Practicum Biotechnologie 4/5VWO

Transcriptie

1 Practicum Biotechnologie 4/5VWO

2 Inhoudsopgave Pag. 3 Planning Pag. 4-5 Inleiding in de biotechnologie Pag. 6 Voorbeeld uit de Biotechnologie Pag. 7-8 Opzet Practicum (les 1) Pag. 9 Oefenen met Pipetteren (les 1) Pag DNA-Isolatie uit Tomaat (les 2) Pag Isolatie Resistentie-gen uit Tomaat (les 3) Pag Gel Elektroforese (les 4) Pag Miniprep (les 4) Pag Plasmid DNA knippen (les 4) Pag. 21 Planttransformatie (les 5) Pag. 22 Nabespreking (les 5) MSc. Maaike de Jong FNWI, afd. Celbiologie van de Plant Heyendaalseweg AJ Nijmegen T: Maaike.deJong@science.ru.nl 2

3 Planning Les Datum 1 Inleiding practicum + Oefenen met Pipetteren 2 DNA isolatie tomaat Carnavalsvakantie 3 College PCR reactie + inzetten PCR 4 Gel elektroforese + Miniprep + Plasmide DNA knippen 5 Bespreking resultaten + uitleg planttransformatie 3

4 Inleiding in de Biotechnologie De term biotechnologie bestaat uit twee delen: bios, het Griekse woord voor leven, en technologie, wat wijst op menselijke tussenkomst. Biotechnologie wordt gedefinieerd als de toepassing van levende organismen, zoals planten, dieren of micro-organismen voor het maken of verbeteren van producten, bijvoorbeeld in de voedingsmiddelenindustrie of voor de productie van medicijnen. De biotechnologie speelt een belangrijke rol in de landbouw. Al honderden jaren lang maken landbouwers nieuwe en verbeterde landbouwproducten door planten te veredelen met behulp van kruising en selectie, ook wel de klassieke biotechnologie genoemd. Onze voorouders hadden al snel begrepen dat een gewenste eigenschap, bijvoorbeeld een grote opbrengst, verbeterd kon worden door verder te kweken met planten die deze eigenschap vertoonden. Ze slaagden er ook in de eigenschappen van twee verschillende planten in één plant te verenigen door ze met elkaar te kruisen (Fig. 1). Onze voorouders wisten echter niet dat bij het proces van kruisen en selecteren op het erfelijk materiaal, het DNA, wordt ingegrepen. Al de eigenschappen van een plant liggen opgeslagen in het DNA. Het stukje DNA dat codeert voor een eigenschap, is een gen. Een plant bezit al snel zo n verschillende genen. Tijdens het kruisen worden grote stukken DNA en dus een heleboel kenmerken onderling uitgewisseld. Ongeveer de helft van het DNA van de ene plant wordt verenigd met de helft van het DNA van de andere plant. Zo ontstaan nakomelingen met een unieke mengeling van eigenschappen van de beide ouderplanten. Het is niet zo makkelijk om slechts één gewenst kenmerk over te dragen. Daarvoor is een intensief en jarenlang kruisingprogramma vereist. Een ander nadeel van veredeling, is dat het zich beperkt tot de kenmerken die de soort al bezit. Bovendien mogen de kenmerken niet samengaan met ongunstige eigenschappen, zoals een mindere kwaliteit. In de moderne biotechnologie kan men in één stap, heel gericht één kenmerk aan een plant toevoegen. Men doet dat door het gewenste gen af te zonderen, te isoleren en in het DNA van de plant in te bouwen (Fig. 1). Deze techniek is een stuk sneller dan de conventionele veredeling, en bovendien breng je op deze manier geen eigenschappen over die je liever niet wilt. Genen uit andere plantensoorten of zelfs andere organismen 4

5 zoals bacteriën of dieren kunnen net zo makkelijk in planten worden ingebouwd waardoor een enorm scala aan kenmerken ter beschikking komt. Het inbouwen van zo n kenmerk wordt genetische modificatie genoemd, omdat het genoom (het DNA) van een plant wordt gemodificeerd (= veranderd). Figuur 1- Schematische weergave van de traditionele veredeling en de moderne biotechnologie. In de klassieke biotechnologie, of traditionele veredeling, worden de eigenschappen van twee verschillende planten in één plant verenigd door ze met elkaar te kruisen. In de moderne biotechnologie wordt het gewenste kenmerk, een gen, vanuit de ene plant in het DNA van de andere plant ingebouwd (het gele bolletje is de gewenste eigenschap). Voor de genetische modificatie van planten wordt gebruik gemaakt van een natuurlijk systeem uit de bacterie Agrobacterium tumefaciens. Deze bacterie leeft in de grond en is van nature bezig met genetische wijziging. Agrobacterium injecteert een plantencel met genen die in het DNA van de plantencel worden ingebouwd. De plantencel wordt op deze manier verplicht de geschikte voedingsstoffen aan te maken voor de bacterie. Twee wetenschappers, Van Montagu en Schell, zijn erin geslaagd deze genen te vervangen door nieuwe genen. Als je de -gewijzigde- bacterie dan loslaat op de plant waaraan je de nieuwe genen of kenmerken wilt toekennen, worden deze nieuwe genen in het DNA van de plant ingebouwd en is de opdracht volbracht. De nieuwe genen komen meestal maar in een paar celletjes terecht. Maar men wil het kenmerk wel in alle cellen van de plant. Gelukkig zijn planten gemakkelijke wezens: één cel is voldoende om uit te groeien tot een nieuwe plant. Als je alleen de cellen met het nieuwe kenmerk gebruikt, krijg je een volledige transgene plant. 5

6 Voorbeeld uit de Biotechnologie Aardappel is een belangrijk voedingsgewas. Het is het vierde voedselgewas van de wereld na rijst, maïs en tarwe. Wereldwijd wordt ca. 30 miljoen hectare aardappel verbouwd, dat is ongeveer 10 maal het oppervlak van Nederland. Nederland heeft een sterke positie in de aardappelsector. Dat hebben we te danken aan de goede rassen die jaarlijks ontwikkeld Figuur 2- Blad van de worden en door uitstekende marketingstrategie en aardappelplant geïnfecteerd met kwaliteitscontrole. De eerste prioriteit van de Phytophthora. veredelaars is nog steeds gericht op veredeling tegen ziekten en plagen. De belangrijkste resistentie waarnaar gezocht wordt is die tegen de aardappelziekte Phytophthora (Fig. 2). Dit was de ziekte die rond het midden van de 19 e eeuw zorgde voor de hongersnood in Ierland waardoor zeer veel Ieren het land ontvluchten (Fig. 3). Tegenwoordig wordt gebruik gemaakt van bestrijdingsmiddelen om de ziekte te bestrijden. Per seizoen wordt wel 15 tot 20 maal gespoten tegen Phytophthora. Dat is niet alleen een zware economische aanslag, maar ook een aanslag op het milieu. Mogelijk kan de biotechnologie een oplossing bieden. Figuur 3- Inwoners uit Galway, Ierland, vallen de aardappel winkel van de overheid aan. London News, juni Er zijn aardappelrassen die uit zichzelf resistent zijn tegen de aardappelziekte Phytophthora, maar helaas zijn deze varianten niet lekker om te koken en niet geschikt voor het bakken van friet. Met behulp van de biotechnologie is het mogelijk genen uit deze rassen te isoleren die resistentie kunnen geven tegen Phytophthora, en te introduceren in aardappelrassen die wel lekker smaken. Na deze genetische modificatie zijn de lekkere aardappelrassen ook resistent tegen de ziekte en hoeven geen bestrijdingsmiddelen te worden gebruikt. 6

7 Opzet practicum (1) Het doel van het practicum is om jullie kennis te laten maken met de basistechnieken uit de biotechnologie, bestaande uit: het isoleren van DNA, het isoleren van een gen, het knippen van DNA, en het visualiseren van DNA m.b.v. gel electroforese. Het practicum is gebaseerd op het voorbeeld van pagina 6 waarin een resistentie-gen tegen de aardappelziekte Phytophthora wordt geïsoleerd en geïntroduceerd in een aardappelras met een lekkere smaak. In dit practicum gaan we een resistentie-gen isoleren uit tomaat, een familielid van de aardappel en doorlopen we de verschillende stappen om dit gen te kunnen introduceren in aardappel. Helaas mogen we het gen niet werkelijk in de aardappel introduceren vanwege de strenge regelgeving voor genetische modificatie. Het stappenplan om dit resistentie-gen van tomaat in aardappel te introduceren ziet er als volgt uit: DNA isoleren uit tomaat Resistentie-gen isoleren uit het DNA van tomaat m.b.v. PCR Controleren of het juiste gen is geïsoleerd m.b.v. gel elektroforese *Geïsoleerde resistentie-gen in plasmide DNA plakken *Plasmide DNA in agrobacterie zetten Plasmide in agrobacterie controleren m.b.v. miniprep en knippen *Bladweefsel van de aardappel met de bacterie infecteren *Opkweken transgene aardappelplant vanuit bladweefsel * Deze stappen kunnen we niet met dit practicum uitvoeren i.v.m. de regelgeving genetische modificatie. 7

8 Opdrachten les 1 1- Bedenk een paar andere voorbeelden van kenmerken die handig zijn om te introduceren in landbouwgewassen (evt. Internet). 2- Een andere vorm van biotechnologie is het weghalen van een kenmerk. Bedenk ook voorbeelden van dit soort kenmerken. 8

9 Oefenen met Pipetteren (1) Biotechnologen werken met veel verschillende vloeistoffen, zoals oplossingen van zouten, buffers en enzymen. Maar de hoeveelheden zijn meestal ontzettend klein. De volumes worden dan ook aangegeven in milliliters (ml; 1/1000 liter) of microliters (μl; 1/ liter). Met behulp van een pipet kunnen deze volumes nauwkeurig worden afgemeten. De pipet werkt als volgt: Kies de pipet die bij het te pipetteren volume past Draai de pipet op het juiste volume Zet een plastic pipetpunt op de pipet (houd deze pipetpunten alleen aan het brede deel vast, zodat reacties niet besmet worden!) Druk de pipet met de duim in tot de eerste weerstand Zet de punt in de vloeistof en laat de duim rustig omhoog komen, zodat de vloeistof wordt opgezogen (niet te snel!) Pipeteer de vloeistof in een reageerbuisje door de pipet weer in te drukken tot de tweede weerstand Opdracht Pipetteren Pipetteer de volgende volumes water samen in één reageerbuisje, gebruik iedere keer dezelfde pipetpunt: o 1,00 ml o 0,45 ml o 450 μl o 3x 100 μl o 2x 40 μl o 2x 10 μl 1. Wat is het totaal volume water in het reageerbuisje? (geef het antwoord in ml en in μl) 2. Wat zou het gewicht van het water in het reageerbuisje moeten zijn? 3. Weeg nu je reageerbuisje en controleer of je juist hebt gepipetteerd. 9

10 DNA-Isolatie uit Tomaat (2) Iedere cel van een plant bevat DNA. In tomaat heeft het DNA een lengte van 23 cm verdeeld over 12 chromosomen. In de chromosomen ligt het DNA molecuul opgerold rondom eiwitten, histonen genaamd. Het DNA-molecuul heeft de vorm van een wenteltrap; een dubbele helix van twee om elkaar gewonden ketens. De basen of nucleotiden vormen de traptreden van deze wenteltrap. Elk nucleotide bestaat uit een fosfaatgroep, een suikermolecuul en een stikstofbase. In het DNA komen vier verschillende stikstofbasen voor: adenine (A), cytosine (C), guanine (G) en thymine (T). De twee Figuur 4- Opbouw van DNA. ketens zijn met elkaar verbonden door basenparen. Tegenover de T in de ene keten zit altijd een A in de andere keten; evenzo vormen C en G een basenpaar (Fig. 4). 10

11 Protocol DNA-Isolatie (K. Edwards et al., 1991, Nucleid Acids Research) 1- Pak een klein stukje blad door deze uit te ponsen. Dit doe je door een stukje blad tussen het epje en de dop te houden en de dop dicht te drukken. 2- Vermaal het stukje blad tot prut met behulp van een pesteltje. 3- Voeg met de pipet 0,4 ml extractiebuffer toe. Deze buffer zorgt ervoor dat de celwanden kapot gaan het dat het DNA vrijkomt. Het DNA lost vervolgens op in de extractiebuffer seconden goed schudden. 5- Centrifugeer 1 minuut bij rpm. Door het centrifugeren komen de celresten op de bodem te liggen. Het DNA blijft opgelost in de extractiebuffer en zit dus in de bovenste laag. 6- Zuig met een pipet 0,3 ml van de extractiebuffer (bovenste laag) voorzichtig op en pipetteer de vloeistof in een nieuw epje. Let op dat je de celresten op de bodem laat liggen. 7- Voeg met de pipet 0,3 ml isopropanol toe en meng door het epje een paar keer om te keren (niet schudden!). DNA lost niet op in isopropanol en zal dus gaan neerslaan). 8- Laat het epje 2 minuten staan. 9- Centrifugeer 5 minuten bij rpm. Het neergeslagen DNA komt nu op de bodem te liggen. 10- Zuig met de pipet de vloeisof af. Let erop dat het neergeslagen DNA op de bodem van het epje blijft liggen. 11- Centrifugeer 1 minuut bij rpm en zuig het laatste restje vloeistof af. 12- Laat het epje 10 minuten staan met de deksel open zodat de laatste resten isopropanol verdampen. 13- Los het DNA op in 0,2 ml water en pipetteer een paar keer op en neer. 14- Merk het epje en bewaar het in de koelkast bij 4 C. Opdrachten les 2 1- De extractiebuffer bestaat bevat o.a. zeep, welke celonderdelen gaan kapot door de zeep? 2- De extractiebuffer bevat ook veel zouten, deze veranderen de structuur van eiwitten. Wat doet zout met de chromosomen? 11

12 Isolatie Resistentie-gen Tomaat (3) Om het resistentie-gen te isoleren, wordt gebruik gemaakt van een polymerasekettingreactie, afgekort PCR. De PCR is een methode om zeer kleine hoeveelheden DNA te vermenigvuldigen (amplificeren) tot er genoeg van is om het zichtbaar te kunnen maken op een gel. De PCR-reactie bestaat uit de volgende componenten: het geïsoleerde DNA, Taq DNA polymerase, losse basen (A, T, G of C) en primers Figuur 5- Taq DNA polymerase plakt de basen aan elkaar zodat ze op de bestaande streng DNA passen. De PCR maakt gebruik van het enzym Taq DNA polymerase, die losse basen aan elkaar plakt. De twee strengen van het geïsoleerde DNA worden uit elkaar gehaald door de temperatuur te verhogen, waardoor twee enkele strengen DNA overblijven. De Taq gebruikt deze enkele strengen als matrijs, of mal, voor het maken van een nieuwe streng DNA. De Taq beweegt over de enkele DNA streng en leest deze af. Bij iedere T die de Taq tegenkomt, plakt deze een A vast, en bij ieder C een G, enzovoorts. Zo ontstaat opnieuw een dubbele streng DNA (fig. 5). Om het DNA dubbelstrengs te maken, heeft de Taq al een klein stukje dubbelstrengs DNA nodig als startpositie. Daarvoor dienen de primers. Dit zijn kleine stukjes DNA, die zo gemaakt zijn dat zij overeenkomen met de basen-volgorde van het resistentie-gen. Omdat zij alleen op het resistentie-gen passen, is dat gen het enige stuk DNA dat uit het gehele genoom van de plant wordt vermeerderd. 12

13 De PCR reactie bestaat uit drie fasen (fig. 6): - Denaturatie: door de temperatuur tot 94 C te verhogen splitsen de twee DNA ketens uit elkaar. - Hybridisatie: bij een lagere temperatuur, 55 C, binden de primers op het geïsoleerde DNA, maar alleen op de basen van het resistentie-gen. - Extensie: de temperatuur wordt verhoogd tot 72 C. Bij deze temperatuur begint de Taq vanuit de primers, een kopie te maken van het resistentie-gen uit het geïsoleerde DNA. De Taq plakt de losse nucleotiden (dntps) aan elkaar en gebruikt daarbij dus één van de ketens als voorbeeld om te zien in welke volgorde de basen aan elkaar geplakt moeten worden. Figuur 6- Polymerase kettingreactie De kopieën kunnen op hun beurt ook weer worden gekopieerd, dus na iedere stap is er dus twee maal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door deze stappen een aantal malen te herhalen, bijvoorbeeld 35 of 40 keer (cycli), krijgt men een enorme hoeveelheid DNA. 13

14 Protocol PCR 1- Pipetteer 5 μl DNA-oplossing in een PCR-buisje. 2- Maak een mix voor de PCR-reactie klaar in een epje: 10x PCR buffer 2,5 μl 25 mm MgCl 2 2,5 μl 10mM dntps 1 μl Forward primer 1 μl Reverse primer 1 μl Taq polymerase 1 μl Water 16 μl Totaal 25 μl 3- Pipetteer de mix bij de 5 μl DNA-oplossing en pipetteer een paar keer op en neer om te mengen. 4- Verzamel alle PCR-buisjes op ijs zodat alle buisjes tegelijk in het PCRapparaat kunnen. 5- PCR-programma: 94 C 2 min. 94 C 30 sec. 55 C 30 sec. 40x 72 C 30 sec. 72 C 2 min. 15 C Opdrachten les 3 1- De vermeerdering van het DNA volgt een wiskundig verband, welk verband is dat? 2- Hoeveel strengen DNA hebben we van het resistentie-gen na een PCR reactie van 40 cycli? 14

15 Gel elektroforese (4) Gel elektroforese is een scheidingstechniek die moleculen onder invloed van een elektrisch veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen moleculen bewegen naar beneden waar de positieve pool zich bevindt. Hoe groter de moleculen, hoe trager ze kunnen bewegen; hoe kleiner de moleculen, hoe sneller ze zullen bewegen. DNA moleculen hebben een negatieve lading. Gel elektroforese kan dus ook worden gebruikt voor het analyseren van DNA. Naast de PCR-reactie, wordt ook een mengsel van verschillende DNA fragmenten op de gel gebracht, een ladder. De lengte van deze fragmenten is bekend, zodat we de lengte van het PCR-product kunnen bepalen. Protocol gel elektroforese (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning) 1- Maak een gel door in een bekerglas 1 gram agarose op te lossen in 100 ml TAE Buffer. 2- Verwarm het bekerglas boven een brander om de agarose op te lossen (voorzichtig, wordt erg heet!). 3- Tape de gel-tray af met plakband en plaats de kam op de tray. 4- Giet de agarose-oplossing in de tray en laat de gel 15 min. afkoelen. 5- Verwijder plakband van de tray en plaats de gel (met tray) in de elektroforesebak. 6- Vul de elektroforesebak met TAE buffer 7- Meng 8 μl PCR-product met 2 μl Loading buffer. Deze buffer verzwaart het DNA, daardoor is het PCR-product makkelijker in de gel te pipetteren. 8- Pipetteer de 10 μl in de gel. Zet er 6 μl DNA-ladder naast. 9- Zet de deksel op de electroforesebak, en breng de spanning op 100V. 10- Laat de gel 20 min lopen. 11- Laat de gel overnacht incuberen in water met 0,02% methyleenblauw (20 μl in 100 ml water). 12- Maak een foto van de gel. 15

16 Opdrachten les 4 1- Hoe groot is het PCR fragment dat je verwacht (gebruik het word document met daarin de sequentie-informatie van het resistentie-gen en de bijbehorende primers)? 2- Klopt de grootte van het PCR-product met de verwachtte fragmentgrootte? 16

17 Miniprep (4) Voor de genetische modificatie van planten wordt gebruik gemaakt van een natuurlijk systeem uit de bacterie Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium injecteert een plantencel met genen, die vervolgens in het DNA van de plantencel worden ingebouwd. Het DNA van een bacterie is anders georganiseerd dan het DNA van mensen, dieren en planten. In plaats van chromosomen hebben bacteriën één groot ringvormig DNAmolecuul. Dit molecuul draagt alle informatie die voor de levensprocessen van de bacterie van belang zijn, bijvoorbeeld de genen voor productie van verteringsenzymen. Daarnaast bevat een bacterie plasmiden, deze dragen de genen voor niet-essentiële eiwitten. Het DNA wat Figuur 6- Organisatie van Agrobacterium in planten inbouwt is afkomstig van zo n DNA in een bacterie plasmide (Fig. 6). Om de Agrobacterium te gebruiken voor de genetische modificatie van aardappel, moeten we eerst een plasmide met het tomaten resistentie-gen maken en dat kan met behulp van enzymen die het PCR-product in het plasmide plakken. Het resulterende plasmide wordt vervolgens in de agrobacterie gestopt en vermeerderd. Helaas mogen we deze stappen niet tijdens het practicum uitvoeren vanwege de strenge regels voor genetische modificatie, want in deze stappen wordt het genoom van de bacterie veranderd (gemodificeerd). Voordat het blad van de aardappel wordt geïnfecteerd met deze nieuwe agrobacterie, moet worden gecontroleerd of het PCR-product wel echt in het plasmide zit. Maar daarvoor moet het plasmide eerst opnieuw uit de agrobacterie worden geïsoleerd, dat gaat met behulp van een miniprep. 17

18 Protocol Miniprep ( 1- Giet 1,5 ml Bacteriecultuur in een epje 2- Centrifugeer 2 min op rpm. 3- Giet de vloeistof af, de bacteriën vormen nu een pellet onderin het epje 4- Voeg 100 μl TEG toe aan de bacteriën en schud totdat alle bacteriën weer zijn opgelost. 5- Voeg 200 μl 0,2 M NaOH en 1% SDS toe. Meng, door het epje een paar keer om te draaien (niet schudden!!). 6- Wacht totdat de oplossing helder wordt. Maximaal 5 min. 7- Voeg 150 μl 5 M KAc toe. Meng, door het epje een paar keer om te draaien (niet schudden). 8- Centrifugeer 10 min bij rpm. 9- Zuig met een pipet 0,4 ml supernatant (bovenste laag) voorzichtig op en pipetteer de vloeistof in een nieuw epje. Let op dat je de celresten op de bodem laat liggen. 10- Voeg 0,8 ml 96% Ethanol toe en meng door een paar keer op en neer te pipetteren. 11- Centrifugeer 10 min bij rpm. 12- Zuig met de pipet de vloeisof af. Let erop dat het neergeslagen DNA op de bodem van het epje blijft liggen. 13- Centrifugeer 1 minuut bij rpm en zuig het laatste restje vloeistof af. 14- Laat het epje 5 minuten staan met de deksel open zodat de laatste resten ethanol verdampen. 15- Los het plasmide DNA op in 50 μl water. Opdrachten les 4 1- Waarvoor dienen de NaOH (zout, basisch) en SDS (zeep) bij stap 5? 2- Waarom moet na max. 5 min KAc (zuur) worden toegevoegd? 18

19 Plasmide DNA knippen (4) Figuur 7- Voorbeelden van restrictieenzymen. Na de plasmide-isolatie kan op twee manieren worden gecontroleerd of het plasmide het resistentie-gen bevat: door middel van PCR of met behulp van restrictieenzymen. Restrictie-enzymen knippen de dubbele DNA-streng op een specifieke plaats, bij een bepaalde volgorde van nucleotiden (sequentie). Ieder restrictie-enzym knipt dus heel specifiek op een andere sequentie en dus op een andere plek in het DNA (Fig. 7). Opmerkelijk is dat deze sequenties altijd een palindroom structuur hebben. Protocol Plasmid DNA knippen 1- Pipetteer in een epje: 17,25 µl Water 5 µl Plasmid DNA 2,5 µl Restrictie buffer Tango 0,25 µl Restrictie enzym AscI 0,25 μl Restrictie enzym NotI 2- Pipeteer een paar keer op en neer om te mengen 3- Zet het epje voor 1-1,5 uur bij 37 C. 4- Tijdens de volgende les: voeg 5 μl loadingbuffer toe aan de reactie en zet 10 μl van de reactie op gel (zie pag. 13). Opdrachten les 4 1- Op de volgende pagina staat een schematische tekening van het plasmide met daarin aangegeven: de grootte van het plasmide met resistentie-gen en de knipplaatsen van verschillende restrictie-enzymen. Wat is de grootte van de fragmenten na het knippen? 2- Wat zou de fragmentgrootte worden als het PCR fragment niet in het plasmide zit? 19

20 Resistentie-gen NotI 698 bp AscI 1190 bp DraII 565 bp HincII 502 bp 3072 bp AcsI 1505 bp AcsI 1689 bp PvuI 1892 bp SapI 112 bp BsmFI 2343 bp 20

21 Planttransformatie (5) Om het resistentie-gen van tomaat uiteindelijk in aardappel te introduceren, worden kleine stukjes blad van een aardappelplant geïnfecteerd met de nieuwe agrobacterie. Deze bacterie zet het resistentie-gen vanuit zijn plasmide over in het genoom van de aardappelplant. Maar meestal komen de nieuwe genen in een paar cellen van het bladweefsel terecht en uiteindelijk wil men het kenmerk in alle cellen van de plant. Bij planten is het mogelijk om één cel uit te laten groeien tot een nieuwe plant. Cellen in bladweefsel zijn gespecialiseerde cellen, maar onder invloed van hormonen kunnen deze weer veranderen in cellen zonder specifieke functie. Deze cellen gaan zich dan vermeerderen (vormen callus; Fig. 8) en kunnen vervolgens uit groeien tot volledige plant met bladeren en wortels. Als je alleen de cellen met het nieuwe kenmerk gebruikt, bijvoorbeeld de resistentie tegen Phytophthora, krijg je dus een volledige transgene aardappelplant. Helaas mogen we deze stappen niet tijdens het practicum uitvoeren, de regels voor het werken met genetisch gemodificeerde organismen zijn zeer streng. Figuur 8- Planttransformatie A- Bladweefsel verliest onder invloed van hormonen zijn specifieke functie en gaat callus vormen (pijltje). B-D Vanuit het callus groeien stengels. E- En door de steeltjes over te brengen naar een oplossing met een andere hormoonsamenstelling, gaan de steeltjes wortels vormen. Opdrachten les 5 1- Kunnen dierlijke cellen met een specifieke functie weer van functie veranderen? 2- Greenpeace en andere milieuorganisaties zijn tegen het veranderen van planten door middel van deze moderne technieken. Wat is volgens hen het grootste gevaar? 21

22 Nabespreking (5) Bekijken gel: PCR + plasmide DNA knippen Nabespreking van de opdrachten en practica 22