scope EXPERTISE, DIENSTVERLENING EN KLANTENRELATIES KWALITEIT VAN MEDISCHE LABORATORIA COMMISSIE VOOR KLINISCHE BIOLOGIE COMITE VAN EXPERTEN EXTERNE KWALITEITSEVALUATIE VOOR ANALYSEN KLINISCHE BIOLOGIE DEFINITIEF GLOBAAL RAPPORT NIET- INFECTIEUZE SEROLOGIE ANA ENQUETE 2014/3 WIV-2014/3/ Niet-infectieuze serologie/25 Expertise, dienstverlening en klantenrelaties Kwaliteit van medische laboratoria J. Wytsmanstraat, 14 1050 Brussel België www.wiv-isp.be
ISSN: 2294-3382 Enquêtecoördinator: Dr. Van Campenhout Vervanger enquêtecoördinator: Dr. Van Blerk COMITE VAN EXPERTEN WIV (secretariaat) TEL: 02/642.55.22 FAX: 02/642.56.45 TEL: 02/642.53.95 e-mail: cvancampenhout@wiv-isp.be TEL: e-mail: 02/642.53.83 mvanblerk@wiv-isp.be Experten: Dr. BOSSUYT X. TEL: 016/34.70.09 FAX: 016/34.70.42 e-mail: xavier.bossuyt@uz.kuleuven.ac.be Dr. HUMBEL R. TEL: 352/488.288.380 FAX: 352/488.288.385. e-mail: rlhumbel@llip.lu Dr. MEWIS A. TEL: 011 33 82 21 FAX: 011 33 82 08 e-mail: alex.mewis@jessazh.be Dr. SERVAIS G. TEL: 02/477.25.07 FAX: 02/477.21.63 e-mail: genevieve.servais@chu-brugmann.be Dr. TOMASI J.P. TEL: 02/764.67.95 FAX: 02/764.11.11 e-mail: jean-paul.tomasi@uclouvain.be Dr. VAN HOOVELS L. TEL: 053/72.47.91 FAX: 053/72.45.88 e-mail: lieve.van.hoovels@olvz-aalst.be Dr. VERCAMMEN M. TEL: 02/477.52.01 FAX: e-mail: martine.vercammen@uzbrussel.be Expertenvergadering: 16/12/2014 Toestemming verspreiding rapport: Van Campenhout Christel enquêtecoördinator op 17/02/2015. Alle rapporten zijn tevens te raadplegen op onze website: https://www.wiv-isp.be/qml/activities/external_quality/rapports/_nl/rapports_annee.htm FORM 43/124/N v4 3/19
INHOUDSTAFEL INLEIDING... 5 ENQUÊTE SPECIFIEKE INFORMATIE... 5 AARD VAN DE STALEN... 5 DEELNAME... 5 RESULTATEN... 5 INDIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIE OP HEP-2(000) CELLEN... 5 ANA KERNPATROON RAPPORTERING... 8 ANA TITER RAPPORTERING... 8 OPSPOREN VAN ANTI-NDNA/ANTI-DSDNA ANTISTOFFEN... 12 AANTONEN EN IDENTIFICEREN VAN ANA/ANTI-ENA ANTISTOFFEN (GEEN IIF)... 13 ANA/ANTI-ENA SCREENINGTESTEN MET MENGSEL VAN ANTIGENEN... 13 IDENTIFICATIE VAN ANA/ANTI-ENA ANTISTOFFEN... 14 BESPREKING VAN DE RESULTATEN... 15 I. OPSPOREN VAN ANA D.M.V. INDIRECTE IMMUNOFLUORESCENTIE (IIF)... 15 II. ANTI N/DSDNA ANTISTOFFEN... 16 III. ANA/ANTI-ENA IDENTIFICATIE... 16 IV. AANBEVELINGEN VAN HET EXPERTEN COMITÉ VERSIE 2014... 16 V. VOORBEELDEN VAN TYPISCHE DFS70 PATRONEN... 18 FORM 43/124/N v4 4/19
Bepalen van Anti Nucleaire Antistoffen INLEIDING Enquête specifieke informatie De stalen van de enquête 2014/3 werden op 20 oktober 2014 verstuurd. De afsluitingsdatum voor het ingeven van de resultaten was 3 november 2014. Het voorlopig rapport was beschikbaar op onze website op 18 november 2014. De resultaten werden besproken en gevalideerd tijdens de vergadering van het comité van experten op 16 december 2014. Aard van de stalen Ter gelegenheid van de enquête 2014/3 hebben alle deelnemers één vloeibaar staal ontvangen, SN/12946 afkomstig van een patiënt met gekende aanwezigheid van ANA type DFS70. Wij danken Prof. RL Humbel (Laboratoire Luxembourgeois d Immuno- Pathologie-Luxembourg) voor het ons bezorgen van het monster en de nodige klinische inlichtingen. Het monster SN/12946 werd voorafgaandelijk goedgekeurd door de leden van het expertencomité. Deelname Twee Luxemburgse en 118 Belgische laboratoria hebben aan deze ronde deelgenomen. RESULTATEN Indirecte immunofluorescentie op HEp-2(000) cellen 117 laboratoria (97,5%) spoorden de aanwezigheid van antinucleaire antistoffen (ANA) op met indirecte immunofluorescentie (IIF). Aan de laboratoria werd samen met het antwoordformulier een lijst met ANA patronen bezorgd voor het beschrijven van het overeenkomstige ANA patroon van het EKE staal. FORM 43/124/N v4 5/19
Voorbeelden van verschillende ANA patronen kunnen teruggevonden worden op: https://www.wiv-isp.be/qml/activities/external_quality/_nl/serologie.htm Voor dit monster werd een uniform dens gespikkelde fluorescentie van het nucleoplasma van interfase cellen en van het gecondenseerde chromatine van de cellen in metafase verwacht, type DFS70 (dense fine speckles). Voor deze rondzending was de terminologie DFS70 nog niet opgenomen in de ter beschikking gestelde lijst met ANA patronen. Volgende tabel geeft een overzicht van de gerapporteerde resultaten: Kern (patroon) Aantal DFS70 1 Homogeen 44 Homogeen + DFS70 1 Homogeen + mitose 8 Homogeen + fijn gespikkeld 6 Mitose + fijn gespikkeld 31 Mitose + fijn gespikkeld + DFS70 4 Mitose + grof gespikkeld 2 Mitose + gespikkeld 2 Mitose + gespikkeld + DFS70 1 Fijn gespikkeld 10 Grof gespikkeld 1 Gespikkeld 2 Gespikkeld + nucleaire dots (enkele 4) 1 Negatief 2 Niet vermeld 1 Drie laboratoria maakten voor het opsporen van ANA geen gebruik van IIF maar gebruikten enkel een ANA screening test en bekwamen allen een negatief resultaat. Eén laboratorium heeft bijkomend ook anti-dna opgespoord en een ENA identificatie uitgevoerd en bekwam ook hiervoor negatieve resultaten. FORM 43/124/N v4 6/19
Volgende tabel geeft de patronen van de antistoffen weer bekomen met de verschillende HEp-2(000) cellen: Fabrikant N Kern N HEp-2 cellen Alphadia (101) 5 Homogeen 4 Homogeen fijn gestippeld 1 Diasorin ANA fluor 1 Grof gespikkeld 1 Euroimmun (102) 28 Homogeen 11 Homogeen mitose 2 Fijn gespikkeld mitose 7 Gespikkeld mitose 1 Gespikkeld mitose DFS70 1 Fijn gespikkeld 5 Gespikkeld 1 Inova (105) 25 DFS70 1 Homogeen 7 Homogeen mitose 2 Fijn gespikkeld mitose 9 Fijn gespikkeld 3 Positief 1 Negatief 2 Kallestad (106) 10 Homogeen 4 Fijn gespikkeld 2 Fijn gespikkeld mitose 4 Menarini Zenit (113) 10 Homogeen 2 Homogeen mitose 2 Fijn gespikkeld mitose 4 Grof gespikkeld mitose 1 Gespikkeld nucleaire dots ( 4) 1 HEp-2000 cellen Immuno Concepts (104) 38 Homogeen 16 Homogeen DFS70 1 Homogeen mitose 2 Homogeen fijn gespikkeld 5 Fijn gespikkeld mitose 7 Fijn gespikkeld mitose DFS70 4 Grof gespikkeld mitose 1 Gespikkeld mitose 1 Gespikkeld 1 FORM 43/124/N v4 7/19
115 laboratoria (98,3%) beschouwden de kernfluorescentie als positief, 2 laboratoria bekwamen een negatief resultaat voor ANA. Alle deelnemers hebben de cytoplasmatische fluorescentie als negatief geïnterpreteerd. ANA KERNPATROON RAPPORTERING Ongeveer de helft van de laboratoria hebben een gespikkeld patroon vermeld, de aanwezigheid van mitose beelden en/of een homogeen aspect. Zeven laboratoria vermelden de aanwezigheid van een anti-dfs70 patroon. Op te merken valt dat bijkomend 27 laboratoria de mogelijke aanwezigheid van anti-dfs70 antilichamen hebben vermeld met suggestie voor verdere identificatie. Bijgevolg hebben 53/117 laboratoria (45%) een aanvaardbaar patroon gerapporteerd. ANA TITER RAPPORTERING 111 deelnemers (96,5%) hebben een titer vermeld. Volgende tabel geeft de resultaten van de antistoftiter weer per fabrikant van HEp-2(000) cellen. Voor laboratoria die meerdere patronen hebben vermeld met overeenkomstige titers, werd de hoogste titer in de tabel opgenomen: Fabrikant N Titer HEp-2 cellen Alphadia 5 80(2)-320(3) 320(1) Diasorin ANA Fluor 1 160(1) Euroimmun 27 >100(1)-160(2)-320(7)-400(2)-500(1)-640(7)-800(1)-1000(1)- 1280(3)-2500(2) Inova 22 160(6)-320(12)-640(4) Kallestad 10 100(1) 160(1)-320(5)-640(3) Menarini Zenit 10 160(1)-320(5)-640(3)-1000(1) HEp-2000 cellen Immuno Concepts 36 160(2)-320(7)-640(21)-800(1)-1280(4)-2560(1) FORM 43/124/N v4 8/19
Volgende tabel geeft de medianen van de antistoftiters weer voor de HEp-2(000) cellen, waarvoor er minstens 5 gebruikers de titer vermeld hebben: Kern fluorescentie Cellen Fabrikant Aantal Mediaan HEp-2 cellen Alphadia 5 320 Euroimmun 27 640 Diasorin ANA fluor 1 160 Inova 22 320 Kallestad 10 320 Menarini Zenit 10 320 HEp-2000 cellen Immuno Concepts 36 640 Onderstaande grafiek geeft de globale verdeling van de antistoftiter weer: Percentage laboratoria 0 10 20 30 40 80 160 320 640 1280 2560 Titer De globale mediaan bedraagt 1/320 De spreiding van de resultaten blijft aanzienlijk, ook binnen eenzelfde systeem. FORM 43/124/N v4 9/19
Onderstaande grafieken geven de verdeling van de antistoftiter weer voor de HEp-2(000) cellen, waarvoor er minstens 5 gebruikers de antistoftiter vermeld hebben: Percentage laboratoria 0 10 30 50 70 Alphadia N=5 ; 320(1) 80 160 320 640 1280 2560 Titer Percentage laboratoria 0 10 30 50 70 Euroimmun N=27 ; >100(1) 80 160 320 640 1280 2560 Titer Percentage laboratoria 0 10 30 50 70 Inova N=22 80 160 320 640 1280 2560 Titer FORM 43/124/N v4 10/19
Percentage laboratoria 0 10 30 50 70 Kallestad N=10 ; 160 (1) 80 160 320 640 1280 2560 Titer Percentage laboratoria 0 10 30 50 70 Menarini Zenit N=10 80 160 320 640 1280 2560 Titer N=36 FORM 43/124/N v4 11/19
Opsporen van anti-ndna/anti-dsdna antistoffen Er werden voor dit monster geen anti- n/dsdna antistoffen verwacht. 93 laboratoria (77.5%) spoorden de aanwezigheid van anti-ndna/antidsdna antistoffen op, waarvan 15 met 2 technieken en 1 met 3 technieken. Geen enkel laboratorium bekwam een positief resultaat. Volgende tabel geeft een overzicht van de gebruikte technieken: Techniek Aantal resultaten % laboratoria Crithidia l. 12 12.9 ELISA-EIA-FEIA 56 60.2 Dot-LIA 8 8.6 Farr 1 1.1 Crithidia l./elisa-eia-feia 9 9.7 Crithidia l./elisa-eia-feia/dot-lia 1 1.1 Crithida l./dot-lia 1 1.1 ELISA-EIA-FEIA/Dot-LIA 5 5.4 FORM 43/124/N v4 12/19
Aantonen en identificeren van ANA/anti-ENA antistoffen (geen IIF) 108 laboratoria (90%) spoorden de aanwezigheid van anti-ena antilichamen op met één of meerdere methoden. 12 laboratoria spoorden de aanwezigheid van deze antilichamen niet op. Zij hebben wel allen IIF uitgevoerd. 1 laboratorium bekwam een negatief resultaat. De andere 11 laboratoria hebben allen een kernfluorescentie vermeld. ANA/anti-ENA screeningtesten met mengsel van antigenen Alle laboratoria behalve 2, die een ANA/anti-ENA screeningtest uitvoerden, bekwamen een negatief resultaat. Eén laboratorium vermeldt positiviteit zonder bijkomende identificatie en één laboratorium vermeldt een twijfelachtig resultaat (+/-) en suggereert bijkomend onderzoek naar de aanwezigheid van anti-dfs70 antistoffen. Volgende tabel geeft een overzicht van de resultaten en de gebruikte technieken voor de ANA/anti-ENA screeningtesten: Fabrikant N Resultaat Aesku.diagnostics/BMD 2 - Alphadia 2 1+ en 1 - Biorad 1 - Chorus Diesse/BMD 1 - Diasorin Liaison 5 - Diasorin ETI-Max 2 1 +/- en 1 - Euroimmun 8 - Inova 7 - Phadia Elia 24 - Phadia ENA Symphony 9 - Thermo Fischer CTD screen 1 - Varelisa 1 - Uit bovenstaande resultaten blijkt dat in geen enkel van de gebruikte testsystemen deze antigenen aanwezig zijn, gezien de aanwezigheid van anti- DFS70 antistoffen in dit monster. FORM 43/124/N v4 13/19
Identificatie van ANA/anti-ENA antistoffen Volgende tabel geeft per methode en fabrikant een overzicht van de resultaten bekomen voor de anti-ena identificatietesten: Methode N Fabrikant N Resultaat N Dot/LIA 60 Alphadia 14 DFS70 4 Nucleosomen 1 Negatief 9 BMD 6 Negatief 6 Euroimmun 33 SSA (zwak) 1 Negatief 32 Innogenetics 3 Negatief 3 Viramed: ANA Viro Stripe IgG test 1 Negatief 1 AESKU Diagnostics 2 Negatief 2 Niet vermeld 1 DFS70 1 ELISA/FEIA/EIA 32 BioRad 1 Negatief 1 CLIA Innogenetics 1 Negatief 1 Inova 5 Negatief 5 Phadia EliA 15 Negatief 15 Euroimmun 4 SSA sterk positief 1 Negatief 3 Phadia Varelisa 1 Negatief 1 ANA Profile 1 Negatief 1 Phadia ENA Symphony 1 Negatief 1 Menarini (Micro array Amidot) 1 Negatief 1 Alphadia 2 Nucleosomen 1 Negatief 1 De meeste van de hierboven vermelde testsystemen, die in de routine gebruikt worden, blijken de DFS70 antigenen niet te bevatten. FORM 43/124/N v4 14/19
Bespreking van de resultaten I. Opsporen van ANA d.m.v. indirecte immunofluorescentie (IIF) Patronen Voor deze enquête werd een monster rondgestuurd waarin de aanwezigheid van anti-dfs70 antistoffen werd bevestigd. De aanwezigheid van een dens gespikkelde kernfluorescentie van de cellen in interfase en de aanwezigheid van gecondenseerd chromatine (mitose beelden) in de mitose cellen diende te worden opgemerkt. Ongeveer de helft van de laboratoria hebben een gespikkeld patroon vermeld, de aanwezigheid van mitose beelden en/of een homogeen aspect. 34/117 laboratoria hebben de aanwezigheid van anti-dfs70 vermeld of gesuggereerd, 5 onder hen hebben d.m.v. een ENA identificatietechniek deze ook aangetoond. De interpretaties homogeen en nucleair dots kunnen niet als correct worden geïnterpreteerd, evenmin als negatief. De aanwezigheid van mitose beelden zijn geen eenduidige indicatie voor de aanwezigheid van een homogeen patroon; dit is foutieve informatie die in het verleden door een aantal firma s werd gecommuniceerd. De noodzaak voor het uittitreren van ANA beelden wordt eens te meer aangetoond voor dit monster ; gespikkelde kernpatronen in hoge concentraties kunnen bij screening homogene beelden opleveren, bij uittitratie kunnen gespikkelde beelden tevoorschijn komen. Gezien de klinisch belangrijke associaties met homogene patronen, is het noodzakelijk een correct onderscheid te maken tussen gespikkelde kernpatronen en homogene patronen. Een geïsoleerd DFS70 IIF patroon op HEp-2 cellen, in afwezigheid van andere specifieke ANA en anti ds/ndna antistoffen, duidt meestal niet op de aanwezigheid van een systemische reumatoïde auto-immune aandoening. Het is dus zeer belangrijk dit patroon te herkennen om onnodig ongerustheid te veroorzaken en overbodige testen te vermijden. Titers Een opmerkelijk grote spreiding wordt bekomen voor de HEp-2 cellen van Euroimmun en de HEp-2000 cellen van ImmunoConcepts. De mediane titers bekomen per fabrikant, zijn wel aanvaardbaar (320 640). FORM 43/124/N v4 15/19
II. Anti n/dsdna antistoffen Voor dit monster werden geen anti n/dsdna antistoffen verwacht. Alle laboratoria hebben dit monster correct als negatief geïnterpreteerd. Wat betreft de gebruikte technieken wensen wij nogmaals uw aandacht te vragen voor de tekst hieronder: V. Aanbevelingen van het expertencomité versie 2014 punt 6. III. ANA/anti-ENA identificatie De resultaten van de screeningtesten tonen aan dat DFS70 antigenen niet aanwezig zijn in de gebruikte testsystemen. Eenzelfde vaststelling wordt gedaan bij de resultaten voor de identificatie van de ENA-antistoffen. Enkel voor de Dot-methode van Alphadia rapporteren 4/14 laboratoria de aanwezigheid van anti-dfs70 en ook 1 laboratorium dat gebruik maakt van een Dot-methode zonder vermelding van fabrikant. IV. Aanbevelingen van het experten comité versie 2014 1. IIF op HEp-2 cellen blijft de gouden standaard voor ANA detectie. Indien voor het opsporen van ANA gebruik gemaakt wordt van een test, die gebaseerd is op een mengsel van gedefinieerde antigenen, dan moeten de beperkingen van deze test gekend zijn bij de clinici. 2. Bij twijfel dient het aflezen van ANA resultaten bekomen met IIF door 2 personen te gebeuren. 3. Het is belangrijk een ANA titratie uit te voeren maar een titratie >1/5000 heeft geen toegevoegde klinische waarde. 4. Een cytoplasmatisch of centromeer patroon moet aan de clinici gerapporteerd worden. 5. Het is belangrijk aan de clinici mee te delen met welke techniek de anti-dsdna bepaling uitgevoerd werd. 6. Het is niet aanbevolen een dot techniek te gebruiken voor de bepaling van de anti-dsdna antistoffen. Het opsporen van deze antistoffen met IIF op Crithidia luciliae is weinig gevoelig en moeilijk te interpreteren. 7. De resultaten van de bepaling van de anti-dsdna antistoffen moeten kwantitatief gerapporteerd worden. 8. Het is aanbevolen anti-ena antistoffen te typeren voor de meest frequente klinisch belangrijke ENA (SSA-A/Ro60, SS-B, Sm, RNP, CENP-B, Scl-70, en Jo-1). FORM 43/124/N v4 16/19
9. Het is aanbevolen de resultaten van de bepaling van de anti-ena antistoffen te vermelden voor ALLE geteste ENA s. Indien een screeningsmethode als negatief wordt gerapporteerd, dient te worden aangegeven welke ENA in die test vervat zijn. 10. Indien het gebruikte testsysteem het onderscheid toelaat tussen anti-ss-a/ro60 en anti-ss- A/Ro52 antistoffen, dienen de resultaten voor beide antistoffen vermeld te worden. 11. De detectie van anti-sm antistoffen moet SmD specifiek zijn. Enkel anti-smd antistoffen mogen gerapporteerd worden als anti-sm antistoffen (anti-smb antistoffen mogen niet gerapporteerd worden als anti-sm antistoffen). 12. Indien ANA worden teruggevonden, is het aangewezen een anti-ena antistoffen bepaling toe te voegen of de clinicus te suggereren deze analyse aan te vragen. 13. In functie van het bekomen ANA patroon (minstens voor een homogeen patroon met positieve mitoses ), is het aangewezen een anti-dsdna antistoffen bepaling toe te voegen of de clinicus te suggereren deze bepaling aan te vragen. 14. De aanwezigheid van mitose beelden is niet sensu stricto geassocieerd met een homogeen patroon. 15. In afwezigheid specifieke ANA en anti-ds/ndna antistoffen is de aanwezigheid van anti- DFS70 antistoffen zelden geassocieerd met systemische reumatische aandoening (SLE, Sjögren, systemische sclerose, mixed connective tissue disease-mctd, inflammatoire myopathie). Het herkennen van het DFS70 patroon op HEp-2 cellen (dense fine speckles) is belangrijk, in het kader van een correcte rapportering naar de clinicus om overbodige extra onderzoeken en onnodige ongerustheid bij zowel de clinicus als de patiënt te vermijden. FORM 43/124/N v4 17/19
V. Voorbeelden van typische DFS70 patronen DFS70 patroon HEp-2 cellen Euroimmun (Laboratorium O.L.V. - Aalst) Kernfluorescentie met uniforme dense spikkels in het nucleoplasma van de interfase cellen en aanwezigheid van gecondenseerd chromatine in de mitose cellen DFS70 patroon HEp-2 cellen (INOVAView) (Laboratorium O.L.V. Aalst) FORM 43/124/N v4 18/19
DFS70: Dense Fine Speckles Uniform dens gespikkelde kernfluorescentie van interfase cellen en gecondenseerd chromatine van de cellen in mitose. (granulaire mitose beelden). VI. AANBEVOLEN LITERATUUR: EINDE Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid, Brussel 2014. Dit rapport mag niet gereproduceerd, gepubliceerd of verdeeld worden zonder akkoord van het WIV. FORM 43/124/N v4 19/19