VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION

VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Goedgekeurd door Approuvé par I-MET-FLVVT-005 Bepaling van lasalocid-natrium in dierenvoeders Détermination de lasalocide-sodium dans les aliments pour animaux HPLC HPLC Dierenvoeders Aliments pour animaux Totaal Totale Secundair Secondaire Mini-validatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie Handtekeningen Signatures: toevoegingsmiddelen (get.) Datum - Date: Nvt Naam Nom: M. Lekens Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Labomanager (get.) Datum - Date: Nvt LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 1/15

Stap Phase 1: Bepaling van het toepassingsgebied Déterminer le champs d application De methode moet geschikt zijn voor de kwantitatieve bepaling van lasalocid in diervoeders en voormengsels. Het gehalte aan lasalocid in diervoeders bedraagt gewoonlijk 75 à 125 mg/kg, in voormengsels gaat het meestal om gehaltes van 10000 mg/kg (1%) of meer. Het werkgebied zal zo opgesteld worden dat de courante concentraties probleemloos kunnen gemeten worden en kritische concentraties niet helemaal aan de uitersten van het werkgebied liggen. Stap Phase 2: Doel en statuut van de analysemethode Le but et status de la méthode d analyse Kwantitatieve bevestigingsmethode, afgeleide methode gebaseerd op Europese Verordening 2009/152/EG (Bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders). Stap Phase 3: Keuze validatieparameters Choisir les paramètres à valider Voor deze methode worden de volgende prestatiekenmerken bepaald: lineariteit en werkgebied, precisie - reproduceerbaarheid (intra-) en/of herhaalbaarheid, juistheid en/of terugvinding, bepaalbaarheidsgrens (rapporteringsgrens) en/of aantoonbaarheidsgrens, specificiteit en selectiviteit, en toepasbaarheid/robuustheid/stabiliteit. Stap Phase 4: Externe eisen voor validatieparameters Des exigences externes pour les paramètres à valider Nvt Stap Phase 5: Keuze van de monsters Le choix d échantillons De geschiktheid van de methode zal getest worden op (gedopeerde) routinemonsters die een grote gelijkenis met de meest voorkomende praktijkmonsters vertonen. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 2/15

VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaption I-MET-FLVVT-005 Bepaling van lasalocid-natrium in dierenvoeders Détermination de lasalocide-sodium dans les aliments pour animaux HPLC HPLC Dierenvoeders Aliments pour animaux 2014-12-22 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 3/15

Overzicht van de prestatiekenmerken: o Zie paragraaf 3 De validatie voldoet aan procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: o Zie paragraaf 3.2 en 3.3 (zowel juistheid als precisie bepaald op minstens 1 niveau) Historiek validatie Versie Herziening door/datum Reden van herziening Wijzigingen 01 02/2001, A. Fontaine Opsteller initiële versie Volledige tekst 02 02/2005, M. Lekens Aanvraag BELAC accreditatie Volledige tekst 02 12/2005, M. Lekens Aanpassing n.a.v. audit 06- Toevoeging validatiegegevens 2005 02 01/2006, M. Lekens Trendanalyse Toevoeging controlekaartgegevens 03 12/2014, M. Vanbrabant Voorbereiding publicatie en toevoegen nieuwe data Volledige tekst; Toevoeging validatieplan en overzicht validatierapport + historiek LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/15

VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par I-MET-FLVVT-005 Bepaling van lasalocid-natrium in dierenvoeders Détermination de lasalocide-sodium dans les aliments pour animaux HPLC HPLC Dierenvoeders Aliments pour animaux Totaal Totale Secundair Secondaire Mini-validatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie Handtekeningen Signatures: toevoegingsmiddelen (get.) Datum - Date: 2014-12-22 Raymond Van Sandt: laborant Martine Bral: laborant Annemie Voets: laborant Nele Maris : laborant Start - Début: 2001-01 Einde - Fin: 2014-12 Naam Nom: Mandy Lekens Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Labomanager (get.) Datum - Date: 2014-12-24 Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 5/15

SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS RÉSUMÉ DES DONNÉES DE VALIDATION... 7 1 DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED... 7 2 ANALYSEMETHODE EN ANALISTEN... 7 3 PRESTATIEKENMERKEN... 7 3.1 LINEARITEIT EN WERKGEBIED... 7 3.2 PRECISIE... 8 3.2.1 Intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSDRw)... 8 3.2.1.1 Diervoeder midden niveau (10-1000 mg/kg) (M. Vanbrabant, 2014)... 8 3.2.2 Herhaalbaarheid (%RSDr )... 9 3.2.2.1 Diervoeder laag niveau ( 10 mg/kg) (M. Lekens, 2005)... 10 3.2.2.2 Diervoeder midden niveau (10-1000 mg/kg) (M. Lekens, 2005)... 10 3.2.2.3 Diervoeder midden niveau (10-1000 mg/kg) (M. Lekens, 2005)... 11 3.2.2.4 Diervoeder hoog niveau ( 1000 mg/kg) (A. Fontaine, 2001)... 11 3.3 JUISTHEID EN/OF TERUGVINDING (M. VANBRABANT, 2014)... 12 3.4 AANTOONBAARHEIDSGRENS (LOD) EN BEPAALBAARHEIDSGRENS (LOQ) OF RAPPORTERINGSGRENS... 12 3.5 SELECTIVITEIT EN SPECIFICITEIT... 13 3.6 REPRODUCEERBAARHEID (INTER)... 13 3.7 ROBUUSTHEID... 13 3.8 STANDAARDEN HOUDBAARHEID... 13 4 MEETONZEKERHEID... 14 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 6/15

Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation 1 Doel en toepassingsgebied Kwantitatieve bepaling van lasalocid in diervoeders en voormengsels met behulp van een afgeleide HPLCmethode (2009/152/EG). Het gehalte aan lasalocid in diervoeders bedraagt gewoonlijk 75 à 125 mg/kg, in voormengsels gaat het meestal om gehaltes van 10000 mg/kg (1%) of meer. Het werkgebied wordt zo opgesteld dat de courante concentraties probleemloos kunnen gemeten worden en kritische concentraties niet helemaal aan de uitersten van het werkgebied liggen. 2 Analysemethode en analisten I-MET-FLVVT-005, versie 01 t.e.m 04. Het validatieonderzoek werd uitgevoerd onder toezicht van sectieverantwoordelijken A. Fontaine (2001), Mandy Lekens (2005) en Mieke Vanbrabant (2010-2014) door de volgende analisten: Raymond Van Sandt (RVS) Martine Bral (MB) Annemie Voets (AV) Nele Maris (NM) Alle bepalingen gebeurden op HPLC keten 3 en 4. 3 Prestatiekenmerken Ruwe gegevens: Zie bijlage. 3.1 Lineariteit en werkgebied Een ijklijn in solvent werd opgesteld op basis van 9 concentratieniveaus (0,5 1 1,5 2-2,5 5 10 15-20 µg/ml of 5 10 15 20 25 50 100 150 200 mg/kg) (jan. 2005, RVS). De geschiktheid van het lineair model voor de ijklijn werd bewezen aan de hand van het statistisch verwerkingsprogramma Statgraphics (Regressie-analyse). In routine wordt er verder gewerkt met een ijklijn in solvent op basis van 3 concentratieniveaus (0,5 10 20 µg/ml). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 7/15

Het werkgebied wordt gekozen in functie van de meest voorkomende doseringsgehaltes en ligt tussen 5 en 200 mg/kg. Er moet voor gezorgd worden dat de concentratie van het analyt in de monsteroplossing of een verdunning van deze oplossing binnen de grenzen van dit werkgebied valt. 3.2 Precisie Voor de bepaling van de precisie dient de intralaboratoriumreproduceerbaarheid (= intermediate precision) bepaald te worden en indien relevant of vereist, ook de herhaalbaarheid. 3.2.1 Intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSDRw) Voor de bepaling van de intralaboratoriumreproduceerbaarheid werd er volgens de validatieprocedure gebruik gemaakt van controlekaartgegevens. De bekomen %RSD Rw moet lager zijn dan of gelijk aan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz (%RSD Rw max ). 3.2.1.1 Diervoeder midden niveau (10-1000 mg/kg) (M. Vanbrabant, 2014) De intralaboratoriumreproduceerbaarheid werd bepaald aan de hand van controlekaartgegevens (spike 100 mg/kg in diervoeder) tijdens de periode 2010 2014. Resultaat Terugvinding Datum (mg/kg) (%) Uitvoerder 06/05/2010 101,0 101,0 MB 28/06/2010 101,7 101,7 RVS 11/10/2010 99,6 99,6 MB 18/04/2011 98,9 98,9 RVS 01/06/2011 100,0 100,0 MB 12/07/2011 99,8 99,8 MB 25/08/2011 101,6 101,6 AV 09/09/2011 97,7 97,7 AV 29/05/2012 99,1 99,1 AV 06/07/2012 99,9 99,9 MB 26/07/2012 103,5 103,5 NM 04/09/2012 99,1 99,1 AV 11/09/2012 99,0 99,0 AV 04/10/2012 98,0 98,0 AV 04/10/2012 97,9 97,9 AV 04/10/2012 97,7 97,7 AV 04/10/2012 102,3 102,3 AV 04/10/2012 98,3 98,3 AV 04/10/2012 98,5 98,5 AV 04/10/2012 96,6 96,6 AV LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 8/15

09/11/2012 100,0 100,0 MB 20/11/2012 100,4 100,4 MB 03/01/2013 98,8 98,8 AV 08/01/2013 98,0 98,0 MB 29/01/2013 98,8 98,8 MB 13/02/2013 96,2 96,2 AV 26/04/2013 99,4 99,4 MB 03/07/2013 99,7 99,7 AV 12/08/2013 100,4 100,4 AV 17/09/2013 100,2 100,2 MB 23/10/2013 97,8 97,8 AV 12/11/2013 103,2 103,2 AV 26/11/2013 99,8 99,8 AV 21/01/2014 99,0 99,0 AV 24/06/2014 100,6 100,6 AV 14/07/2014 96,2 96,2 AV 30/07/2014 98,0 98,0 AV 25/08/2014 99,8 99,8 NM 16/09/2014 99,7 99,7 AV 29/09/2014 104,1 104,1 MB 06/11/2014 97,2 97,2 AV 27/11/2014 99,6 99,6 AV Aantal = 42 Gemiddelde = 99,4 99,4 STDEV = 1,80 %RSD Rw = 1,81 %RSD Rw max = 8,00 Evaluatie: Voor de matrix dierenvoeder (midden niveau) is de intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz (%RSD Rw max ). De intralaboratoriumreproduceerbaarheid voldoet bijgevolg aan de criteria vermeld in de validatieprocedure. 3.2.2 Herhaalbaarheid (%RSDr ) Voor de bepaling van de herhaalbaarheid werd er volgens de validatieprocedure gebruik gemaakt van (minstens) 6 deelmonsters. De bekomen %RSD r moet lager zijn dan of gelijk aan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz (%RSD r max = %RSD Rw max x 2/3). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 9/15

3.2.2.1 Diervoeder laag niveau ( 10 mg/kg) (M. Lekens, 2005) Uitvoerder Matrix Waarborg (mg/kg) Datum MB Diervoeder 10 (spike) Resultaat (mg/kg) 31/01/2005 9,9 31/01/2005 9,5 31/01/2005 9,9 31/01/2005 8,9 31/01/2005 10,3 31/01/2005 9,9 31/01/2005 10,3 31/01/2005 9,9 Evaluatie: Voor de matrix dierenvoeder (laag niveau) is de herhaalbaarheid (%RSD r ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz (%RSD r max ). De herhaalbaarheid voldoet bijgevolg aan de criteria vermeld in de validatieprocedure. Aantal metingen = 8 Gemiddelde = 9,8 STDEV = 0,45 %RSD r = 4,61 %RSD r max = 7,54 %RSD Rw max = 11,31 3.2.2.2 Diervoeder midden niveau (10-1000 mg/kg) (M. Lekens, 2005) Uitvoerder Matrix Waarborg (mg/kg) Datum RVS Diervoeder 100 (spike) Resultaat (mg/kg) 06/12/2005 101,9 06/12/2005 101,6 06/12/2005 96,8 06/12/2005 101,1 06/12/2005 101,1 06/12/2005 96,5 Evaluatie: Voor de matrix dierenvoeder (midden niveau) is de herhaalbaarheid (%RSD r ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz (%RSD r max ). De herhaalbaarheid voldoet bijgevolg aan de criteria vermeld in de validatieprocedure. Aantal metingen = 6 Gemiddelde = 99,8 STDEV = 2,49 %RSD r = 2,49 %RSD r max = 5,33 %RSD Rw max = 8,00 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 10/15

3.2.2.3 Diervoeder midden niveau (10-1000 mg/kg) (M. Lekens, 2005) Uitvoerder RVS Matrix Diervoeder Waarborg (mg/kg) 125 Datum Resultaat (mg/kg) 06/12/2005 124,3 06/12/2005 122,7 06/12/2005 124,7 06/12/2005 118,1 06/12/2005 130,7 06/12/2005 120,2 Evaluatie: Voor de matrix dierenvoeder (midden niveau) is de herhaalbaarheid (%RSD r ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz (%RSD r max ). De herhaalbaarheid voldoet bijgevolg aan de criteria vermeld in de validatieprocedure. Aantal metingen = 6 Gemiddelde = 123,5 STDEV = 4,35 %RSD r = 3,52 %RSD r max = 5,16 %RSD Rw max = 7,74 3.2.2.4 Diervoeder hoog niveau ( 1000 mg/kg) (A. Fontaine, 2001) Uitvoerder Matrix Waarborg (mg/kg) Datum RVS Diervoeder 10000 (spike) Resultaat (mg/kg) 20/02/2001 9756 20/02/2001 9782 20/02/2001 9732 20/02/2001 9804 20/02/2001 9902 20/02/2001 10399 Evaluatie: Voor de matrix dierenvoeder (hoog niveau) is de herhaalbaarheid (%RSD r ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz (%RSD r max ). De herhaalbaarheid voldoet bijgevolg aan de criteria vermeld in de validatieprocedure. Aantal metingen = 6 Gemiddelde = 9896 STDEV = 253 %RSD r = 2,56 %RSD r max = 2,67 %RSD Rw max = 4,00 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 11/15

3.3 Juistheid en/of terugvinding (M. Vanbrabant, 2014) Bij herhaalde analyses van een monster moet het resultaat liggen tussen 80 en 110% van het belaste gehalte. De terugvinding werd bepaald aan de hand van controlekaartgegevens (spike 100 mg/kg) tijdens de periode 2010 2014. Er werden geen resultaten bekomen die niet voldeden aan de recovery-aanvaardingscriteria en het terugvindingspercentage bedraagt 99,4 %, wat voldoet aan de vooropgestelde voorwaarde. 3.4 Aantoonbaarheidsgrens (LOD) en bepaalbaarheidsgrens (LOQ) of rapporteringsgrens De LOD en LOQ worden berekend op basis van de signaal-ruisverhouding (S/N). Voor de LOD dient S/N 3 te zijn; voor de LOQ is S/N 6. Voor de bepaling van de LOQ werden 8 diervoeders gespiked met een gehalte van 10 mg/kg. De signaal/ruis-verhouding (S/N) bedroeg gemiddeld meer dan 30 en de concentratie bedroeg gemiddeld 9,8 mg/kg. De recovery-waarde bedroeg gemiddeld 98,3 % en de RSD was gelijk aan 4,61 %. Aangezien de verhouding tussen het signaal en de ruis groter dan of gelijk is aan 30 (S/N 30), dienen de bepaalbaarheidsgrens en aantoonbaarheidsgrens niet bepaald te worden (De Ware(n) Chemicus). Dit is geen probleem omdat het gehalte in routinemonsters meestal hoger ligt. We spreken dan ook niet van een bepaalbaarheidsgrens, maar wel van een rapporteringsgrens van 10 mg/kg. Datum 31/01/2005 Uitvoerder MB Waarborg (mg/kg) 10 (spike) 0,000005 Monster Resultaat (mg/kg) Terugvinding (%) 1 9,9 99 2 9,5 95 3 9,9 99 4 8,9 89 5 10,3 103 6 9,9 99 7 10,3 103 8 9,9 99 Gemiddelde = 9,8 98,3 STDEV = 0,45 % RSD = 4,61 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 12/15

3.5 Selectiviteit en specificiteit De piekidentificatie gebeurt aan de hand van de retentietijd en het gebruik van fluorescentiedetectie met een specifieke excitatie- en emissiegolflengte. De piekkwantificatie gebeurt aan de hand van de piekoppervlakte. 3.6 Reproduceerbaarheid (Inter) Er werd nog niet deelgenomen aan ringtesten. In afwachting hiervan werden er intern tweedelijnscontroles uitgevoerd, welke voldeden aan de aanvaardingscriteria. 3.7 Robuustheid Langetermijnsvalidatie wordt uitgevoerd op basis van Shewart-controlekaarten (trendanalyse). 3.8 Standaarden houdbaarheid Om de houdbaarheid van de standaardoplossing na te gaan, werd een standaard stockoplossing 1 maand bewaard bij een temperatuur van 4±4 C, waarna de respons (piekoppervlakte) van de bewaarde oplossing vergeleken werd met deze van een vers bereide oplossing. Aanmaak 20/4/2005 25/05/2005 STD 2 Area Area 872490 729470 869780 728450 867725 726800 Gemiddelde 728240 869998 STDEV 1347,33 2389,99 RSD (%) 0,19 0,27 t-test 9,34627E-08 F-test 0,482320602 De relatieve standaarddeviatie van deze oppervlakken is gering binnen de houdbaarheidstermijn van 1 maand. De afwijking ten opzichte van de vorige STD2-injectie mag maximaal 20% bedragen, maar een dalende trend moet vermeden worden. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 13/15

4 Meetonzekerheid De meetonzekerheid van de methode wordt berekend op 3 niveaus, rekening houdend met de juistheid en precisie. Niveau Concentratie Uitgebreide relatieve (mg/kg) meetonzekerheid U (%) Laag 10 12,0 Midden 10 < - < 1000 9,4 Hoog 1000 9,2 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 14/15

LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 15/15