VALIDATIERAPPORT Analysemethode Techniek Voeding - Kwantitatieve bepaling van calcium, kalium, magnesium, natrium en fosfor met ICP-OES (FLVVG-I-MET-207E : met E = element) Microgolfontsluiting/digiPREP ontsluiting - ICP-OES Matrix / matrixgroep Levensmiddelen Type validatie Totaal Verantwoordelijke (Naam en functie) ir. Inge Van Hauteghem, sectieverantwoordelijke AC Opgesteld door ir. Inge Van Hauteghem Functie: sectieverantwoordelijke AC Datum: document opgesteld: 2/08/2012, aangepast 12/12/2012 voor Matrix / matrixgroep, update 15/09/2017 Handtekeningen : Get. Medewerkers (Naam en functie) Ing. Vanessa Schotte (ingenieur AC), Inge Corryn (laborante AC), Annemie Boone (laborante AC), Rik Baes (laborant AC), Francine De Geyter (laborante AC). Periode van validatie Start: Januari 2012 Einde: Juli 2012, bemerking: validatiedossier wordt continue aangevuld met nieuwe gegevens rond juistheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid, herhaalbaarheid => aanvulling 15/09/2017 met data tot 15/09/2017 Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door ir. Inge Van Hauteghem Functie: sectieverantwoordelijke AC Datum: 2-8-2012 Handtekeningen : Get. valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 1/24
INHOUDSTABEL TOELICHTING... 3 SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS... 4 1. HERHAALBAARHEID... 5 2. INTRALABORATORIUMREPRODUCEERBAARHEID... 11 3. LINEARITEIT... 14 4. AANTOONBAARHEIDSGRENS EN BEPAALBAARHEIDSGRENS... 14 5. JUISTHEID, SELECTIVITEIT EN SPECIFICITEIT... 16 6. ROBUUSTHEID STABILITEIT... 21 7. TRENDANALYSE... 22 valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 2/24
Toelichting - De methode is een in-house methode gevalideerd voor geschiktheid in 2012. Op dat moment was er nog geen genormaliseerde methode voor ICP-OES, wel voor AAS vlam. Eind 2016 werd een ICP-OES methode ontwikkeld op Europees niveau : FprEN 16943, "Foodstuffs - Determination of calcium, copper, iron, magnesium, manganese, phosphorus, potassium, sodium, sulfur and zinc by ICP- OES". De FLVVG-methode blijkt voldoende overeenkomst te hebben met de EN-methode om te kunnen vallen onder de noemer van afgeleide methode van de nieuwe EN methode. - Voor intralaboratoriumreproduceerbaarheid moet in geval van een genormaliseerde methode de RSDRw < RSDR,EN van de EN-methode. Voor herhaalbaarheid kan de RSDr vergeleken worden met de RSDr,EN. Deze richtlijnen worden gebruikt als indicatie van de performantie van de inhouse/afgeleide methode. - De methode moet geschikt zijn om de conformiteit te toetsen t.o.v. de normen uit het KB van 18 februari 1991 betreffende voedingsmiddelen bestemd voor bijzondere voeding (Stbl. 30.VIII.1991). Deze normen zijn uitgedrukt per 100 kj / kcal. Omgerekend naar typische producten komen deze normen overeen met: Opvolg- Min-max (g/kg) Babyvoeding Babyvoeding op basis van granen zuigelingen- voeding (poeder) Opvolg- zuigelingen- voeding (melk) Volledige zuigelingenvoeding Calcium 0-0,48 0-3,36 2,40-6,71 0,33-0,92 2,30-6,44 Kalium 0-0,96 0-6,72 2,88-7,67 0,39-1,05 2,76 7,36 Magnesium 0-0,24 0-1,68 0,24-0,72 0,03-0,10 0,23 0,69 Natrium 0-1,20 0-8,40 0,96-2,88 0,13-0,39 0,92 2,76 Fosfor / / 1,20 4,31 0,16-0,59 1,15 4,14 M.a.w. de laagste maximum norm is voor Calcium: 0,48 g/kg of 480 mg/kg, voor Kalium: 0,96 g/kg of 960 mg/kg, voor Magnesium: 0,10 g/kg of 100 mg/kg, voor Natrium: 0,39 g/kg of 390 mg/kg, voor Fosfor: 0,59 g/kg of 590 mg/kg. De laagste minimum norm geldt voor Magnesium in melk: 0,030 g/kg of 30 mg/kg. Toegepast voor de aantoonbaarheidsgrens en de bepaalbaarheidsgrens: de LOQ moet minder dan één vijfde van de maximum norm (analoog aan Verordening 1881/2006) bedragen en tegelijk ook lager dan de minimum norm. - Validatierapport versie 3 is een update van de versie van 2-8-2012 met aanvullingen voor de performantiecriteria en een herberekening van de meetonzekerheid volgens de recentste template. valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 3/24
Samenvatting validatiegegevens Validatieparameter Aanvaardingscriteria Evaluatie / samenvatting herhaalbaarheid Horratr, informatief RSDr < RSDr,EN beheerst reproduceerbaarheid HorratR, informatief RSDRw < RSDR,EN beheerst (Ca: 2 x >, wel < Rrel) lineariteit afwijking t.o.v. lineair model max 10 % werkgebied: LOQ 100 % LOD-LOQ robuustheid afwijking t.o.v. nominale concentratie max 5 %; LOQ < 1/5 max norm en LOQ < min norm indirect, controlekaarten geen effect type destructie LOQ voor: K, Na, P : 200 µg/l (max) 36 mg/kg Ca: 100 µg/l (max) 18 mg/kg Mg: 125 µg/l (max) 23 mg/kg LOQ is voldoende laag beheerst juistheid 70 120 % voor alle elementen in de scoop zowel negatieve als positieve bias met juistheid variërend tussen 70 % en 120 % ; beheerst Samenvatting meetonzekerheid Model: MU_cal_v.05 (2014/871/LAB) Meetonzekerheid U (%) Berekeningswijze Besluit Element Ringtest Validatie Controle kaarten U % Calcium ja ja ja 16,7 => 17 Fosfor ja ja ja 16,5 => 17 Kalium ja ja ja 12,9 => 17 Magnesium ja ja ja 15,1 => 17 Natrium ja ja ja 13,1 => 17 O.w.v. praktische redenen wordt de U afgerond naar 17 % voor alle mineralen en P. ARCHIEF Model: HB juli 2012 Berekeningswijze U (%) Ca P K Mg Na Controlekaarten 15,86 14,25 14,78 13,69 10,55 Ringtesten 11,12 15,85 / / / Validatie 15,11 16,32 16,37 13,60 12,14 Meetonzekerheid U % 15 15 15 15 15 valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 4/24
1. Herhaalbaarheid Diverse matrices werden in herhaalbaarheid getest voor de verschillende elementen. Als criterium werd Horratr < 1,5 bekeken. Daarnaast werd de RSDr vergeleken met de RSDr,EN in de EN 16943 (versie eind december 2016) (ICP-OES) voor zover een gelijkaardige matrix en/of gehalte in de EN 16943 (ICP-OES) methode gevalideerd was (geen echt goede overeenkomst gevonden voor mayonaise en vinaigrette, de vergelijking voor deze matrices is louter indicatief). Ter informatie werd ook een vergelijking gemaakt met de RSDr van de EN methode 15505 (AAS vlam). Aan het criterium Horratr-waarde < 1,5, werd voor de 5 elementen in alle matrices voldaan. De RSDr was in sommige gevallen groter dan de RSDr van een matrix gevalideerd volgens de EN 16943. Calcium De matrices NIST 1568a Rice flour, BCR-063R Skim milk powder, zuigelingenmelk (vloeibaar, vertrekkende vanaf het poeder), Wheat flour ERM-BC382, een samengestelde voedingsmatrix PT45-K102-10, mayonaise en vinaigrette en een aantal fapas stalen type Canned meat en Breakfast Cereal, werden getest in herhaalbaarheidscondities: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 5/24
Fosfor De matrices NIST 1568a Rice flour, BCR-063R Skim milk powder, zuigelingenmelk (vloeibaar, vertrekkende vanaf het poeder), Wheat flour ERM-BC382, een samengestelde voedingsmatrix PT45-K102-10, mayonaise en vinaigrette en een aantal fapas stalen type Canned meat en Breakfast Cereal, werden getest in herhaalbaarheidscondities: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 6/24
Kalium De matrices NIST 1568a Rice flour, BCR-063R Skim milk powder, zuigelingenmelk (vloeibaar, vertrekkende vanaf het poeder), Wheat flour ERM-BC382, een samengestelde voedingsmatrix PT45-K102-10, mayonaise en vinaigrette en een aantal fapas stalen type Canned meat, Energy drink en Breakfast Cereal, werden valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 7/24
getest in herhaalbaarheidscondities: Magnesium De matrices NIST 1568a Rice flour, BCR-063R Skim milk powder, zuigelingenmelk (vloeibaar, vertrekkende vanaf het poeder) en Wheat flour ERM-BC382, een samengestelde voedingsmatrix PT45-K102-10, mayonaise en vinaigrette en een aantal fapas stalen type Canned meat, Energy drink en Breakfast Cereal, werden getest in herhaalbaarheidscondities: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 8/24
Natrium De matrices NIST 1568a Rice flour en BCR-063R Skim milk powder, zuigelingenmelk (vloeibaar, vertrekkende vanaf het poeder), een samengestelde voedingsmatrix PT45-K102-10 en een aantal fapas stalen type Canned meat, Energy drink en Breakfast Cereal, en mayonaise en vinaigrette, werden getest in herhaalbaarheidscondities: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 9/24
Besluit : de methode is qua herhaalbaarheid voldoende beheerst voor calcium, fosfor, kalium, magnesium en natrium. valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 10/24
2. Intralaboratoriumreproduceerbaarheid De intralabreproduceerbaarheid werd bepaald aan de hand van controlekaarten van CRM en ringteststalen. De performantie werd geëvalueerd aan de hand van de HorratRw waarde (< 2) en er werd een vergelijking gemaakt tussen de RSDRw en de RSDR,EN voor zover gelijkaardige matrix en/of concentratie kon worden gevonden uit de genormaliseerde methode met ICP-OES. Louter ter info werden de gegevens van de genormaliseerde methode met vlam AAS ook nog vermeld. Aan het criterium HorratRw-waarde kleiner dan 2, werd voor de 5 elementen in alle gevallen voldaan. Calcium De matrices NIST 1568a Rice flour, NIST 8436 Durum Wheat flour, PT45-K102-10 samengestelde voeding, BCR-063R Skim milk powder, Wheat flour ERM-BC382, BCR-679 White cabbage en NIST SRM 1570a Spinach leaves werden getest in intralaboratoriumreproduceerbaarheidscondities: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 11/24
Voor Canned meat was de RSDRw hoger dan deze van Chicken meat. Wheat flour en Rice flour bleken een hogere RSDRw dan de wheat flour getest in de EN methode. Voor deze gevallen werd de RSDRw aanvullend vergeleken met Rrel, de relatieve maximum limiet voor Reproduceerbaarheid bekomen in de EN methode en daaraan werd wel voldaan. => De bekomen RSDRw waarden voldoen. Fosfor De matrices NIST 1568a Rice flour, NIST 8436 Durum Wheat flour, PT45-K102-10 samengestelde voeding, BCR-063R Skim milk powder, Wheat flour ERM-BC382, BCR-679 White cabbage en NIST SRM 1570a Spinach leaves werden getest in intralaboratoriumreproduceerbaarheidscondities: => De bekomen RSDRw waarden voldoen Kalium De matrices NIST 1568a Rice flour, NIST 8436 Durum Wheat flour, PT45-K102-10 samengestelde voeding, BCR-063R Skim milk powder, Wheat flour ERM-BC382 en NIST SRM 1570a Spinach leaves werden getest in intralaboratoriumreproduceerbaarheidscondities: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 12/24
=> De bekomen RSDRw waarden voldoen Magnesium De matrices NIST 1568a Rice flour, NIST 8436 Durum Wheat flour, BCR-063R Skim milk powder, Wheat flour ERM-BC382, BCR-679 White cabbage en een fapas staal type Infant formula, werden getest in intralaboratoriumreproduceerbaarheidscondities: => De bekomen RSDRw waarden voldoen valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 13/24
Natrium De matrices BCR-063R Skim milk powder, NIST SRM 1570a Spinach leaves en een fapas staal type Infant formula werden getest in intralaboratoriumreproduceerbaarheidscondities. => De bekomen RSDRw waarden voldoen Besluit naar intralaboratoriumreproduceerbaarheid en robuustheid (indirect): de methode is beheerst voor calcium, fosfor, kalium, magnesium en natrium. 3. Lineariteit Ruwe data en samenvatting resultaten: zie validatiedossier. Uit de residu analyse volgt dat de methode lineair is in het werkgebied gaande van de LOQ tot aan 10.000 µg/l en dit voor alle 5 de elementen. De correlatiecoëfficiënten zijn hoger dan 0,999 en bepaalde zijn gelijk aan 1, wat gunstig is. Voor LOQ: zie 4. 4. Aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens Ruwe data: verdunningen van de standaarden en test op melk, zie validatiedossier + 1 en 2. De matrices NIST 1568a Rice flour en NIST 8436 Durum Wheat flour werden eveneens getest in intralaboratoriumreproduceerbaarheidscondities voor natrium, maar dan ter staving van de LOQ gezien de lage concentraties aan natrium in deze CRM s. Besluit naar LOQ per element, waarbij de LOQ gelijk is aan de laagste verdunning waarvoor geldt dat de afwijking t.o.v. de nominale waarde maximaal 5 % bedraagt: zie Tabel hieronder. valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 14/24
Extrapollatie naar Extrapollatie naar Element LOQ in de meetoplossing HP500+ destructie Vaste stalen Vloeibare stalen Xpress destructie Vaste stalen Vloeibare stalen 0,5 g / 45 ml 3 g / 45 ml 0,2 g / 22,5 ml 2 g / 22,5 ml K, Na, P 200 µg/l 36 mg/kg 6 mg/kg 45 mg/kg 4,5 mg/kg Ca 100 µg/l 18 mg/kg 3 mg/kg 23 mg/kg 2,3 mg/kg Mg 125 µg/l 23 mg/kg 4 mg/kg 28 mg/kg 3 mg/kg Voor de elementen Ca, Na, P, K en Mg werd een melkpoeder bestemd voor zuigelingen in zesvoud opgelost volgens de voorschriften van de babyvoeding. In de destructie ervan en in verdunningen van de destructie ervan werd het gehalte aan mineralen en P gemeten. Voor alle gemeten gehalten was de Horrat voor herhaalbaarheid gunstig en was de terugvinding binnen het interval 85-110% ofwel gunstig. De laagst gemeten gehalten met gunstige resultaten zijn opgenomen in onderstaande tabel. Gezien de RSDr van deze resultaten klein is, is dit een duidelijke indicatie dat hier nog boven de LOQ wordt gemeten. De schattingen uit verdunningen zijn dus betrouwbaar. Laagste concentratie RSDr (%) Terugvinding Element gemeten in de test met (n) (%) zuigelingenmelk Ca 16 mg/kg 6,0 (5) 93,7 P 15 mg/kg 1,1 (6) 97,4 K 34 mg/kg 1,0 (5) 100,5 Mg 2,5 mg/kg 0,8 (6) 99,6 Na 8 mg/kg 1,1 (6) 106,4 Bijkomend werd getest wat de bijdrage kan zijn van de vessels gebruikt tijdens de microgolfdestructie voor de mineralen en P. Uit de test met de HP500+ vessels bleek een maximale puntcontaminatie van ongeveer 100 µg/l wat overeenkomt (rekening houdend met 0,2 g staal in totaal volume van 45 ml) met 22,5 mg/kg achtergrond ruis. Uit de test met de Xpress vessels werd een maximale puntcontaminatie van 128 µg/l of 14 mg/kg vastgesteld. Besluit voor de vessels: voor metingen boven de LOQ is de bijdrage van de vessel verwaarloosbaar, voor metingen nabij de LOQ kan het nodig de procedureblanco s in rekening te brengen. Zie ook stabiliteit en robuustheid ( 6). valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 15/24
5. Juistheid, selectiviteit en specificiteit Calcium Fosfor valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 16/24
Kalium Magnesium valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 17/24
Natrium valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 18/24
Ringtestresultaten 2015 : valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 19/24
Ringtestresultaten 2016: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 20/24
Besluit: Uit de verzamelde gegevens voor Juistheid uit CRM, bekomen door zowel herhaalbaarheidstesten als reproduceerbaarheidstesten, komt naar voor dat de juistheid voor alle elementen met zowel negatieve als positieve bias waarden binnen het interval 70 120 % ligt. De ringtestresultaten zijn alle gunstig voor de 5 elementen. Er zijn geen matrixeffecten en geen interferenties vastgesteld. De ringtestresultaten bevestigen dat de methode voldoende selectief en specifiek is om gebruikt te worden als bepalingsmethode voor calcium, fosfor, kalium, magnesium, natrium. 6. Robuustheid stabiliteit De stabiliteit van de concentratie aan element in de meetoplossing bekomen na microgolfontsluiting werd getest door deze meetoplossingen gedurende 30 dagen te bewaren en tussentijds het gehalte te analyseren en dit in verschillende omstandigheden met name gekoeld en bij kamertemperatuur. Besluit naar stabiliteit: de meetoplossingen kunnen 30 dagen bewaard worden zowel bij kamertemperatuur als gekoeld. Er wordt geen wijziging in concentratie vastgesteld. Het gehalte aan element blijft stabiel. Om na te gaan of er een verschil is tussen het gebruik van de HP500+ vessels (HP) en de Xpress vessels (Xp) en bijhorende manier van destructie (zelfde verhoudingen, maar verschil in inweeg, verschil in controle van de run), werden verschillende referentiestalen op de twee manieren gedestrueerd en vervolgens in eenzelfde reeks gemeten. Hierbij werd ook een herhaalbaarheidstest uitgevoerd op de BCR-063R Skim milk powder. Ruwe data: zie validatiedossier onderdeel herhaalbaarheid en Vergelijking HP vs. Xpress. Uit deze test blijkt dat het type vessel (grote HP500+ versus de kleinere Xpress) en het type controle van de destructie (druk en temperatuur bij HP500+ versus temperatuur via IR-sensor bij Xpress) globaal gezien geen significant verschil opleveren (op de set van 26 vergelijkingen uit controlekaarten: 2 significant HP>Xp, 1 Xp>HP, op de set van herhaalbaarheid: 1 geval voor Na HP>Xp). De methode is robuust op vlak van het type microgolfdestructie en bijhorende vessel voor deze elementen. Onderzoek van de aanwezigheid van de mineralen en P in de vessels leverde volgende informatie op: Voor HP500+ vessels en Xpress: - Er is een achtergrondcontaminatie. Deze achtergrondcontaminatie is lager dan de LOQ geschat uit verdunningen van standaardoplossingen, maar de maximaal teruggevonden achtergrondcontaminatie komt wel in de buurt van de LOQ (22,5 mg/kg voor HP500+ test en 14 mg/kg voor de Xpress test). - Reinigen van de doppen van de HP500+vessels met HNO3 geeft een significante daling in achtergrondcontaminatie aan mineralen en P. In 2016 werd digiprep ingevoerd als derde ontsluitingsmethode. Deze ontsluiting blijkt ook geschikt met goede ringtestresultaten en geen effect in de controlekaarten waar microgolf- en digiprep-ontsluiting door elkaar worden geregistreerd. valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 21/24
7. Trendanalyse Voor een trendanalyse: zie juistheid uit CRM ( 5) en ringtestresultaten: uit de juistheidstesten blijkt dat er zowel negatieve als positieve bias waarden gemeten worden. Er is geen significante trend. Verder worden alle ringtestresultaten opgenomen in de module PT. Daaruit worden automatische rapporten bijgehouden met o.a. trendanalyse voor z-score en zeta-score. Geen significante trend. Zeta-score geeft aan dat de meetonzekerheid goed is ingeschat. valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 22/24
Bijlage: foto s procedure Voorbeeld analysemonster etiket met waarborgen: Voorbereiding afwegen in microgolfvessels: Microgolfdestructie: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 23/24
Voorbereiding in digiprep: ICP-OES analyse van de meetoplossingen: valrap_mineralen_en_pvoedingicpoes_v.03_2017.doc pagina 24/24