Standaardadditie Methode. en Interne Standaard Methode. D.Bax

Transcriptie

1 Standaardadditie Methode en Interne Standaard Methode D.Bax Uitgave: Universiteit Utrecht, Faculteit Scheikunde 6e druk (2001) File: SAD01.DOC t/m SAD05.DOC

2 Inhoud Standaardadditie-methode 1. Inleiding 1 2. Matrixeffect 2 3. Eigenschappen en beperkingen van de standaardadditie-methode 5 4. Standaardadditie-methode en vlam AAS 8 5. Standaardadditie-methode en Electrochemische Analysemethoden 9 6. Standaardadditie-methode en Scheidingsmethoden (GC en HPLC) 9 7. Fout in het analyseresultaat bij gebruik van de standaardadditie-methode Voorbeeld van een berekening met de standaardadditie-methode Gebruik van de standaardadditie-methode. Wanneer wel, wanneer niet? 13 Interne standaard methode 1. Inleiding Toepassing van de Interne Standaard methode Opmerkingen over de Interne Standaard Methode Voorbeeld van een ijklijn met gebruik van interne standaard 19 File: SAD01.DOC t/m SAD05.DOC

3 Standaardadditie-methode 1. Inleiding De standaardadditie-methode wordt in de instrumentele analyse op grote schaal toegepast. Het principe van de methode is eenvoudig; toch blijken velen niet goed te begrijpen wanneer de methode moet worden toegepast en, misschien nog belangrijker, wanneer niet. Veel gebruikers zeggen te corrigeren voor het "matrixeffect" zonder een duidelijk inzicht te hebben in wat daarmee bedoeld wordt of te weten waaruit het effect blijkt. Ten onrechte wordt de standaardadditie-methode in de meeste leerboeken slechts terloops behandeld. In een aantal gevallen is het niet goed mogelijk een monster op de "gebruikelijke" wijze met behulp van ijkoplossingen en een ijklijn te analyseren. Een voorbeeld: Bij de AAS-bepaling van lood in benzine zal de benzine ervoor zorgen dat de omstandigheden in de vlam (stoechiometrie en temperatuur) anders zijn dan wanneer een waterige standaardoplossing wordt verstoven. De mate van atomisering zal daardoor bij monster- en standaardoplossing verschillend zijn, hetgeen uiteraard gevolgen voor de gevoeligheid heeft. Het is niet doenlijk voor de standaarden een oplosmiddel te maken dat een samenstelling heeft die gelijk is aan die van benzine. Dit is een voorbeeld waarin de "omgeving" van de te bepalen component een belangrijke invloed heeft op het analyse resultaat. Deze omgeving noemen we de matrix en het beschreven effect heet het matrixeffect. In vrijwel alle gevallen is de matrix van monster en standaard verschillend. Er is dan dus sprake van een matrixeffect. Vaak is de invloed van het matrixeffect op het analyseresultaat niet significant. Soms is dat wel het geval, dan spreken we van een relevant matrixeffect. In het volgende zal uiteengezet worden wat een relevant matrixeffect is en hoe daarvoor kan worden gecorrigeerd. 1

4 2. Matrixeffect In de analytische chemie geldt algemeen dat een signaal evenredig is met de concentratie, in formule: Signaal = k concentratie (1) Hierin is k de helling in de ijklijn of, per definitie, de gevoeligheid van de analyse. De gevoeligheid is dus de verandering in signaal bij veranderende concentratie. In formule: gevoeligheid = ds/dc. Deze definitie geldt voor alle vormen van analyse. Het begrip gevoeligheid moet vooral niet verward worden met het begrip "detectie limiet". De definitie daarvan is een geheel andere, ook de dimensie is anders. Indien de gevoeligheid (k) waarmee monster en standaard worden geanalyseerd niet dezelfde is, hebben we te maken met een relevant matrixeffect. Indien verwacht mag worden dat de matrix van de monsteroplossing invloed heeft op het te meten signaal (door middel van k) dan kan voor dit "matrixeffect" gecorrigeerd worden door ervoor te zorgen dat de matrix van alle te meten oplossingen zo goed mogelijk gelijk is. Dit wordt bereikt bij de zogenaamde standaardadditie-methode. Deze methode kan alleen toegepast worden als aan twee voorwaarden voldaan is: I Er moet een lineair verband zijn tussen het signaal en de concentratie van het analyt. II Andere componenten dan het analyt mogen niet (zelfstandig) aan het signaal bijdragen. (Deze componenten leveren uiteraard wel een bijdrage aan de matrix.) Voorwaarde II kan als volgt worden toegelicht: Bij de spectrofotometrische bepaling van een rood complex, [Fe(CNS)] 2+ mag de oplossing niet van zichzelf al rood gekleurd zijn door een andere kleurstof. Een spectrofotometer is niet zonder meer in staat onderscheid te maken tussen de rode kleur afkomstig van het complex en de kleuring afkomstig van de andere kleurstof. De standaardadditie-methode kan daarvoor ook niet corrigeren. Het is vaak wel mogelijk op een andere manier voor dit 2

5 soort bijdragen te corrigeren. In het voorbeeld kan de extinctie van de storende kleurstof afzonderlijk gemeten worden. De extinctie van het mengsel kan dus gecorrigeerd worden voor de bijdrage van de storende kleurstof. In de eenvoudigste vorm (methode A) vereist de standaardadditie-methode de meting van slechts twee oplossingen. De te meten oplossingen zouden bijvoorbeeld als volgt samengesteld kunnen zijn: 1. 25,0 ml monsteroplossing + water tot 50,0 ml, 2. 25,0 ml monsteroplossing + 10,0 ml waterige standaardoplossing + water tot 50,0 ml. De matrix in beide oplossingen is nu bij benadering dezelfde. De concentratie in oplossing 1 noemen we C x, die in oplossing 2 is dan C x + δc s, waarbij δc s de toename in de concentratie door toevoeging van de standaard is. Volgens voorwaarde I geldt voor het signaal verkregen met oplossing 1: S x = k C x en voor het signaal van oplossing 2: S t = k (C x + δc s ). Eliminatie van k uit deze twee vergelijkingen geeft: C x Sx = δ C s (2) (S S ) De concentratie in de monsteroplossing (die werd immers 1:1 verdund) is dus 2 C x. De waarde van C x in oplossing 1 kan ook langs grafische weg gevonden worden, zie Fig. 1. Daarbij wordt gebruik gemaakt van het gegeven dat bij analytconcentratie = 0 het signaal ook gelijk is aan 0. Door extrapolatie naar signaal = 0, wordt het nulpunt van de C-as bepaald. t x Fig. 1. IJklijn met één additie van de standaard. Deze additie moet leiden tot ongeveer een verdubbeling van de onbekende concentratie (methode A). Voor de eigenschappen en beperkingen van methode A, zie 3. De eenheden zijn willekeurig gekozen. 3

6 Een andere uitvoeringsvorm van de standaardadditie-methode (methode B) is die waarbij bovenstaande eenvoudigste vorm wordt gecombineerd met de methode die gebruik maakt van ijkoplossingen. In dat geval zou een reeks meetoplossingen (monsteroplossing + standaardoplossing) er bijvoorbeeld als volgt uit kunnen zien: 1. 25,0 ml monsteroplossing + water tot 100,0 ml, 2. 25,0 ml monster + 5,0 ml waterige standaard + water tot 100,0 ml, 3. 25,0 ml monster + 10,0 ml waterige standaard + water tot 100,0 ml, 4. 25,0 ml monster + 15,0 ml waterige standaard + water tot 100,0 ml, 5. 25,0 ml monster + 20,0 ml waterige standaard + water tot 100,0 ml. Voor de berekening wordt nu de lineaire kleinste kwadraten methode toegepast. Deze leidt tot de formule: S i = m δc i + b (3) hierin is S i het signaal afkomstig van oplossing "i", δc i de bijbehorende verandering in de concentratie ten gevolge van de toevoeging van de standaardoplossing, m de richtingscoëfficiënt en b het intercept met de S-as. De resultaten zijn grafisch weergegeven in Fig. 2. Fig. 2. IJklijn met meerdere addities van de standaard. De grootste additie moet tot ongeveer een verdubbeling leiden van de onbekende concentratie (methode B). Voor verdere uitwerking en getallen, zie 8. De eenheden zijn willekeurig gekozen. 4

7 Bij benadering zal b gelijk zijn aan S x, het signaal verkregen van de oplossing waaraan geen standaardoplossing is toegevoegd (hier oplossing 1). S x en b zijn beide benaderingen van een "juiste" waarde, dat is die waarde die men zou vinden als men de meting zeer vaak zou uitvoeren. Omdat b uit meerdere metingen volgt, is b een betere benadering van de "juiste" waarde dan S x. De concentratie van oplossing 1, C x volgt nu uit de formule (zie ook fig. 2): C b m x = (4) De concentratie in de monsteroplossing (1:4 verdund) is dus 4 C x. 3. Eigenschappen en beperkingen van de standaardadditie-methode De standaardadditie-methode is een methode om de concentratie van het analyt te benaderen. Als vuistregel geldt dat de standaardadditie-methode alleen een betrouwbaarder resultaat zal opleveren dan een klassieke ijklijn indien verwacht kan worden dat de factor k, dat is de gevoeligheid van de analyse (of de helling in de ijklijn), voor monster en standaard meer dan ca. 10% van elkaar verschillen (voor voorbeelden zie 4 t/m 6). Daarnaast moet aan de eerder genoemde voorwaarden I en II geheel voldaan zijn. Bij de standaardadditie-methode wordt het analyseresultaat verkregen door extrapolatie van de ijklijn, terwijl bij de klassieke ijklijn methode het analyseresultaat wordt verkregen door interpolatie van de ijklijn. Interpolatie verloopt vaak nauwkeuriger dan extrapolatie. Indien de klassieke ijklijn de "juiste" is, levert die een veel nauwkeuriger analyseresultaat. Daar komt bij dat er geen bezwaar is tegen kromming van een klassieke ijklijn, mits de gevoeligheid (dat is de helling) in het gebruikte stuk van de ijklijn niet te klein is. Bij de standaardadditie-methode is een rechte ijklijn vereist. Methode A is uiteraard minder bewerkelijk dan methode B. Terwille van de nauwkeurigheid is het wel gewenst bij beide concentraties meerdere metingen uit te voeren. Methode B geeft enige controle op de veronderstelling (volgens voorwaarde I) dat er een lineair verband is tussen C en S. Een (relatief) groot verschil tussen b en S x 5

8 kan veroorzaakt worden door een gekromde ijklijn. Bekeken moet dan worden of voorwaarde I nog wel opgaat. Soms is niet geheel voldaan aan voorwaarde I (lineair verband tussen C en S), maar is men toch gedwongen de standaardadditie-methode te gebruiken. De afwijking door het niet geheel voldaan zijn aan voorwaarde I moet dan zoveel mogelijk beperkt blijven. Hiervoor zijn de volgende twee oplossingen: 1. De afwijking in het analyseresultaat die ontstaat door een gekromde ijklijn kan enigszins worden beperkt door de concentraties in de oplossingen zo laag mogelijk te houden. De kromming in een ijklijn neemt meestal toe met toenemende concentratie. Door de concentratie van het monster, door verdunning, zo laag mogelijk te maken, wordt een zo recht mogelijke ijklijn verkregen. Hierbij worden ook de matrixeffecten verminderd. Indien de ijklijn een neerwaartse kromming vertoont zal dit bij standaardadditie leiden tot een te hoog analyseresultaat. 2. Stel: Berekening levert hier voor de beste ijklijn y = a 2 x 2 + a 1 x + a 0. Krom extrapoleren van de ijklijn is nimmer toegestaan, omdat men niet weet wat de mate van kromming is bij lagere concentraties. De kromming in een ijklijn neemt meestal toe met toenemende concentratie. Daarom kan men eventueel (door berekening of grafisch) de helling bij δc = 0 (of x = 0) bepalen en vanuit dit intercept de kromme recht met de gevonden helling naar S i = 0 (of y = 0) extrapoleren. De richtingscoëfficiënt bij x = 0 is dan a 1, de vergelijking van de geëxtrapoleerde rechte: y = a 1 x + a 0. Het intercept met de x-as ligt bij x = -a 0 /a 1. Over de fout die men zo maakt valt weinig te zeggen. De werkwijze wordt geïllustreerd in Fig. 3. 6

9 Fig. 3. Het recht extrapoleren van een kromme ijklijn leidt tot onvoorspelbaar grote fouten. De eenheden zijn willekeurig gekozen. Indien men ervoor zorgt dat het volume van de monsteroplossing (zeer) groot is ten opzichte van het volume van de toegevoegde standaard, kan men volstaan met monsteroplossing en standaardoplossing; in dat geval hoeft geen water te worden toegevoegd om een constant eindvolume te verkrijgen. De concentratie van de standaardoplossing zal dan veel hoger moeten zijn dan die van de monsteroplossing om de gewenste δc te kunnen realiseren. Met name wanneer het signaal tengevolge van de verdunning te klein wordt zal deze werkwijze van belang zijn. De bovengenoemde parameters C, S, m en b zijn niet dimensieloos. Het is zinvol gangbare concentratie-eenheden voor C en δc, bij voorkeur [mg l -1 ], te gebruiken. Voor het signaal kunnen willekeurige maar gemakkelijk meetbare eenheden worden gehanteerd, die eenheden vallen toch weg bij de berekening van de onbekende concentratie. C x komt dan in dezelfde eenheden als C en δc uit de berekening zodat gemakkelijk voor verdunning is te corrigeren. Het is verstandig de dimensies in de berekening mee te nemen, dit voorkomt fouten. Een rekenvoorbeeld is gegeven in 8. De formules (2) en (4) geven de concentratie van oplossing 1 (geen standaard geaddeerd) uit de additiereeks. Als regel moet de concentratie van de monsteroplossing nog daaruit berekend worden. 7

10 4. Standaardadditie-methode en vlam-aas Bij vlam-aas geldt de wet van Lambert Beer: A= ε b c vlam (5) waarin A = extinctie, ε = extinctiecoëfficiënt, b de lengte van de lichtweg door de vlam en c vlam is de concentratie van de analytatomen in de vlam. Als regel nemen we aan dat c vlam een vaste fractie is van de concentratie in de oplossing. Dat hoeft niet altijd het geval te zijn. Het verband tussen de concentratie in de vlam en die in de oplossing is: c vlam = f c oplossing (6) waarin f de verhouding tussen de concentraties van het analyt in de oplossing en in de vlam. De helling k in de ijklijn is dus gelijk aan: k = ε b f (7) De factor f is ondermeer afhankelijk van de opzuigsnelheid van het monster en van de efficiëntie van de verstuiver. De factor f is voor verdunde waterige oplossingen en bij één apparaat een constante. Dat is niet het geval bv. indien de analytoplossing, ten gevolge van veel opgeloste zouten, een andere viscositeit heeft dan de standaardoplossing. Ook bij niet-waterige oplossingen zal de waarde van f anders zijn dan bij waterige oplossingen. Als vuistregel geldt voor waterige oplossingen met een beladingsgraad tot maximaal 1 à 2% dat f constant verondersteld wordt. De beladingsgraad is het percentage nietwaterige componenten in de waterige oplossing. In beginsel is het daarom raadzaam de beladingsgraad (ruim) onder de 1 à 2 % te houden. 8

11 De ijklijn bij AAS is slechts in uitzonderingsgevallen volledig recht. Het toepassen van de standaardadditie-methode, zonder dat daartoe de noodzaak bestaat leidt derhalve tot grote fouten. De kromming van ijklijnen bij AAS is vrijwel altijd neerwaarts. Het resultaat van een analyse met de standaardadditie-methode zal in dat geval leiden tot een te hoog resultaat. 5. Standaardadditie en Elektrochemische Analysemethoden Bij de polarografie wordt gebruikt gemaakt van het feit dat er een zogenaamde grensstroom bestaat die evenredig is met de concentratie van het analyt (I grens = k Concentratie). De evenredigheidsfactor k, dat is de helling in de ijklijn is ondermeer afhankelijk van de diffusiecoëfficiënt van het analyt in de te analyseren oplossing. Deze diffusiecoëfficiënt is in oplossingen met verschillende samenstelling als regel niet gelijk. In dit geval zal dus in principe altijd de standaardadditie-methode gebruikt moeten worden. In hoeverre dat in de praktijk ook noodzakelijk is, hangt sterk af van de aard van het te analyseren monster. In geval van twijfel kan de helling in de ijklijn en de standaardadditie-ijklijn experimenteel bepaald worden en vergeleken. Indien het verschil kleiner is dan ca. 10% (zie 3.), verdient de ijklijnmethode de voorkeur. Coulometrie is een absolute analysemethode, het verband tussen de gepasseerde lading Q en de hoeveelheid omgezette stof m is exact bekend door de wet van Faraday. Er is geen ijklijn nodig en het gebruik van de standaardadditie-methode is in dit geval dus nooit nodig. 6. Standaardadditie en Scheidingsmethoden Bij scheidingsmethoden (GC en HPLC) wordt het analyt gescheiden van de matrix. De helling in de ijklijn kan derhalve nooit door de matrix worden beïnvloed. De standaardadditie-methode mag dus ook nooit gebruikt worden. 9

12 7. Fout in het analyseresultaat bij gebruik van de standaardadditiemethode De fout in de richtingscoëfficiënt m van de ijklijn zal een grotere absolute fout in het analyseresultaat C x veroorzaken naarmate C x verder uit het zwaartepunt van de meetwaarden wordt gemeten. Fig. 5 op blz. 11 toont hiervan een extreem voorbeeld. De absolute fout in het intercept met de S-as, b is onafhankelijk van de afstand tot het zwaartepunt van de meetwaarden. De relatieve fout in b wordt uiteraard groter naarmate b kleiner is (Fig. 4). In de praktijk blijkt dat een goede nauwkeurigheid wordt verkregen indien op de volgende wijze wordt gehandeld: Bij methode A moet de additie leiden tot ongeveer een verdubbeling van de concentratie; bij methode B moeten de oplossingen waaraan de standaardoplossing is toegevoegd bijvoorbeeld 130, 160, 190 en 220% bevatten van de oplossing waaraan geen standaard is toegevoegd. De addities mogen dus niet te klein (minder dan ca. 30%) en niet te groot (veel meer dan ca. 100%) zijn in vergelijking met de onbekende concentratie. Dit betekent dat standaardadditie alleen succesvol kan verlopen als een schatting van de te meten concentratie mogelijk is. Het effect van te grote resp. te kleine addities wordt in Fig. 4 en 5 (blz. 11) geïllustreerd. Fig. 1 en 2 (blz. 3 en 4) tonen de juiste addities. De fout in het analyseresultaat (het snijpunt met de C-as) volgt uit de berekening van de ijklijn met de lineaire kleinste kwadraten methode. Deze methode is in de literatuur uitvoerig beschreven. Een rekenvoorbeeld is uitgewerkt in 8 en 9. 10

13 Fig. 4. IJklijn bij standaardadditiemethode volgens methode B; met te grote addities (kleine fout in de richtingscoëfficiënt m, maar grote relatieve fout in het intercept b). De eenheden zijn willekeurig gekozen. Fig. 5. IJkijn bij standaardadditiemethode volgens methode B; bij te kleine addities, (kleine fout in het intercept b, maar grote fout in de richtingscoëfficiënt m). De eenheden zijn willekeurig gekozen. 11

14 8. Voorbeeld van een berekening met de standaardadditie-methode Gegeven is: Bij de meetreeks beschreven in 2. (blz.4) werd een standaard gebruikt van 20 mg l - 1. De daarmee berekende waarden voor δc zijn weergegeven in Tabel I. Bij de analyse werden de meetresultaten (S) verkregen uit Tabel I: TABEL I Oplossingnr. Geaddeerde concentratie (δc) [mg l -1 ] Verkregen signaal (S) bv: [cm] Deze resultaten zijn ook in grafiek weergegeven in Fig. 2. Berekening met hulp van de lineaire kleinste kwadraten methode leert dat de formule voor de ijklijn S = 1,07 δc + 4,10 is. De richtingscoëfficiënt van de ijklijn is dus m = 1,07 [cm l mg -1 ] en het snijpunt met de S-as is b = 4,10 [cm]. De concentratie in oplossing 1 is 4,10/1,07 = 3,83 mg l -1. De monsteroplossing (1:4 verdund) bevat dus 4 x 3,83 = 15,3 mg l -1. Uit de berekening met de lineaire kleinste kwadraten methode (zie 9.) blijkt tevens dat de concentraties van oplossing 1 en de monsteroplossing met 95% zekerheid liggen tussen resp. 3,2-4,5 en 12,6-18,0 mg l

15 9. Gebruik van de standaardadditie-methode, Wanneer wel, wanneer niet? Een voorbeeld Standaardadditie-methode Een gemeente heeft een perceel grond waarop vroeger een bedrijf heeft gestaan dat metalen voorwerpen van een cadmiumlaag voorzag. In het verleden was men nog niet zo erg milieubewust en het terrein is mogelijk vervuild met cadmium en andere metalen. De gemeente wil het perceel benutten voor woningbouw en daarom moet onderzocht worden of het gesaneerd moet worden. De kosten van de sanering bedragen circa f ,-. De gemeente neemt een analysebureau in de arm om een goed onderbouwde beslissing te kunnen nemen. Het analysebureau onderzoekt het perceel en besluit monsters te nemen van het grondwater. Deze monsters zullen met AAS geanalyseerd worden om het gehalte aan cadmium en eventuele andere metalen te bepalen. Er moet nu beslist worden of de monsters met een klassieke ijklijn of met de standaardadditie-methode zullen worden bepaald. Het gebruik van de standaardadditie-methode betekent ongeveer twee keer zo veel werk en dus aanzienlijk hogere kosten. Gezien de bedragen, die met de sanering resp. de keuze van de analysemethode gemoeid zijn, is het van groot belang de beslissing op rationele gronden te nemen. Uiteraard kan het analysebureau, als dat nodig of gewenst is, inleidende metingen doen om een beslissing te onderbouwen. Als de enig mogelijke analysemethode AAS is, welke werkwijze zou u volgen als projectleider/werknemer van het analysebureau? 13

16 ANTWOORD op: Gebruik van de standaardadditie-methode Wanneer wel, wanneer niet? Een voorbeeld Het antwoord hangt samen met de gevoeligheid waarmee de analytische bepaling wordt uitgevoerd. Daarom volgt hier de definitie ervan. De gevoeligheid G van een analysemethode is de verandering van het signaal S met de concentratie c, in formule: G = ds/dc. Grafisch is de gevoeligheid van een bepaling gelijk aan de richtingscoëfficiënt van de ijklijn. Het begrip gevoeligheid van een analytische bepaling is niet afhankelijk van de aard van de gebruikte analysemethode. N.B. Gevoeligheid en detectielimiet zijn twee zeer verschillende begrippen. Ook de dimensies ervan zijn ongelijk. De bepalingen kunnen worden uitgevoerd met een klassieke ijklijn als de gevoeligheid, waarmee standaarden en monsters worden geanalyseerd, dezelfde is. Nagegaan moet worden in hoeverre dit het geval is. Alle monsters werden genomen van één perceel grond. Ze bestaan allen uit grondwater en men mag aannemen dat de gevoeligheid, waarmee ze gemeten worden, ongeveer dezelfde is, zie ook Noot. De concentraties kunnen uiteraard variëren van monster tot monster. We nemen daarom een representatieve steekproef uit de monsters, zeg 50 stuks. Daarvan bepalen we met welke gevoeligheid ze gemeten kunnen worden. Dit kan alléén met de standaardadditie-methode. Daarnaast bepalen we met welke gevoeligheid de standaarden gemeten kunnen worden. Dit kan door de klassieke ijklijn op te nemen. We vergelijken vervolgens de gemiddelde gevoeligheid waarmee de monsters werden gemeten, met de gevoeligheid waarmee de standaarden werden gemeten. Omdat de standaardadditie-methode zelf een benaderingsmethode is, waardoor een fout wordt geïntroduceerd, is een verschil van <ca.10% geen reden om de standaardadditie-methode te gebruiken. Is het verschil >ca.10% dan wordt het noodzakelijk de laatste methode te gebruiken. Noot: Zou blijken dat de gevoeligheid waarmee de 50 monsters gemeten worden een spreiding vertoont >10%, dan zullen alle monsters moeten worden bepaald met de standaardadditie-methode. Welke spreiding in de gevoeligheid of welk verschil in gevoeligheid acceptabel (hier als voorbeeld beiden 10%) is, hangt af van de gewenste en haalbare nauwkeurigheid van de bepaling (bovengrens) en van de fout die door het gebruik van standaardadditie als benaderingsmethode wordt geïntroduceerd (ondergrens). Het is niet goed mogelijk hiervoor een harde grens te geven. De fout bij de standaardadditie-methode is afhankelijk van de kwaliteit van elk afzonderlijk punt (spreiding van duplo s, dit levert een gewichtsfactor), de lineariteit en de correlatiecoëfficiënt van de ijklijn en van de grootte van de addities in relatie tot de onbekende concentratie. Bij gelijke gewichtsfactoren van de punten levert het programma POWERFIT een goede benadering van deze fout. N.B. De correlatiecoëfficiënt van een ijklijn zegt niets over de lineariteit (rechtlijnigheid) ervan. 14

17 Interne Standaard Methode Standaardadditie-methode 1. Inleiding Bij de standaardadditie-methode werd gecorrigeerd voor "afwijkend" gedrag van het monster. Soms is het ook nodig te corrigeren voor instrumentele effecten of effecten veroorzaakt door de analist. In dat geval kan de "Interne Standaard Methode" van pas komen. Omdat de behandelde effecten geheel anders zijn, worden andere symbolen gebruikt dan bij de standaardadditie-methode. In de analytische chemie geldt voor vrijwel elke methode dat het signaal recht evenredig is met de concentratie. In formule: S 1 = p 1 C 1 (1) waarin S 1 het signaal, C 1 de concentratie en p 1 de evenredigheidsfactor. Indien p 1 voor één stof bij een bepaalde concentratie constant is, dan is het voldoende een "normale" ijklijn te maken en met behulp van die ijklijn de onbekende concentratie te bepalen. Soms is p 1 niet constant, bv. omdat het gemeten monstervolume niet constant is of omdat de detector een langzaam verlopende respons vertoont. In dat geval kan de "interne standaard methode" een oplossing bieden. Een injectiespuit zoals die bij gaschromatografische injecties gebruikt wordt, is in feite een nogal primitief instrument. Bij dergelijke spuiten voor volumes van µl bestaat de "zuiger" (plunjer) uit een draad, die in een buis (glas of roestvast stalen injectienaald) op en neer kan bewegen. Lekkage langs de plunjer is bij zulke spuiten niet geheel te voorkomen. De mate van lekkage is ondermeer afhankelijk van de snelheid waarmee de plunjer wordt ingedrukt. Voorts is het moeilijk te voorkomen dat het geïnjecteerde monster gasbelletjes bevat. Controle op de aanwezigheid van gasbelletjes is vaak niet goed mogelijk omdat het monster niet zichtbaar is. Conclusie: Het met dit type injectiespuit geïnjecteerde volume is niet geheel reproduceerbaar. 15

18 De meest gebruikte gaschromatografische detectoren (FID en katharometer) geven een zeer constante detectorrespons. De respons van de electron capture detector (ECD) kan langzaam verlopen (drift vertonen). Dit verloop heeft invloed op de waarde van p Toepassing van de Interne Standaard Methode. Bij de gaschromatografie is p 1 een functie van het injectievolume V en de detectorrespons D 1, p is de evenredigheidsfactor. Voor p 1 van de analyt kan dus geschreven worden: p 1 = p V D 1 (2) Correctie voor variaties in V en D 1 kan eenvoudig worden verkregen door gebruik van de "interne standaard methode". Bij de interne standaard methode wordt aan het monster een bekende hoeveelheid zogenaamde "interne standaard" toegevoegd. De hoeveelheid interne standaard moet ongeveer even groot zijn als die van de analyt. De interne standaard wordt bij voorkeur zo gekozen dat de retentietijden van analyt en interne standaard zoveel mogelijk overeenkomen, zonder dat overlap in het chromatogram optreedt. De interne standaard ondergaat alle bewerkingen van het monster, wordt op dezelfde wijze geïnjecteerd en wordt onder dezelfde omstandigheden gechromatografeerd. Verliezen, variaties in het injectievolume, in de temperatuur van de kolom en langzaam verloop in het detectorsignaal werken op dezelfde wijze door in de analytpiek en in de piek van de interne standaard. Voor de interne standaard geldt derhalve, analoog aan 16

19 vergelijking (1) en (2): en: S 2 = p 2 C 2 (3) p 2 = p V D 2 (4) Voor de verhouding S 1 /S 2 geldt: S S 1 2 p = p C C (5) Invullen van de formules (2) en (4) voor p 1 en p 2 levert: S S 1 2 p V D1 C1 = p V D2 C2 (6) Voor zover D 1 /D 2 constant is, wordt verg.(6) gereduceerd tot: S S 1 2 p C * = C 1 2 (7) waarin p * = D 1 /D 2 onafhankelijk is van het injectievolume. Als voldaan is aan de voorwaarde dat er een lineaire detectorrespons 1 is of eventueel een langzaam verloop in de detectorrespons (d.w.z. tijdens één chromatogram moet de detectorrespons constant zijn) geldt dat D 1 /D 2 ook onafhankelijk is van de detectorrespons. Snelle variaties in de respons zijn er de oorzaak van dat D 1 /D 2 niet constant is. In dat geval werkt de interne standaard methode niet. 1 Er is sprake van lineaire detectorrespons als het verband tussen detectorsignaal en monstergrootte recht evenredig is. Bij een overladen detector is geen sprake van lineaire detectorrespons. 17

20 Bij de interne standaard methode wordt S 1 /S 2 uitgezet tegen C 1 /C 2. De zo verkregen lijn kan gebruikt worden als ijklijn (Fig. 1). Bij de bepaling van een onbekend monster wordt S 1 /S 2 bepaald. Daaruit volgt een waarde voor C 1 /C 2. Aangezien C 2 bekend is, valt C 1 te berekenen. N.B. C 2 hoeft niet bekend te zijn als C 2 in monster en standaard gelijk is. S 1 /S 2 Fig. 1. IJklijn bij de interne standaard methode C 1 /C 2 3. Opmerkingen over de Interne Standaard Methode. Indien er geen reden is langzaam verloop in de detectie en/of variatie in het injectievolume te veronderstellen, is er ook geen reden de interne standaard methode te gebruiken. Bij HPLC wordt gebruik gemaakt van een "injectieloop". Dit is een capillaire buis met een nauwkeurig bekend volume, die in de toevoerleiding naar de chromatografiekolom kan worden opgenomen. Daarmee is een zeer constant injectievolume gegarandeerd. De detector van een HPLC, vaak een UV-spectrofotometer, vertoont, na een opwarmtijd, zeer weinig langzaam verloop. In dat geval zal de interne standaard methode dan ook geen verbetering brengen. Een interne standaard kan ook gebruikt worden indien er onzekerheid bestaat of analyt gedurende een opwerkprocedure, bijvoorbeeld: door extractie of door verlies bij filtratie, verloren gaat. De interne standaard ondergaat precies dezelfde bewerkingen als de analyt. Indien van de interne standaard een zeker percentage verloren gaat, wordt ervan uitgegaan dat hetzelfde percentage van de analyt verloren is gegaan. Resumerend: 18

21 De voordelen van de interne standaardmethode bv. bij gaschromatografie zijn de volgende: 1. De methode is ongevoelig voor langzame veranderingen in de detectorrespons. Tijdens één chromatogram moet de detectorrespons constant zijn. 2. Het injectievolume is niet kritisch en behoeft niet nauwkeurig gemeten te worden. 3. Wanneer de interne standaard is toegevoegd, verandert er door verspilling en/of verdamping van het oplosmiddel niets meer in de uitkomst van de kwantitatieve bepaling. 4. Voorbeeld van een ijklijn met gebruik van interne standaard De reeks oplossingen voor een ijklijn met gebruik van interne standaard zou er als volgt uit kunnen zien: 1. 1,00 ml standaardoplossing + 1,00 ml interne standaard + oplosmiddel tot 25,00 ml 2. 2,00 ml standaardoplossing + 1,00 ml interne standaard + oplosmiddel tot 25,00 ml 3. 3,00 ml standaardoplossing + 1,00 ml interne standaard + oplosmiddel tot 25,00 ml 4. 4,00 ml standaardoplossing + 1,00 ml interne standaard + oplosmiddel tot 25,00 ml 5. 5,00 ml standaardoplossing + 1,00 ml interne standaard + oplosmiddel tot 25,00 ml De oplossing met 0 ml standaardoplossing hoort natuurlijk ook in deze reeks thuis. Voor deze oplossing geldt C 1 /C 2 =0 en S 1 = 0, dit levert het punt (0,0) in de ijklijn. Dit punt hoeft niet gemeten te worden. C 1 = concentratie van de standaard, C 2 = concentratie van de interne standaard, S 1 = signaal van de standaard en S 2 = signaal van de interne standaard. Na meting van de ijklijn zijn S 1, S 2, C 1, en C 2 van alle punten bekend en kan de ijklijn volgens fig. 1 worden opgesteld. De monsteroplossing zou er als volgt uit kunnen zien: 5,00 ml monsteroplossing + 1,00 ml interne standaard + oplosmiddel tot 25,00 ml. Na meting van de monsteroplossing zijn S 1, S 2 en C 2 bekend en dus kan met de hulp van de ijklijn C 1 worden berekend. 19