Biofysische Scheikunde: NMR-Spectroscopie

Transcriptie

1 Relaxatie Relaxatie Vrije Universiteit Brussel 15 mei 2012

2 Relaxatie Outline 1 Relaxatie 2

3 Outline Relaxatie 1 Relaxatie 2

4 Relaxatie Instellen van het Thermisch Evenwicht Zoals eerder vermeld, wordt de evenwichtsverdeling van een verzameling spins bij een gegeven temperatuur bepaald door de Boltzmannverdeling. Wanneer een staal echter voor de eerste keer in het magneetveld geplaatst wordt, of door een RF-puls uit evenwicht is gebracht, duurt het een tijd voor de evenwichtsverdeling (weer) is ingesteld. Experimenteel blijkt dat, wanneer de spins enkel door het extern veld B 0 beïnvloed worden, het populatieverschil en dus de bulkmagnetisatie zich exponentieel instellen: n(t) = n eq (1 exp( t T 1 )) M z = (1 exp( t T 1 ))M z,eq waarin T 1 een karakteristieke tijdscontante is.

5 Rotatie van een Tetrahedraal Molecule (1) De tijd waarin de moleculen over een hoek van gemiddeld 1rad ( 57.3 ) uit elkaar evolueren is de rotatiecorrelatietijd τ c. Op elk tijdstip roteert het molecule rond een bepaalde as aan een bepaalde snelheid. Hieruit kan een rotatiefrequentie ω geëxtrapoleerd worden, zelfs als het molecule door een volgende botsing verstoord wordt en dus zelden of nooit volledige cycli voltooit. Individuele moleculen roteren volgens een chaotisch patroon.

6 Rotatie van een Tetrahedraal Molecule (2) Door uitwisseling van thermische energie hebben de moleculen een bepaalde verdeling van rotatiefrequenties, die beschreven kan worden door de spectrale dichtheidsfunctie J(ω). Een grondige analyse levert de volgende functionele vorm op: J(ω) = 2τ c 1 + ω 2 τ 2 c J(x, 0.2) J(x, 0.4) J(x, 0.8)

7 Relaxatie Invloed van de Rotatie op de Relaxatie De combinatie van het dipoolveld van elke spin met de rotatiebeweging geeft aanleding tot een klein, willekeurig fluctuerend veld B willekeurig. De efficiëntie van de relaxatie wordt bepaald door de gemiddelde sterkte van dit fluctuerende veld ( ), en B 2 willekeurig door het aandeel van de NMR-resonantiefrequentie in de rotatie van de moleculen (J(ω 0 )): 1 = γ 2 B 2 willekeurig J(ω0 ) = ( µ 0 γ Iγ S 2 τ c T 1 4π )2 r 6

8 Relaxatie Rotatie in het Algemeen J(ω 0 ) = τ c wanneer τ c = 1 ω 0, en dit is de tevens de maximale waarde voor J(ω 0 ). Wanneer ω 0 τ c << 1 (snel tuimelende moleculen), geldt J(ω 0 ) 2τ c, en leidt snellere rotatie tot tragere relaxatie. Wanneer ω 0 τ c >> 1 (traag tuimelende moleculen), geldt J(ω 0 ) 2, en leidt snellere ω0 2 τc rotatie tot snellere relaxatie.

9 Rotatiecorrelatietijden Relaxatie Voor min of meer sferische moleculen in waterige oplossing geldt bij kamertemperatuur dat τ c in picoseconden ongeveer gelijk is aan het moleculair gewicht in g/mol. Een disaccharide met M = 360 g mol heeft dus een τ c van 360 ps, en zal in een 500MHz-instrument dus aan de linkerzijde van de voorgaande grafiek liggen. Een klein eiwit met M = g mol heeft een τ c van 20 ns, en zal in de voorgaande grafiek dus aan de rechterzijde liggen. Aangezien J(ω 0 ) zelfs in het "optimale" geval zeer klein is, is de longitudinale relaxatie altijd een relatief inefficiënt en langzaam proces.

10 Praktische Gevolgen Relaxatie Wanneer het staal voor de eerste keer in het instrument geplaatst wordt, moet men dus voldoende lang wachten om de maximale evenwichtsmagnetisatie te bereiken, en dus het maximale signaal te bekomen na de excitatiepuls. Tussen elke herhaling van de puls/observatie-cyclus moet men eveneens voldoende lang wachten om het systeem toe te laten naar evenwicht terug te keren, en zeker te zijn dat elke herhaling van uit dezelfde begintoestand vertrekt. Het is dus van belang om een goed idee te hebben van de grootte van T 1.

11 Het Inversion Recovery-Experiment

12 Relaxatie Het Inversion Recovery-Experiment M z (τ) = M 0 (1 exp( τ T 1 ))

13 Outline Relaxatie 1 Relaxatie 2

14 Principe Relaxatie De wederzijdse verstoring van spins wanneer ze aan de juiste frequentie t.o.v. elkaar roteren heeft twee gevolgen. Enerzijds worden de c α - en c β -componenten herverdeeld, met een lichte voorkeur voor de α-toestand. Dit fenomeen wordt zoals hiervoor beschreven longitudinale relaxatie (of spin/rooster-relaxatie) genoemd, en leidt tot het instellen van het thermisch evenwicht. Anderzijds worden de oriëntaties van de spins op een willekeurige manier gewijzigd, waardoor ze langzaam uit fase geraken. Dit leidt tot een verlies van het transversale signaal, en wordt daarom transversale relaxatie genoemd.

15 Relaxatie Het effect van de defasering door de relaxatie kan beschreven worden als een intrinsieke exponentiële afzwakking van het signaal, met een tijdsconstante T 2 = 1 λ. M x = exp( t T 2 )M 0 cos(ω 0 t) = e λt M 0 cos(ω 0 t) M y = exp( t T 2 )M 0 sin(ω 0 t) = e λt M 0 sin(ω 0 t) Helaas zijn er ook andere fenomenen, zoals chemical exchange en technische imperfecties in B 0 die een gelijkaardig effect op het signaal hebben. Daarom werd een experiment ontworpen om de intrinsieke lijnverbreding te bepalen, onafhankelijk van de technische complicaties.

16 Het Spin Echo-Experiment

17 Relaxatie Het Spin Echo-Experiment De inversiepuls in het midden van het interval 2τ zorgt ervoor dat alle systematische bijdragen tot de defasering gecompenseerd worden, zodat alleen de intrinsieke, willekeurige defasering door de transversale relaxatie overblijft. Zo kan de echte waarde van T 2 in I(2τ) = I(0) exp( 2τ/T 2 ) bepaald worden.

18 Implicaties Relaxatie Bij snel roterende moleculen (korte τ c ) loopt T 2 ongeveer gelijk met T 1. Bij trager roterende moleculen blijft T 2 daarentegen systematisch dalen met stijgende τ c, zodat de transversale relaxatie steeds efficiënter wordt voor trager tuimelende moleculen. De transversale relaxatie is een van de grootste obstakels bij de studie van grote (traag tuimelende) macromoleculen in oplossing.

19 Outline Relaxatie 1 Relaxatie 2

20 Relaxatie Wanneer een van de kernen in een gekoppeld paar geëxciteerd wordt door sterke RF-straling bij zijn resonantiefrequentie, kan dit de intensiteit van het signaal van de tweede, gekoppelde kern beïnvloeden: De invloed van de ene spin op de intensiteit van de andere kan quantitiatief beschreven worden door de verhouding 1 < η = i i 0 i < 1 2

21 Energiediagram Het Overhauser-effect wordt veroorzaakt door niet-radiatieve transities tussen de vier energieniveau s van het spinpaar: Hierbij zijn W 1,I en W 1,S J(ω 0 ), W 2,I/S J(2ω 0 ) en W 0,I/S J(0).

22 Implicaties Relaxatie Als alle andere factoren gelijk blijven, is de grootte van het NOE enkel afhankelijk van de afstand r tussen de betrokken kernen, via de factor r 6. In principe kan het NOE dus gebruikt worden om interatomaire afstande te meten. Meestal zorgen conformationele veranderingen en verschillen in andere factoren ervoor dat het zeer moeilijk is om dit quantitatieve verband volledig uit te buiten. In de praktijk worden NOE s daarom eerder kwalitatief gebruikt, om te bepalen welke atomen in elkaars buurt (minder dan 4 tot 5 Å van elkaar) zitten, en welke niet.

23 Relaxatie Interpretatie van NOE s (1) In een aantal eenvoudige gevallen kunnen NOEfactoren quantitatief geïnterpreteerd worden. Meestal maken dynamische effecten en andere complicaties dit echter onmogelijk.

24 Relaxatie Interpretatie van NOE s (2) NOE s kunnen zeer waardevol zijn bij het bepalen van structurele details en het onderscheiden van isomere structuren.

25 Relaxatie (1) In een eerste benadering voert elke spin zijn precessiebeweging rond de richting van het externe veld uit, zonder zich iets aan te trekken van de bewegingen van het molecule waarin hij zich bevindt. Wanneer twee spins op de juiste manier t.o.v. elkaar bewegen, kunnen ze elkaar beïnvloeden en stralingsloze transities tussen de energieniveau s veroorzaken. Aangezien de hiervoor vereiste frequenties slechts zelden voorkomen, is dit een weinig efficiënt proces.

26 Relaxatie (2) De sporadische interacties zorgen op lange termijn voor relaxatie van de verzameling spins. Tussen de relaxatiecorrecties door vinden er miljarden onverstoorde Larmorcycli plaats. Door de longitudinale relaxatie (met tijdsconstante T 1 ) keert de verzameling spins uiteindelijk steeds terug naar de evenwichtsverdeling, met populatieverschillen bepaald door de Boltzmannverdeling. T 1 kan gemeten worden d.m.v. het inversion recovery-experiment.

27 Relaxatie (3) Door de transversale relaxatie (met tijdsconstante T 2 ) raken de spins geleidelijk aan uit fase in het x,y-vlak, waardoor de transversale component van de magnetisatie afneemt. Dit is een intrinsieke factor die bijdraagt aan de lijnbreedte van NMR-signalen. Andere omstandigheden, zoals een heterogeen extern veld, dragen ook bij tot de finale breedte van de NMR-lijnen. Het spin echo-experiment maakt het mogelijk om de intrinsieke waarde van T 2 te bepalen.

28 Relaxatie (4) Het nucleair Overhauser-effect (NOE) is een complex relaxatiefenomeen, waardoor energie uitgewisseld wordt tussen dipolair gekoppelde kernen die zich (in de ruimtelijke structuur van een molecule) dicht bij elkaar bevinden. Dit effect kan gebruikt worden om interatomaire afstanden quantitatief of kwalitatief in kaart te brengen. Door een reeks experimenten met meerdere RF-pulsen en wachttijden uit te voeren, waarbij de duur van een of meerdere intervals wordt gevarieerd, kan men een multidimensionaal spectrum bekomen.