 minuten op ijs 6. Voeg aan elk transformatiemengsel 1 ml LB medium (zonder amp!), ( 4 C) toe, meng voorzichtig en incubeer het geheel 1 uur in een 37 C schudwaterbad (zacht schudden)om de cellen de gelegenheid te geven het β-lactamase (Amp R ) van het plasmide tot expressie te brengen. 7. Uitplaten: Zet van tevoren goed gedroogde agarplaten klaar ( 2 x AXI, 2 x LB/amp en 3 LB) en merk de bodem langs de rand met zo min mogelijk tekst. Breng 0,1 ml vloeistof van I (Ia) en II (IIb)op de plaat en strijk uit met een drigalsky-spatel tot de oppervlakte van de plaat droog is. Je plaat 7 keer uit, zie onder. Plaat uit: I. a.100 l construct op AXI plaat I. b. rest construct op AXI plaat ( in centrifuge 2 minuten afdraaien bij 2000 rpm, meeste afgieten en pellet opnemen in nog aanwezige vloeistof, dit is ongeveer 100 l ). II. a.100 l II op LB/amp plaat II. b. 100 l 10-1 verdunning van II op LB/amp platen. II. c.100 l 10-4, 10-5 en 10-6 verdunnig van II op LB platen. 7.Incubeer de platen ondersteboven gedurende 24 uur in een 37 C broedstoof. 8. Haal de platen uit de stoof als er duidelijk kolonies te zien zijn en bewaar ze in de koelkast tot de volgende practicumdag. Eén dag vóór de volgende practicumdag : Om materiaal voor de kolonie PCR te hebben wordt een tandenstoker of een steriele geel puntje op een AXI plaat doorgestreept en vervolgens in een buis met 3 ml LB/amp (voor DNA isolatie) geplaatst. De plaat wordt overnacht bij 37 C bebroed, de buizen overnacht in de shaker in de 37 C kamer.( Zie ook protocol 4). Hiervoor wordt er van de AXI-plaat (I a of Ib) één blauwe en één witte kolonie gehaald en 1 kolonie van de puc 18 ongeknipt (II a of b). 7. Na overnacht groeien van de vloeibare cultures wordt op de practicumdag zelf een plasmide-isolatie ( mbv Qiagen) uitgevoerd en van de platen worden bacteriën gehaald voor een kolonie PCR. (zie protocol 5en 8). 21

23 Protocol 4. Microbiologische methoden a. Het gieten van de platen b. Het opkweken van bacteriën en plasmide isolatie Benodigdheden LB medium (per liter: 10 g trypton; 5 g gist extract; 10 g NaCl; ph 7.4). 20 minuten bij 120 C steriliseren (autoclaaf, 15 psi). NB. indien er agarmedium van gemaakt moet worden, dan pas na toevoegen van de agar steriliseren. LB agar medium (LB medium met 15 g agar per liter), agar pas toevoegen nadat het LB medium helder is, daarna steriliseren. De agar lost op tijdens het autoclaveren. 50 mg/ml ampicillineoplossing (Amp; -20 C), verdun 1: mg/ml IPTG oplossing (-20 C), gebruik 10 μl per 25 ml LB. 40 mg/ml X-gal oplossing (-20 C; bewaar in het donker!), gebruik 30 µl per 25 ml LB. steriele petrischalen steriele cocktailprikkers steriele Eppendorfbuisjes en pipetpunten steriele glazen reageerbuizen met metalen dop Procedure a.gieten van de LB agarplaten 1. Maak LB agarmedium. Doe het medium in een serumfles of in een erlenmeyer met wattenprop en steriliseer het 20 min. bij 120 C. 2. Laat de vloeistof tot 60 C afkoelen, meng het goed, giet het medium rustig in een steriele petrischaal en laat de agar stollen. Per plaat ongeveer 20 ml gebruiken. 3. LB + Amp agarplaten worden gemaakt door aan de handwarme oplossing ampicilline toe te voegen met een eindconcentratie van 100 µg/ml. 4. De LB + AXI agarplaten staan klaar. Naast amp bevatten deze plateniptg ( eindconc. 0.1 mm) en Xgal ( eindconc. 40 µg/ml). De LB + Amp en de LB + AXI agarplaten kunnen korte tijd in de koelkast bewaard worden. Houd hierbij een termijn van maximaal een week aan. LB agarplaten blijven langer goed mits ze tegen uitdrogen worden beschermd. Voor gebruik moeten de platen gedurende ong. 30 minuten gedroogd worden. 22

24 b.opkweken bacteriën: Het opkweken van een kolonie voor een plasmide isolatie ( miniprep ) kan op de volgende manier gebeuren. Aan het LB medium moet altijd antibioticum (hier: ampiciline) toegevoegd worden! Deze zogenaamde selectiedruk is nodig om te voorkomen dat de bacteriën het plasmide verliezen. 1. Pipetteer per reageerbuis 5 ml LB + Amp medium. 2. Prik met een cocktailprikker/geel puntje de kolonie aan, zet een streepje op een verse LB + Amp +IPTG/XGal agarplaat en doe de prikker in de gemarkeerde reageerbuis (zie figuur 19). 3. Zet de buis zo schuin mogelijk in een rekje in de shaker in de 37 C kamer en incubeer overnacht. 4. Voor het doorstrepen van meerdere kolonies is een goede nummering op de agarplaat en de reageerbuizen essentieel. De agarplaat wordt uur op z'n kop in de 37 C broedstoof geïncubeerd en vervolgens dichtgesealed in de koelkast bewaard. Fig.12: Schematische weergave van het aanprikken, doorsrepen en enten van een kolonie. 23

25 Protocol 5. Isolatie van plasmide DNA m.b.v. de Qiaprep kit Voor de isolatie van plasmide DNA wordt gebruik gemaakt van het QIAprep Spin Miniprep Kit systeem. Het complete voorschrift is hieronder weergegeven. Gebruik 4 ml overnachtcultuur door tweemaal achtereen in één epje 2 ml overnachtcultuur te pipetteren en te centrifugeren ( 3 minuten 1000 rpm). Let op de pellet! Iedere student voert deze isolatie individueel uit! Voor alle centrifugatie stappen : de maximale snelheid in een eppendorfcentrifuge. Het volume van het verkregen plasmide isolaat is ca. 100 µl. Wees hier zuinig mee! Bewaar het in de vriezer of zet het op tafel in een ijshoed als je experimenten uitvoert! Codeer het epje goed en zorg dat het niet zoek raakt in de vriezer. Gooi niets weg voor het einde van de practicumperiode. 24

26 25

27 Protocol 6. Het gebruik van de Nanodrop spectrofotometer Start apparaat door de adapter in het stopcontact te steken en start de computer. Klik op het icoon van de Nanodrop op het bureaublad, waarna het programma wordt gestart. Fig.13: de nanodrop spectofotometer Druk op de knop in het hoofd menu Nucleic acid (zorg ervoor dat de klep van de nanodrop dicht is). Kies Sample Type DNA-50. Druk op OK. (Nanodrop geeft een luide klik) Voordat er gemeten kan worden moet de blanco bepaald worden. Wat gebruik je als blanco?. 1. Doe de blanco (3 µl) op de onderste meetsokkel van de Nanodrop. Doe dan de arm met de bovenste meetsokkel rustig naar beneden. Niet aanduwen! 2. Klik op de Blank (F3) knop. 3. Veeg de blanco met een tissue van de beide meetsokkels. 4. Doe een tweede blanco (3 µl) op de onderste meetsokkel van de Nanodrop. Doe dan de arm rustig naar beneden. Niet aanduwen! 5. Klik op de Measure (F1) knop. Het resultaat moet een spectrum geven met een bijna platte basislijn. Is dit niet het geval herhaal dan de voorstaande stappen beginnend bij punt Is er wel een platte basislijn, dan is de Nanodrop klaar voor meting. Fig.14: het pipetteren op de nanodrop Fig.15: schoonmaken van de nanodrop Meten van DNA (scannen nm) Veeg met een tissue eventueel achtergebleven resten van je voorganger van de beide meetsokkels. 1. Doe het monster (3 µl) op de onderste meetsokkel van de Nanodrop. Doe dan de arm met de bovenste meetsokkel rustig naar beneden. Niet aanduwen! 2. Geef je monster een Sample-ID (bijvoorbeeld je naam en nummer) 3. Klik op de Measure (F1) knop. Er komt een grafiek in beeld. 4. Print screen zal deze grafiek printen. 5. Print Report zal de gegevens printen. 6. Vergeet niet je monster met een tissue van de beide meetsokkels af te vegen. 26

28 Protocol 7. Het knippen van DNA met een restrictieenzym Benodigdheden: - het zelf geïsoleerde plasmide DNA - referentieplasmide puc18 (0.1 μg/μl) - DNA van faag λ (0.25 μg/μl) - restrictie-enzym HindIII (1U/μl) - restrictiebuffer (10x; van Roche; -20 C). - steriel water (milli Q water) - steriele Eppendorfbuisjes en pipetpunten - waterbaden van 37 C en 65 C NB. Houd de oplossingen zoveel mogelijk op ijs. Dit is voor de restrictie-enzymen en het DNA van belang. Haal deze zo laat mogelijk uit de vriezer! Gebruik bij het pipetteren van de restrictie-enzymen altijd een schone en steriele pipetpunt en zorg dat de enzymen op ijs blijven!! Alleen het bovenste deel van het epje vasthouden. Procedure: Het volume van het reactiemengsel waarin DNA wordt geknipt hangt sterk af van de volgende stap die met het geknipte DNA moet worden uitgevoerd. In ons geval moet het gedigesteerde DNA op een agarosegel worden bekeken. Het maximale volume van een slotje in de gel waarin het monster wordt gepipetteerd is 25 µl. Voor het knippen van DNA wordt hieronder een een pipetteerschema gegeven. Omdat de concentraties van de verschillende te gebruiken DNA oplossingen kunnen variëren wordt per digestie de hoeveelheid te pipetteren DNA vastgesteld. De hoeveelheid water kan dan worden aangepast. Informeer dus steeds eerst bij de docent. Als richtlijn geldt dat 0,2 µg puc DNA en 1 μg faag construct DNA in een agarosegel goed zichtbaar is. Digestie van puc 18 /λ -constuct DNA (wit en blauw) met het restrictie-enzym HindIII x µl ( 1 μg) DNA (x µg/µl) 2 µl 10x restrictiebuffer B* y µl milli Q water meng goed en voeg als laatste toe: 1 µl restrictie-enzym HindIII (2U) (Er zal door een van de studenten een verdunning worden gemaakt van 2U/ µl µl totaal. Meng goed! * HindIII knipt optimaal in restrictiebuffer B van Roche. Neem voor de controle digestie 1 μg λ DNA mee. (250 ng/μl) 27

29 Maak nu zelf een pipetteerschema voor de digestie van: a. 1 µg van de zelf geïsoleerde plasmide DNA s, wit en blauw (de concentratie is bekend van het spectrum) in een digestievolume van 20 µl totaal. b. 1 μg referentie λ DNA met een concentratie van 0.25 µg/µl in 20 µl totaal digestievolume. Er worden dus in totaal drie digesties ingezet. Laat de digestie-schema s controleren door de docent. Ga dan als volgt te werk: 1. Pipetteer het DNA, de buffer en het water bij elkaar. 2. Meng alles goed en voeg dan pas het enzym toe.eventueel kunnen druppeltjes aan de wand naar beneden worden gebracht door enkele seconden te centrifugeren in de eppendorfcentrifuge ( short spin ). 3. Incubeer de digesties 1 uur bij 37 C. Zorg dat de epjes goed dicht zijn zodat er geen vloeistf kan verdampen. Het geknipte DNA zal gebruikt worden voor agarose gelelektroforese. Dit gebeurt volgens het protocol: Electroforese op agarosegels (protocol 8,9 en 10). Langdurig bewaren van DNA monsters kan het beste bij 20 C. 28

30 Protocol 8. (Kolonie) PCR Aan de hand van de digesties krijg je een idee van de grootte van het stuk faag lambda DNA dat in jouw puc 18 plasmide is gekloneerd. Misschien is het ook nog niet duidelijk omdat je nauwelijks verschil ziet met het gewone puc 18 plasmide. Met behulp van de PCR reactie kan het duidelijk worden welke insertie er in jouw puc 18 plasmide zit. De primers die voor het PCR-en worden gebruikt zitten aan weerszijden van de multi-kloneringssite van puc 18. Het stuk DNA dat wordt vermenigvuldigd heeft dus in het geval van puc 18 DNA een bepaalde grootte. De insertie maakt dit fragment groter. Voor dit experiment gebruiken we een kolonie-extract. De DNA producten die bij de PCR reactie worden gemaakt kunnen weer via agarosegel electroforese worden bekeken. Benodigdheden: - platen met doorgestreepte kolonies van het construct (wit en blauw) en puc18 (con.) - steriel Milli Q water - waterbad of heat block 95 C - PCR mix (wordt verstrekt, bestaat uit reactiebuffer; 0,2 mm van elke dntp; 1 nm forward primer en 1 nm reversed primer; Taq polymerase) - reverse primer: 5 -tga-gcg-gat-aac-aat-ttc-ac-3 - forward primer: 5 -ccc-agt-cac-gac-gtt-gta-3 - steriele PCR epjes (let op deze zijn veel kleiner dan de 1,5 ml epjes; er kan maar 500 µl in). - steriele puntjes - PCR apparaat = Uitvoering: - pipeteer 50 µl MilliQ in een epje - Prik met een steriel geel puntje in een kolonie zonder in de agar te komen.wij hebben een dag voor dit experiment streepjes van de kolonies gemaakt dus gebruik deze verse bacteriën. - spoel het puntje door op en neer te pipetteren met de milliq. - Incubeer de epjes met bacteriesuspensie 5 min. Bij 95 C - Centrifugeer de epjes gedurende 1 minuut in een eppendorf tafelcentrifuge (maximale snelheid) om het condens uit de deksel te krijgen en de eventuele intacte bacterien in een pellet te krijgen. - Bovenstaande vloeistof is het kolonie-extract. Pipetteer in vijf steriele PCR epjes 23 μl PCR mix en voeg toe aan: epje 1: 2 μl kolonie extract van de blauwe kolonie (transformatie I) epje 2: 2 μl kolonie extract van de witte kolonie (transformatie I) epje 3: 2 µl kolonie extract van de puc 18 (contr.) (transformatie II) epje 4: 2 μl 100x verdund plasmide DNA uit een witte kolonie, dus zelf geïsoleerd DNA. epje 5: 2 μl steriele milliq 29

31 Meng dit goed (op en neer pipetteren) en sluit het epje. De PCR wordt uitgevoerd onder de volgende condities: De PCR wordt uitgevoerd onder de volgende condities: 1. 3 minuten bij 94 C seconden bij 94 C seconden bij C 4. 3 minuten bij 72 C 5. herhaal stappen 2 t/m 4 29 maal minuten bij 72 C 7. 5 minuten bij 20 C Pipetteer bij elk epje 6 μl 5 x opbrengbuffer, meng goed en breng 15 µl op op een 1 % agarose gel (zie protocol 8 t/m 11) en run dit samen met de digesties. Als je de PCR zonder de digesties runt is het verstandig om een 1.5 % agarose gels te maken. Breng daarnaast 10 μl van de 100 bp DNA ladder (bijlage 7) op en electroforeer bij maximaal 100 V (zoek uit welke groottes de fragmenten hebben in deze ladder). Seal de gel in, maak een opname en interpreteer de resultaten. 30

32 Protocol 9. Het gieten van de agarose gel: De gehele procedure is hieronder beschreven. Tevens zijn er verduidelijkende figuren opgenomen. In de agarosegel wordt ethidiumbromide gebruikt. Lees de speciale veiligheidsregels hierover zeer goed door (zie bijlage 2)! Er zijn 2 verschillende gelbakken aanwezig. Met de grote gelbak kunnen 20 monsters tegelijk worden ge-electroforeerd. Met de kleine gelbak (7 x 10 cm) kunnen 8 monsters tegelijk worden ge-electroforeerd. Onderstaande beschrijving is voor de grote gelbak. Voor de kleine gelbak (7 x 10 cm) moet 35 ml agarose-oplossing worden gemaakt. Pas de hoeveelheden zelf aan. 1: Maak 100 ml 0,8% agarose-oplossing in 1 x geconcentreerde TAE buffer in bv. een 250 ml erlenmeyer (er onstaat nu een troebele oplossing). Breng de oplossing (in de magnetron) aan de kook en laat de geheel heldere oplossing tot ± handwarm afkoelen (er mogen geen schilfertjes agarose meer zichtbaar zijn). 2: Maak ondertussen de elektroforese-apparatuur klaar door de elektroforesebak, de gelhouder en kam goed schoon te maken (met water, gevolgd door alcohol). 3: Plak vervolgens de gelhouder met schilderstape goed af (zie figuur 10). 4: Zet de gelhouder op een speciale groene luier in de zuurkast en plaats de kam zo dat er ± 2 mm ruimte tussen de kam en de gelhouder overblijft en er ongeveer 1 cm tussen de tanden van de kam en de tape in zit (fig. 11). 5: Voeg 100 l ethidiumbromide-oplossing toe aan de handwarme agarose oplossing (draag handschoenen!!), meng door de erlenmeyer te zwenken en giet de agarose-oplossing in de gelhouder (fig. 12). Verwijder eventuele luchtbellen (met een pasteurse pipet of pipetpunt) en laat de gel stollen. Spoel de erlenmeyer om met veel warm water. Fig. 16: het aanbrengen van de tape Fig. 17: het plaatsen van de kam in de gelhouder 31

33 Fig. 18: het gieten van de gel in de gelhouder Fig. 19: het verwijderen van de kam 6: Bij deze stap moeten ook handschoenen gebruikt worden. Verwijder het plakband/ de tape en haal vervolgens voorzichtig de kam uit de gel (zie figuur 13). Plaats de gelhouder in de electroforesebak. Denk daarbij aan de elecktroforeserichting! 7: Giet zoveel 1 x TAE buffer in de bak dat de gel net onder staat en er buffer in de slotjes zit. De gel is nu klaar voor gebruik (zie figuur 14). Test of er een stroom gaat lopen. Als dat zo is kunnen de DNA monsters in de slotjes worden gepipetteerd. Fig. 20: De gelhouder is in de electroforesebak geplaatst waarna de electroforesebuffer wordt toegevoegd. Bij ons bevinden de slotjes zich aan 1 kant van de gel i.p.v. in het midden zoals te zien is bij de afgebeelde gel 32

34 Protocol 10. Het klaarmaken van de DNA samples voor agarosegel electroforese 1: De hoeveelheid DNA die in de agarosegel gebracht moet worden hangt af van of het DNA in veel bandjes wordt geknipt of niet. Van geknipt Lambda DNA is daarom 1 µg DNA nodig, voor ongeknipt faag lambda DNA is 500 ng voldoende. Voor geknipt puc plasmide DNA = 0,5 µg (of meer) nodig, voor ongeknipt puc DNA 200 ng of meer. 2: Maak de monsters klaar voor de electroforese door het volume (van elk monster) op maximaal 20 µl te brengen met steriel milli Q water. Daarna moet er opbrengbuffer aan toegevoegd worden en moet het geheel goed gemengd worden. Dit mag op de vortex maar liever met een pipet mengen. De 5 x geconcentreerde opbrengbuffer moet in het epje uiteindelijk een 1x geconcentreerde oplossing worden. Dit is te bereiken door een bepaalde hoeveelheid van de 5 x geconcentreerde opbrengbuffer aan de DNA-oplossing toe te voegen, zodat de concentratie in het totaalvolume 1 x is geworden. Het eindvolume van het monster mag niet meer zijn dan 25 μl. Dit is nl. de inhoud van het slotje van de agarosegel (fig. 16 nr. 1, 2 en 3). 3: Behalve het geknipte DNA moeten er ook minimaal 2 verschillende controles worden meegenomen, zodat te zien is dat het DNA geknipt is en dat de lengte van het geïsoleerde plasmide berekend kan worden. Dit zijn markers. Wij gebruiken markerbespreek met de docent welke controles je mee wilt nemen.plaatje marker Fig. 21: het klaarmaken van het DNA-monster Fig. 22 het verloop van de electroforese in een agarosegel. 33

35 Protocol 11. Het opbrengen van de DNA monsters in een agarose gel. 1: Om de monsters in de slotjes van de agarosegel te kunnen pipetteren moet de gel in de electroforesebak liggen en moet de bak gevuld zijn met 1 x geconcentreerde electroforesebuffer (1 x TAE) waarbij er een dun laagje buffer over de gel ligt. Er zit dus ook buffer in de slotjes. 2: Maak een invulschema op het speciale agarose-electroforese-pipetteer-formulier. Zorg dat je ook in je labjournaal hebt genoteerd waar je welke monsters hebt gepipetteerd en waar de referentie DNA s zijn opgebracht. 3: Pipetteer de monsters voorzichtig in de slotjes.(fig. 17). Als je een beetje trilt zet dan je elleboog op tafel of probeer het zoals in figuur 18 is te zien. Voor alle monsters kan 1 pipetpunt worden gebruikt door na ieder monster de pipetpunt in het (+) buffercompartiment te spoelen. 4: Sluit de electroforesebak aan op de spanningsbron en stel deze in op V. Controleer of er stroom gaat lopen en of de monsters de goed kant op migreren. Fig. 23: het opbrengen van het DNA monster in een slotje van de agarosegel. Fig. Fig. 24; het opbrengen van het DNA monster in een slotjes van de agarosegel. 34

36 Protocol 12. Het beëindigen en bekijken van de agarosegel na de electroforese. 1: Wanneer je de electroforese beëindigt hangt af van de scheiding die je wilt bereiken. Bij het electroforeren van ongeknipt plasmide DNA is de scheiding minder belangrijk dan als je geknipt plasmide DNA gaat electroforeren. Voor ongeknipt DNA moet de donkerblauwe Broomfenolblauw band minimaal op de helft van de gel zijn gekomen. Bij de electroforese van geknipt plasmide DNA is het beter de blauwe band tot ¾ van de gel is gelopen. 2: Schakel de spanningsbron uit en haal de agarosegel voorzichtig uit de electroforesebak (draag hierbij handschoenen!) en seal de gel in plastic folie in. 3: Bekijk de gel vervolgens met UV (vraag aan de docent waar dat kan), maak daar een opname van en print die uit. 4: Wanneer je de gel het volgende practicum nogmaals wilt bekijken kan de gel bewaard worden in de koelkast. Er zal dan wel diffusie optreden, waardoor de bandjes minder scherp zullen worden. Indien de gel niet meer nodig is moet deze worden weggegooid in het afvalvat voor vast giftig afval (witte ton met rood deksel in of bij de linker zuurkast). 5: Giet de electroforesebak leeg in de gootsteen en spoel hem na met water. Zet de bak op zijn kop te drogen. Hierna kan je de handschoenen ook weggooien in de witte ton met rood deksel. Fig.25: het resultaat van een agarosegel electroforese. 35

37 Bijlage 1.Veiligheidseisen voor recombinant DNA werk Voor het werken met recombinant DNA technieken zijn in Nederland door de COGEM (Commissie Genetische Modificatie) eisen, richtlijnen en procedures opgesteld. De richtlijnen zijn erop gericht het werk voor de medewerkers zo veilig mogelijk te maken, de kans op ontsnappen van een gerecombineerd organisme zo klein mogelijk te laten zijn en in geval van het ontsnappen van een gemodificeerd organisme de kans op overleving in de buitenwereld zo goed als onmogelijk te maken. Derhalve zijn de richtlijnen in drie categoriën ingedeeld: Veilige Microbiologische Technieken (VMT), biologische veiligheidseisen en fysische veiligheidseisen. Een compleet overzicht van de VMT regels is hieronder weergegeven. Deze regels zijn ingesteld om het werken met GGO's (genetisch gemodificeerde organismen) voor de medewerkers zo veilig mogelijk te laten verlopen. Iedereen dient dan ook van deze regels op de hoogte te zijn en ze na te streven! Biologische veiligheidseisen zijn ingesteld om ervoor te zorgen dat een eventueel ontsnapt GGO niet levensvatbaar is. Daartoe mogen slechts bepaalde vectoren (plasmiden) worden gebruikt en deze mogen maar in een beperkt aantal gastheren (bacteriën) worden getransformeerd. In ons geval is dat het puc18 plasmide in JM109. Fysische veiligheidseisen zijn er om te voorkomen dat het GGO de werkruimte kan verlaten. Hoe gevaarlijker het experiment wordt geacht des te strenger zijn de biologische en de fysische veiligheidseisen. Als voorbeelden van deze laatste groep kan men denken aan het instellen van een sluis, het gebruik van speciale labjassen, het nemen van een douche voorafgaande en na het werk, het werken in "biosafety" kabinetten, het afzuigen van de lucht via HEPA filters etc. Na aanmelden bij de COGEM van het door een lab uit te voeren recombinant DNA experiment wordt het experiment ingeschaald in een bepaalde veiligheidscategorie en worden de daarbij behorende regels en eisen kenbaar gemaakt.voor het werken met zogenaamd "eigen" DNA, DNA dat van nature al in contact komt met een bepaalde gastheer, bv. faag λ DNA en E. coli, gelden de minst zware richtlijnen, het zogenaamde VMT nivo. Voor het werken met Agrobacterium tumefaciens in combinatie met E. coli DNA gelden de eisen van het C1 nivo. Voor C2 en C3 gelden nog strengere eisen. Er is slechts één C3 lab in Nederland! Het zal duidelijk zijn dat wij een experiment doen dat in de lichtste categorie is ingedeeld, nl. het VMT nivo. VMT regels Het werken met bacteriën is aan bepaalde regels gebonden, zeker als die bacteriën plasmiden bevatten die d.m.v. recombinant DNA technieken zijn verkregen. Deze bacteriën worden de genetisch gemodificeerde organismen genoemd, de GGO s. Vanwege de verwantschap van het te transformeren DNA en het organisme, in ons geval Escherichia coli, mogen deze recombinant DNA handelingen alleen op VMT-nivo worden uitgevoerd. VMT staat voor veilige microbiologische technieken. In dat kader gelden extra regels voor de werkruimte en worden bepaalde eisen gesteld aan de personen die daar werken. De regels zijn hieronder weergegeven. Er wordt geregeld door de ARBO inspectie op de uitvoering van deze regels gecontroleerd. 36

38 De regels: Om het geheel aan regels overzichtelijk te houden is er een onderscheid gemaakt tussen algemeen, microbiologische werkwijzen en het werken met cultures en voedingsbodems. Algemeen - Het dragen van een schone witte jas is verplicht. - Tijdens de werkzaamheden moet de deur gesloten zijn. - Voor en na het practicum worden de handen gewassen met zeep. De handen worden vervolgens afgedroogd met papieren handdoekjes. - De tafels worden gedesinfecteerd met 70% alcohol. Deze wordt in afgesloten flessen op tafel bewaard en bevat een blauwe kleurstof. - Buitenjassen worden op de kapstokken in de gang gehangen, tassen blijven in de sluis achter. Eventuele kostbaarheden mogen worden meegenomen naar de zaal. - Op zaal dienen de witte jassen steeds dicht te worden gedragen. - Het is verboden om op de zaal te eten of te drinken. - Lang haar moet worden opgebonden zodat geen brand- en infectiegevaar optreedt. - Op de tafels mogen geen overbodige spullen aanwezig zijn; labjournaal, boeken en schrijfmateriaal op de placemats plaatsen. - Labkrukken worden indien niet gebruikt onder de tafel geschoven. - Tijdens het werken met gevaarlijke stoffen is het verplicht handschoenen en een veiligheidsbril te dragen. - Als regel worden er géén studenten in de keuken toegelaten. - Indien men een verwonding heeft, ook een zeer kleine, dient de practicumleiding z.s.m. te worden geroepen, die na eventuele ontsmetting de wond verbindt. - Op de microbiologische labs geldt het volgende: op broedruimten, autoclaafruimte en koelkasten waarin bebroede platen en/of buizen worden bewaard zijn biohazard stickers aangebracht. Dit dient als waarschuwingsteken voor mogelijk gevaarlijk biologisch materiaal. Microbiologische werkwijzen - Er wordt niet gepraat tijdens steriel werken. - Tijdens de practica wordt een veiligheidsbril gedragen indien dit door de practicumleiding wordt gewenst, dus b.v. wanneer jij of je buurman/vrouw met gevaarlijke vloeistoffen werkt. - Tijdens de practica niet met de handen aan het gezicht komen. - Spatel, pincet e.d. desinfecteren m.b.v. 96% alcohol. Deze bevindt zich in een glazen potje of bekerglas. Gebruik nooit een plastic petrischaal! - Onbesmet glaswerk of materiaal dient in de groene bak te worden verzameld. - Besmet glaswerk (voorzover hergebruikt) dient in de rode bak te worden verzameld. - Kleine restjes agar worden met heet water meteen omgespoeld in de gootsteen; de wattenprop in de afvalbak deponeren. - Bij het microscoperen van levende preparaten voorzichtig werken, zodat niet plotseling dóór het preparaat wordt gedraaid en/of de microscoop wordt gecontamineerd. Na het microscoperen wordt het preparaat in een potje met Sumabac gedaan. - Gefixeerde preparaten kunnen in de glasbak worden gedeponeerd. - Op zaal is Sumabac aanwezig om zelf e.e.a. te desinfecteren en bij te vullen. - Bij morsen van levend materiaal: Docent waarschuwen, die aangeeft hoe gehandeld dient te worden. 37

39 - Gemorste voedingsbodem verwijderen met een watje met 70% alcohol. - Bij morsen op de huid deze desinfecteren. - Bij het onverhoopt binnen krijgen van micro-organismen: docent waarschuwen, die aangeeft hoe gehandeld dient te worden. - Gebruikte vuile pipetten worden in potten met Sumabac geplaatst. Pas aan het einde van het practicum worden de pipetten ontpropt en verzameld, waarna ze in spoelkokers geheel onder in de Sumabac worden gedompeld. - Ter afsluiting van het practicum worden de materialen verzameld om te bebroeden (kweken). De afvalpotjes worden geleegd, de tafels gedesinfecteerd. De platen in de broedruimten en de koelkasten worden gecontroleerd per groep of ze moeten worden afgevoerd in de daarvoor bestemde plastic zak in de metalen emmer. Hierna wordt in de sluis de labjas uitgedaan en worden de handen gewassen. Het werken met cultures en voedingsbodems - Platen en buizen met micro-organismen worden nooit onnodig geopend. - Er moet vermeden worden dat schimmel platen onnodig hard verplaatst worden: de geringste luchtwerveling kan al sporen verspreiden. - Het is verboden bebroede en onbebroede voedingsbodems van de zaal af mee te nemen. - Bij het maken van een schimmelpreparaat moet men tocht vermijden, de schaal voorzichtig openen en altijd een bevochtigde öse gebruiken. - Een gebruikte besmette entnaald of öse goed uitgloeien alvorens deze op te bergen. - Bij het afvoeren van bacterie- of schimmelplaten is het zaak deze zodanig in de plastic zak van de metalen emmer te plaatsen dat ze niet kunnen openvallen. - Gemorste suspensies van micro-organismen dienen onmiddellijk volgens aanwijzingen van de docent te worden gedesinfecteerd. Gebruik en afvoer van ETHIDIUMBROMIDE Aangezien ETHIDIUMBROMIDE mutageen is en ervan wordt verdacht carcinogeen te zijn moeten bij het werken met deze stof een aantal voorzorgen in acht worden genomen. 1. Studenten werken uitsluitend met ethidiumbromide in oplossing. 2. Verdunningen van ethidiumbromide worden in de zuurkast gemaakt en gebruikt. Verwerking van het gebruikte ethidiumbromide gebeurt in dezelfde zuurkast. 3. Voor het werken met ethidiumbromide is het dragen van een labjas, handschoenen en een bril verplicht. 4. Glaswerk, bakjes en flessen met ethidiumbromide moeten voorzien zijn van een duidelijke markering. 5. Gels met ethidiumbromide moeten minimaal vijf minuten in water worden nagespoeld. 6. Gels met ethidiumbromide worden in een plastic bakje of in plastic folie naar de donkere kamer gebracht. 7. De UV-lichtbak wordt met een stuk folie beschermd tegen verontreiniging met 38

40 ethidiumbromide. De folie moet regelmatig worden vervangen. 8. Na bekijken en fotograferen en eventueel verder gebruik van de gels gaan gel, handschoenen en folie in de afvalbak giftig afval. 9. Indien een gel moet worden nagekleurd met ethidiumbromide, dient dit te gebeuren in de zuurkast. De ethidiumbromide oplossing moet zich in een goed gecodeerd bakje bevinden en na gebruik over een kolom met kationenwisselaar worden gebracht. De kationenwisselaar haalt de kleurstof uit de oplossing. De kolom wordt door de amanuensis regelmatig gecontroleerd en indien nodig schoongespoeld. Deze stap concentreert de ethidiumbromide zodat minder afval als chemisch afval hoeft te worden afgevoerd. 39

41 Bijlage 2. Regels voor de verslaglegging bij practica. Voor het bijhouden van het labjournaal tijdens de practica wordt uitgegaan van het boekje Exact communiceren van R. van der Laan. Hieronder staat in het kort aangegeven welke hoofdstukken van het boekje je door moet lezen. Labjournaal. Lees hfst 2, p goed door. Enige aanvullingen op dit hoofdstuk zijn: 1)Het labjournaal is een schrift op A4-formaat waarin je goed leesbaar schrijft (ook voor een ander!!!) en dat tijdens het practicum wordt bijgehouden. Aan de buitenkant staat je naam, je studentnummer en de moduulcode van het practicum. Zet op de eerste blz. alle gegevens van de module (volledige titel, de auteur(s), de moduulcode en de datum van uitgave) dan kan je in de rest van het labjournaal daar naar verwijzen. 2) a: Schrijf met pen! b:fouten mogen doorgestreept worden, typex is echter uit den boze!!!! 3) Nummer de bladzijden. 4) Gebruik het labjournaal niet als kladpapier. 5) Wanneer er bij het experiment vragen beantwoord moeten worden en er op drachten gemaakt moeten worden dan zet je die ook in je labjournaal. Zorg dat duidelijk is bij welk experiment ze horen. Laat voldoende ruimte vrij voor tekeningen en aanvullende grafieken. 6) Per experiment vermeld je de datum en de titel van het experiment (en niet je eigen naam, want die staat al op de buitenkant van het labjournaal). 7) Geef in één regel het hoofddoel van het experiment. 8) Je geeft de gebruikte apparatuur aan (Biohit proline pipet 2 20 µl, Sigma laboratory centrifuge 3-15, Mettler P1200 N balans) de gebruikte biologische materialen. 9) Alle tabellen en figuren moeten worden genummerd. 10) Boven een tabel zet je, met één zin, wat de inhoud van de tabel is. Bij een figuur staat de titel eronder. 11) Zet tot slot onder de gegevens van een experiment een (voorlopige) conclusie. De informatie uit je labjournaal moet door een ander gelezen kunnen worden en kan gebruikt worden om gegevens over je uitgevoerde experimenten aan anderen door te geven. Dat kan mondeling, via een presentatie, of schriftelijk, via een meetrapport of verslag. 40

42 Bijlage 3. Het principe en veiligheid van de Qiagen methode. 41

43 42

44 43

45 44

46 Bijlage 4. Restrictiekaart van puc 18 De gebruikte PCR primers staan in protocol 8, pag 29 45

47 Bijlage 5. Nucleotide volgorde van puc

48 Bijlage 6. Gegevens van faag Lambda De volledige sequentie van lambda DNA is te vinden op de site: med.hro.nl/groff. Deze sequentie kan als text-file geplakt worden in NEB-cutter. 47