DEFINITIEF GLOBAAL RAPPORT IMMUNOHISTOCHEMIE p16/p53 ENQUETE 2016/2

Transcriptie

1 scope EXPERTISE, DIENSTVERLENING EN KLANTENRELATIES KWALITEIT VAN MEDISCHE LABORATORIA COMMISSIE VOOR PATHOLOGISCHE ANATOMIE WERKGROEP EKE EXTERNE KWALITEITSEVALUATIE VOOR ANALYSES PATHOLOGISCHE ANATOMIE DEFINITIEF GLOBAAL RAPPORT IMMUNOHISTOCHEMIE p16/p53 ENQUETE 2016/2 WIV-2017/Immunohistochemie/2 Expertise, dienstverlening en klantenrelaties Kwaliteit van medische laboratoria J. Wytsmanstraat, Brussel België

2 ISSN: COMITE IMMUNOHISTOCHEMIE WIV (secretariaat) TEL: FAX: Enquêtecoördinator: Ghislain V. TEL : vghislain@wiv-isp.be Vervanger enquêtecoördinator: Verbeke H. TEL: hverbeke@wiv-isp.be Leden van de werkgroep EKE: Dr. Dierick AM. TEL : FAX: Anne-Marie.Dierick@wiv-isp.be Dr. Galant C. TEL: FAX: christine.galant@uclouvain.be Dr. Pauwels P. TEL: FAX: patrick.pauwels@uza.be Dr. Pétein M. TEL: FAX: michel.petein@ipg.be Dr. Van den Heule B. TEL: FAX: bvdh@labocmp.be Externe experten: Dr. Driessen A. Dr. Duwel V. UZ Antwerpen AZ Klina Brasschaat Vergadering werkgroep : / Toestemming verspreiding rapport: Door V. Ghislain (enquêtecoördinator) op 16/01/2017. Alle rapporten zijn tevens te raadplegen op onze website: FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 2/15

3 INHOUDSTAFEL 1. INLEIDING Doel van de EKE Uitbestede activiteiten Materiaal van de EKE Vraag Antwoordformulier BEOORDELING Algemene criteria* Specifieke criteria* per epitoop p p Eindbeoordeling RESULTATEN Deelname aan de EKE Overzicht van de resultaten Resultaten per antilichaam p p BESPREKING VAN DE RESULTATEN Stabiliteit van de ongekleurde coupes p p Controleweefsels BEELDEN FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 3/15

4 1. Inleiding Dit document bestaat uit een overzicht en een bespreking van de resultaten van de externe kwaliteitsevaluatie (EKE) Immunohistochemie 2016/2 (p16, p53) Doel van de EKE Deze EKE had als doel de kwaliteit van de immunohistochemische kleuringen p16 en p53 te beoordelen Uitbestede activiteiten Het weefselmateriaal is afkomstig van het laboratorium pathologische ontleedkunde van het OLV ziekenhuis te Aalst Materiaal van de EKE Het opgestuurde materiaal bestond uit 2 ongekleurde paraffinecoupes met punchbiopten, afkomstig van multiblokken. De punchbiopten bestonden zowel uit normale weefsels als uit klinisch relevante tumoren en toonden een verschillend niveau van proteïne-expressie (hoog, gemiddeld, laag, geen expressie). De coupe voor p16 bestond uit punchbiopten met : 1. Normale tonsil 2. Normale cervix 3. Cervix, CIN2 4. Plaveiselcelcarcinoom in situ 5. Ovarium, endometrioïd adenocarcinoom De coupe voor p53 bestond uit punchbiopten met : 1. Normale tonsil 2. Normale pancreas 3. Normale appendix 4. Normale lever 5. Ovarium, endometrioïd adenocarcinoom 6. Colon, mucineus adenocarcinoom De homogeniteit van de stalen werd getest door het laboratorium pathologische ontleedkunde van het OLV ziekenhuis te Aalst. De stalen werden beschouwd als homogeen (in die zin dat elk panel van 2 coupes identieke informatie bevat) en stabiel tot de limietdatum van de enquête Vraag Er werd gevraagd om de coupes te kleuren voor p16 en p53, volgens de standaardprocedures van het laboratorium. Een eigen controle(coupe) kon worden toegevoegd. Er werd gevraagd om de stalen te behandelen zoals patiëntenstalen, d.w.z. dat de stalen dienden geïntegreerd te worden in de routine samen met patiëntenstalen Antwoordformulier Er werd gevraagd een antwoordformulier in te vullen betreffende de gebruikte technieken. FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 4/15

5 2. Beoordeling De evaluatie van de kleuringen werd uitgevoerd door 3 anatoom-pathologen, Ann Driessen (UZA), Valerie Duwel (AZ Klina, Brasschaat) en Anne Marie Dierick (WIV) in aanwezigheid van een wetenschappelijk medewerker, Bart De Wiest (OLV, Aalst). Deze administratieve en wetenschappelijke structuur garandeert de kwaliteit en de anonimiteit van de resultaten Algemene criteria* Algemeen is de beoordeling gebaseerd op : de specificiteit : er moet een voldoende en specifiek signaal aanwezig zijn; de achtergrond : in principe mag een immunohistochemische kleuring geen aspecifieke achtergrond genereren; de morfologie : de kleuring mag de morfologie zo weinig mogelijk wijzigen. (*) Referentie : Specifieke criteria* per epitoop p16 1) Normale tonsil (controle sensitiviteit) : matig tot sterke (nucleaire en cytoplasmatische) aankleuring van verspreide plaveiselcellen in de lymfocytenrijke zones van het cryptepitheel en in verspreide folliculaire dendritische cellen van de kiemcentra 2) Normale cervix (controle specificiteit) : geen aankleuring van het plaveiselcelepitheel stromale cellen meestal negatief 3) Cervix, CIN2 (controle sensitiviteit) : matig tot sterke (nucleaire en cytoplasmatische) aankleuring van tenminste de onderste twee derde van het dysplastisch epitheel van de cervix 4) Plaveiselcelcarcinoom in situ : sterke (nucleaire en cytoplasmatische) aankleuring van de neoplastische cellen (sterke expressor) 5) Ovarium, endometrioïd adenocarcinoom : zwakke tot matige, verspreide (nucleaire en cytoplasmatische) aankleuring van de neoplastische cellen p53 1) Normale tonsil 1 (lage expressor : controle sensitiviteit) : zwakke tot matige kernkleuring van de B-cellen in de kiemcentra ( 20%) en in de mantelzone (<10%) van de follikels 2) Normale pancreas 2 (controle specificiteit) : geen aankleuring, geen cytoplasmatische aankleuring 3) Normale appendix (lage expressor : controle sensitiviteit) : zwakke tot matige kernkleuring in verspreide epitheliale cellen in de basale crypten zwakke tot matige kernkleuring in de B-cellen van de kiemcentra in de eventueel aanwezige lymfoïde follikels geen aankleuring in de luminale epitheliale cellen 4) Normale lever 2 (controle specificiteit) : geen aankleuring in de hepatocyten 5) Ovarium, endometrioïd adenocarcinoom 3 (sterke expressor) : matig tot sterke kernkleuring in de meeste neoplastische cellen 6) Colon, mucineus adenocarcinoom 3 (sterke expressor) : matig tot sterke kernkleuring in de meeste neoplastische cellen (*) Referentie : FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 5/15

6 (1) een matig tot sterke aankleuring in verspreide basale cellen van het plaveiselcelepitheel is correct maar werd niet als evaluatiecriterium meegenomen (2) zeldzame positieve kernen werden aanvaard bij een optimaal resultaat indien aan de andere criteria werd beantwoord (3) beperkte aankleuring in de stromale cellen werd aanvaard 2.3. Eindbeoordeling Elke kleuring kreeg een eindbeoordeling, gebaseerd op volgende criteria* : Optimaal : perfecte of quasi perfecte aankleuring in alle weefsels Goed : voldoende aankleuring in alle weefsels; niettemin is optimalisatie van het protocol mogelijk voor een betere sensitiviteit en/of signal-to-noise ratio Borderline : onvoldoende aankleuring, bv. algemeen te zwakke kleuring of een vals negatieve of vals positieve kleuring in één van de weefsels; optimalisatie van het protocol is nodig : slechte aankleuring, bv. een vals negatieve of vals positieve kleuring in meerdere weefsels; optimalisatie van het protocol is dringend nodig (*) Referentie : 3. Resultaten 3.1. Deelname aan de EKE Gewest Aantal laboratoria dat stalen ontving (ingeschrevenen) Aantal laboratoria dat p16 coupe terugstuurde Aantal laboratoria dat p53 coupe terugstuurde Vlaams gewest Brussels gewest Waals gewest Firma s Totaal Overzicht van de resultaten De firma s werden niet opgenomen in de resultaten. Eindresultaat p16 p53 Optimaal 20 (28%) 5 (7%) Goed 24 (34%) 16 (23%) Borderline 17 (24%) 17 (25%) 10 (14%) 31 (45%) Totaal FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 6/15

7 Aantal laboratoria Figuur 1 : Overzicht resultaten Immunohistochemie 2016/ Optimaal Goed Borderline 0 p16 p Resultaten per antilichaam De firma s werden niet opgenomen in de resultaten p16 Kloon N Producent Optimaal Goed Borderline Geslaagd* Geconcentreerde antilichamen (n=12) mm G BD (n=9) 1 Immunologic % mm JC8 (n=3) 3 Santa Cruz /3 Ready-To-Use antilichamen (n=43) mm E6H4 Cell Marque/ 43 (n=43) Ventana % Ready-To-Use en verder verdund (n=16) mm E6H4 Cell Marque/ 16 (n=16) Ventana % (*) optimaal/goed mm = mouse monoclonaal antilichaam FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 7/15

8 p53 Kloon N Producent Optimaal Goed Borderline Geslaagd* Geconcentreerde antilichamen (n=17) 8 Dako % 3 Thermo/ Neomarkers Leica/ mm DO-7 2 Novocastra (n=16) % mm BP53-12 (n=1) mm DO-7 (n=43) mm Bp53-11 (n=8) 1 Biocare mm DO-7 (n=1) 1 Thermo/ Neomarkers (*) optimaal/goed mm = mouse monoclonaal antilichaam 4. Bespreking van de resultaten 1 Cell Marque/ Ventana 1 Santa Cruz 1 Zytomed Systems Ready-To-Use antilichamen (n=51) 27 Dako % 13 Cell Marque/ Ventana % 3 Leica/ Novocastra /3 8 Cell Marque/ Ventana % Ready-To-Use en verder verdund (n=1) 4.1. Stabiliteit van de ongekleurde coupes De coupes werden gesneden op 15 september 2016 ( week 1 ) en verstuurd op 19 september 2016 ( week 2 ). Er werd aan de deelnemers gevraagd om aan te geven op welke datum de kleuringen werden uitgevoerd zodat kon worden nagegaan of de tijd tussen het snijden en het kleuren van de coupes een invloed had op het resultaat van de kleuring. Er zijn geen aanwijzingen voor een verschil tussen de resultaten van de kleuringen uitgevoerd in week 2 t.o.v. week 3 volgend op het snijden van de coupes (gegeneraliseerd lineair probit model voor binaire gegevens). p16 1 p53 2 Week Geslaagd 3 26 (67%) 13 (35%) Niet geslaagd 4 13 (33%) 24 (65%) Week Geslaagd 14 (54%) 6 (26%) Niet geslaagd 12 (46%) 17 (74%) Week Geslaagd 4 (67%) 2 (22%) Niet geslaagd 2 (33%) 7 (78%) Totaal (1) P-waarde = (significant indien P < 0.05) (2) P-waarde = (significant indien P < 0.05) (3) optimaal/goed (4) borderline/onvoldoende FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 8/15

9 4.2. p16 De p16 kleuring was van optimale of goede kwaliteit bij 44/71 deelnemers (62%) (zie figuur 1). De kleuring werd door 70 laboratoria uitgevoerd d.m.v. een automaat en door 1 laboratorium manueel. Er was een controlecoupe aanwezig bij 23/71 deelnemers (32%). De meest gebruikte kloon is E6H4 (59/71 laboratoria of 83%). Een geconcentreerd antilichaam werd door 12/71 laboratoria (17%) gebruikt, een Ready-To-Use antilichaam door 43/71 laboratoria (60.5%); 16 laboratoria (22.5%) hebben een Ready-To-Use antilichaam verder verdund. Er werd een statistisch significant verschil vastgesteld tussen de resultaten behaald met geconcentreerde vs. Ready-To-Use antilichamen (gegeneraliseerd probit model voor binaire gegevens : P-waarde = ). Ready-To-Use antilichamen (niet verder verdund) resulteerden in betere resultaten dan geconcentreerde antilichamen (zie figuur 2). 50 Figuur 2 : p16 - verdunning antilichaam Geconcentreerd (1/10-1/300) 32 Ready-To-Use 6 10 Ready-To-Use en verder verdund (1/2-1/8) onvoldoende/borderline goed/optimaal Een onvoldoende resultaat werd getypeerd door een onvoldoende aankleuring van tonsil en CIN2, hetgeen wijst op een onvoldoende sensitief protocol. In deze EKE werden met de G kloon geen goede resultaten bekomen, terwijl dit antilichaam bij NordiQC wel goed scoort (rondzending van 2009). Een onvoldoende sensitief protocol bij gebruik van deze kloon kan te wijten zijn aan het gebruik van een HIER buffer met lage ph (ph6); het is aan te raden een HIER buffer met een hoge ph te gebruiken. Bij gebruik van deze kloon is validatie van het protocol met een lage expressor cruciaal. Een onvoldoende kleuring bij gebruik van de E6H4 kloon kan te wijten zijn aan de concentratie van het antilichaam (verder verdunnen van het RTU antilichaam) en/of een te korte incubatietijd van het antilichaam. Tonsil wordt aanbevolen als controleweefsel : de folliculaire dendritische cellen moeten minstens matig aankleuren (lage expressor), terwijl de B-cellen van de kiemcentra niet aankleuren. FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 9/15

10 4.3. p53 De p53 kleuring was van optimale of goede kwaliteit bij 21/69 deelnemers (30%) (zie figuur 1). De kleuring werd door 68 laboratoria uitgevoerd d.m.v. een automaat en door 1 laboratorium manueel. Er was een controlecoupe aanwezig bij 23/69 deelnemers (33%). De meest gebruikte kloon is DO-7 (60/69 laboratoria of 87%). Een geconcentreerd antilichaam werd door 17/69 laboratoria (25%) gebruikt, een Ready-To-Use antilichaam door 51/69 laboratoria (74%); 1 laboratorium heeft een Ready-To-Use antilichaam verder verdund. Er werd geen statistisch significant verschil vastgesteld tussen de resultaten behaald d.m.v. geconcentreerde vs. Ready-To-Use antilichamen (gegeneraliseerd probit model voor binaire gegevens : P-waarde = ) (zie figuur 3). 60 Figuur 3 : p53 - verdunning antilichaam Geconcentreerd (1/50-1/2000) Ready-To-Use 1 Ready-To-Use en verder verdund (1/3) onvoldoende/borderline goed/optimaal Een onvoldoende resultaat werd getypeerd door zowel een onvoldoende aankleuring van de lage expressors (tonsil en appendix) als van de hoge expressors (ovarium- en coloncarcinoom). De oorzaak van de mindere resultaten is onduidelijk. Uit deze EKE blijkt dat het mogelijk is om een voldoende (goed of optimaal) resultaat te bekomen op elk van de platformen (Dako, Leica en Ventana automaat) en met elk van de gebruikte klonen DO-7 en Bp53-11 (uitgezonderd BP53-12). Voor alle klonen is het van belang de HIER en de titer van het antilichaam zorgvuldig te kalibreren. Tonsil en colon worden aanbevolen als controleweefsel : in de tonsil moeten 20% van de B-cellen in de kiemcentra en <10% van de B-cellen in de mantelzone zwak tot matig aankleuren (lage expressor); in colon moeten verspreide epitheliale cellen in de basale crypten zwak tot matig aankleuren, terwijl de luminale epitheliale cellen niet aankleuren Controleweefsels Uit deze EKE is gebleken dat sommige laboratoria een verkeerde controle gebruiken, namelijk weefsels (meestal tumorweefsel) met een hoog (of onbekend) expressieniveau. Het gebruik van positieve controles met enkel hoge expressieniveaus van het antigen kan leiden tot onvoldoende optimalisatie van de IHC test. Daarom is het aan te raden om ook weefsels met een zwak expressieniveau als controle te gebruiken. FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 10/15

11 5. Beelden De gekleurde coupes van alle deelnemers zijn digitaal te bekijken via onze PathXL website Meldt u aan met uw QML-deelnemersnummer en klik op EKE Immunohistochemie 2016/2. Informatie over het gebruik van PathXL vindt u op dezelfde website. Enkele voorbeelden zijn weergegeven op de volgende pagina s. p16 Tonsil : sterke expressor Optimaal p16 CIN2 : sterke expressor Optimaal FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 11/15

12 p16 Plaveiselcelcarcinoom (sterke expressor) en ovariumcarcinoom (lage expressor) Optimaal FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 12/15

13 p53 Ovariumcarcinoom : sterke expressor Optimaal FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 13/15

14 p53 Coloncarcinoom (sterke expressor) en tonsil (lage expressor) Optimaal p53 Appendix : lage expressor Optimaal FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 14/15

15 EINDE Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid, Brussel Dit rapport mag niet gereproduceerd, gepubliceerd of verdeeld worden zonder akkoord van het WIV. FORM 43/124/N V7 (toepassingsdatum : 18/01/2016). 15/15