VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION

VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Goedgekeurd door Approuvée par I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van choline in specifieke levensmiddelen Détermination quantitative de choline dans denrées alimentaires spécifiques Spectrofotometrie Spectrophotométrie Specifieke levensmiddelen (Zuigelingenmelk en voedingssupplementen) Denrées alimentaires spécifiques (Aliments pour bébé, lait en poudre et suppléments alimentaires) Totaal Totale Secundair Secondaire Mini-validatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie Handtekeningen - Signatures: toevoegingsmiddelen (get.) Datum - Date: 2012-10-01 Naam Nom: Mandy Lekens Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Labomanager (get.) Datum - Date: 2012-10-04 LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 1/12

Stap Phase 1: Bepaling van het toepassingsgebied Déterminer le champs d application De methode moet geschikt zijn voor de kwantitatieve bepaling van choline, ook wel vitamine B4 genoemd, in voedingssupplementen en zuigelingenmelk. Het gehalte aan choline in voedingssupplementen bedraagt gewoonlijk 250 tot 500 mg per dagelijkse dosis, het gehalte in zuigelingenmelk bedraagt gewoonlijk 50 tot 100 mg/100 g. Het werkgebied zal zo opgesteld worden dat de courante concentraties voor beide matrices probleemloos kunnen gemeten worden en kritische concentraties niet helemaal aan de uitersten van het werkgebied liggen. Stap Phase 2: Doel en statuut van de analysemethode Le but et status de la méthode d analyse Kwantitatieve bevestigingsmethode, afgeleide methode gebaseerd op AOAC methode 999.14 (Choline in zuigelingenmelk en melk). [Rader et al., Journal of AOAC INTERNATIONAL, Vol. 87, No. 6, 2004 (1297-1304)] Stap Phase 3: Keuze validatieparameters Choisir les paramètres à valider Voor deze methode worden de volgende prestatiekenmerken bepaald: lineariteit en werkgebied, bepaalbaarheidsgrens (rapporteringsgrens) en aantoonbaarheidsgrens, specificiteit en selectiviteit, juistheid en terugvinding, precisie, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid (intra-) en robuustheid. Stap Phase 4: Externe eisen voor validatieparameters Des exigences externes pour les paramètres à valider Nvt. Stap Phase 5: Keuze van de monsters Le choix d échantillons In de eerste plaats gecertificeerd referentiemateriaal dat een grote gelijkenis met praktijkmonsters vertoont: NIST Standard Reference Material (SRM) Infant/Adult Nutritional Formula (SRM 1849a) en Multivitamin tablets (SRM 3280). Indien er geen referentiemateriaal beschikbaar is, zal de geschiktheid van de methode getest worden op routinemonsters en geaddeerde praktijkmonsters. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 2/12

VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaption I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van choline in specifieke levensmiddelen Détermination quantitative de choline dans denrées alimentaires spécifiques Spectrofotometrie Spectrophotométrie Specifieke levensmiddelen (Zuigelingenmelk en voedingssupplementen) Denrées alimentaires spécifiques (Aliments pour bébé, lait en poudre et suppléments alimentaires) 2014-01-21 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 3/12

Overzicht van de prestatiekenmerken: o Zie paragraaf 3 De validatie voldoet aan procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: o Zie paragraaf 3.2 en 3.3 (zowel juistheid als precisie bepaald op minstens 1 niveau) Historiek validatie Versie Herziening datum/door Reden van herziening Wijzigingen 01 10/2013, M. Vanbrabant Opsteller initiële versie Volledige tekst 02 01/2014, M. Vanbrabant NC interne audit 2013/04, B35 Toevoegen inhoudsopgave, gegevens terugvinding en precisie voor voedingssupplement LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/12

VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par I-MET-FLVVT-153 Kwantitatieve bepaling van choline in specifieke levensmiddelen Détermination quantitative de choline dans denrées alimentaires spécifiques Spectrofotometrie Spectrophotométrie Specifieke levensmiddelen (Zuigelingenmelk en voedingssupplementen) Denrées alimentaires spécifiques (Aliments pour bébé, lait en poudre et suppléments alimentaires) Totaal Totale Secundair Secondaire Mini-validatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie Handtekeningen - Signatures: toevoegingsmiddelen (get. Datum - Date: 2013-10-30 Johan Vandenbempt : laborant Jean-Pierre De Lannoy : laborant Start - Début: 10-2012 Einde - Fin: 10-2013 Naam Nom: Mandy Lekens Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Labomanager (get.) Datum - Date: 2013-10-31 Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 5/12

SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS RÉSUMÉ DES DONNÉES DE VALIDATION... 7 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED... 7 2. ANALYSEMETHODE EN ANALISTEN... 7 3. PRESTATIEKENMERKEN... 7 3.1 Lineariteit en werkgebied... 7 3.2 Precisie... 8 3.2.1 Herhaalbaarheid (%RSD r ) en intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw )... 8 3.2.1.1 Voedingssupplement... 8 3.2.1.2 Zuigelingenmelk... 9 3.3 Juistheid en/of terugvinding... 9 3.3.1 Voedingssupplementen... 9 3.3.2 Zuigelingenmelk... 10 3.4 Aantoonbaarheidsgrens (LOD) en bepaalbaarheidsgrens (LOQ) of rapporteringsgrens... 10 3.5 Specificiteit en selectiviteit... 11 3.6 Reproduceerbaarheid (Inter)... 11 3.7 Robuustheid... 11 4. MEETONZEKERHEID... 11 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 6/12

Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation 1. Doel en toepassingsgebied Kwantitatieve bepaling van choline, ook wel vitamine B4 genoemd, in voedingssupplementen en zuigelingenmelk met behulp van een afgeleide spectrofotometrische methode (AOAC 999.14). Het gehalte aan choline in voedingssupplementen bedraagt gewoonlijk 250 tot 500 mg per dagelijkse dosis (gehalte sterk variërend van 300 tot 300000 mg/kg), het gehalte in zuigelingenmelk bedraagt gewoonlijk 50 tot 100 mg/100 g. Het werkgebied zal zo worden opgesteld dat de courante concentraties voor beide matrices probleemloos kunnen gemeten worden en kritische concentraties niet helemaal aan de uitersten van het werkgebied liggen. 2. Analysemethode en analisten I-MET-FLVVT-153: versie 01. Het validatieonderzoek werd uitgevoerd onder toezicht van sectieverantwoordelijke Mieke Vanbrabant (2012-2013) door de volgende analisten: Johan Vandenbempt Jean-Pierre De Lannoy. 3. Prestatiekenmerken Ruwe gegevens: Zie bijlage. 3.1 Lineariteit en werkgebied Een ijklijn in solvent en een ijklijn in matrix werden opgesteld op basis van 5 concentratieniveaus (6,25-25- 100-200-375 µg/ml). De geschiktheid van het lineair model voor beide ijklijnen werd bewezen aan de hand van het statistisch verwerkingsprogramma Statgraphics (Regressie-analyse, Lack-of-fit test, Comparison of alternative models). Een Statgraphics vergelijking tussen de ijklijn in solvent en de ijklijn in matrix werd uitgevoerd om aan te tonen dat er geen significant verschil bestaat tussen de ijklijn in solvent en de ijklijn in matrix (Comparison of regression lines). In dit geval wordt er bijgevolg verder gewerkt met een ijklijn in solvent. Het werkgebied wordt gekozen in functie van de meest voorkomende doseringsgehaltes en ligt tussen 6,25 en 375 µg/ml. Door verdunning van de testoplossing of door minder monster in bewerking te nemen, kunnen monsters met hoge gehaltes aan choline geanalyseerd worden. A reag, de absorptie van het chromogeen reagens wordt in mindering gebracht bij elke absorbantie meetwaarde, zodat de standaardcurve het nulpunt bevat, zie I-MET-FLVVT-153. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 7/12

3.2 Precisie 3.2.1 Herhaalbaarheid (%RSD r ) en intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw ) Voor de gelijktijdige bepaling van herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid werd er volgens de validatieprocedure gebruik gemaakt van Excel-template LAB 00 P 180 F 004. Gezien het om een spectrofotometrische methode gaat, hanteren we als criterium dat de Horwitz ratio (HorRat = bekomen intralaboratoriumreproduceerbaarheid / maximale intralaboratoriumreproduceerbaarheid volgens de Horwitz-vergelijking = %RSD R / %RSD Rw max ) kleiner moet zijn dan 2,0. 3.2.1.1 Voedingssupplement 3.2.1.1.1 Laag niveau (± 5000 mg/kg) Monsternummer = 12401493; Waarborg = 5310 mg/kg FLVVT Horwitz %RSD r 3,63 %RSD r max = 2,93 %RSD Rw 3,75 %RSD Rw max = 4,40 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 571,92 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 590,97 HorRat = 0,85 Evaluatie: Voor de matrix voedingssupplementen (laag niveau) is HorRat gelijk aan 0,85 (< 2,0), de precisie voldoet bijgevolg aan het vereiste criterium. 3.2.1.1.2 Midden niveau (± 10000 mg/kg) Blanco referentiemateriaal (NIST SRM 3280, Multivitamin/Multielement Tablets) waaraan 10000 mg/kg choline werd toegevoegd. FLVVT Horwitz %RSD r 3,91 %RSD r max = 2,67 %RSD Rw 4,23 %RSD Rw max = 4,00 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 1188,94 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 1285,04 HorRat = 1,06 Evaluatie: Voor de matrix voedingssupplementen (midden niveau) is HorRat gelijk aan 1,06 (< 2,0), de precisie voldoet bijgevolg aan het vereiste criterium. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 8/12

3.2.1.1.3 Hoog niveau (± 25000 mg/kg) Monsternummer = 12400754; Waarborg = 25700 mg/kg FLVVT Horwitz %RSD r 3,99 %RSD r max = 2,31 %RSD Rw 4,21 %RSD Rw max = 3,47 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 2947,09 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 3107,43 HorRat = 1,21 Evaluatie: Voor de matrix voedingssupplementen (hoog niveau) is HorRat gelijk aan 1,21 (< 2,0), de precisie voldoet bijgevolg aan het vereiste criterium. 3.2.1.2 Zuigelingenmelk Standaard referentiemateriaal (NIST SRM 1849a, Infant/Adult Nutritional Formula) met referentiegehalte = 1090 ± 110 mg/kg FLVVT Horwitz %RSD r 5,46 %RSD r max = 3,72 %RSD Rw 5,86 %RSD Rw max = 5,58 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 165,18 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 177,40 HorRat = 1,05 Evaluatie: Voor de matrix zuigelingenmelk is HorRat gelijk aan 1,05 (< 2,0), de precisie voldoet bijgevolg aan het vereiste criterium. Bovendien liggen alle resultaten binnen het toegestane interval rond het referentiegehalte van het standaard referentiemateriaal (980-1200 mg/kg). 3.3 Juistheid en/of terugvinding Bij herhaalde analyses van een monster moet het resultaat liggen tussen 80 en 120% van het belaste gehalte. 3.3.1 Voedingssupplementen De terugvinding werd bepaald aan de hand van een standaard referentiemateriaal NIST 3280 (spike 10000 mg/kg) en het terugvindingspercentage bedraagt 108,6 %. Dit voldoet aan de vooropgestelde voorwaarde. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 9/12

Aangezien er geen gedoseerde CRM beschikbaar was, werd de terugvinding bepaald voor routinemonsters op 3 niveaus, meerbepaald 5310, 25700 en 48800 mg/kg. De terugvindingspercentages bedroegen respectievelijk 106,1 %, 102,5 % en 114,3 % en voldoen bijgevolg aan de vooropgestelde voorwaarde. 3.3.2 Zuigelingenmelk De juistheid werd bepaald aan de hand van een standaard referentiemateriaal (NIST SRM 1849a, referentiegehalte 1090 mg/kg) en bedraagt 99,1%. Dit voldoet aan de vooropgestelde voorwaarde. 3.4 Aantoonbaarheidsgrens (LOD) en bepaalbaarheidsgrens (LOQ) of rapporteringsgrens Voor de bepaling van de LOQ werden 6 deelmonsters met een gehalte van ± 200 mg/kg geanalyseerd. De absorbanties vallen binnen het werkgebied, het terugvindingspercentage bedraagt gemiddeld 108,4% en de RSD is gelijk aan 3,01 %. Datum Waarborg (mg/kg) A smp Concentratie (mg/kg) Recovery (%) 0,052 234 107,6 0,051 229 105,2 05/04/2013 218 0,054 245 112,3 0,054 245 112,3 0,051 229 105,2 0,052 234 107,6 Gemiddelde 0,052 236 108,4 STDEV 0,001 7,12 3,27 RSD (%) 2,61 3,01 3,01 Voor de bepaling van de LOD werden 6 deelmonsters met een gehalte van ± 100 mg/kg geanalyseerd. De absorbanties vallen binnen het werkgebied, het terugvindingspercentage bedraagt gemiddeld 147,9 % en de RSD is gelijk aan 34,3%. Datum Waarborg (mg/kg) A smp Concentratie (mg/kg) Recovery (%) 01/03/2013 05/04/2013 0,026 105 96,7 0,029 122 111,9 109 0,054 261 239,2 0,036 151 138,6 0,035 146 133,8 0,042 182 167,3 Gemiddelde 0,037 161 147,9 STDEV 0,01 55,4 50,8 RSD (%) 27,1 34,3 34,3 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 10/12

Aangezien er rekening wordt gehouden met de absorbantie van het nulpunt van de standaardcurve (solvent met chromogeen reagens) tijdens het opstellen van de standaardcurve en aangezien de absorbantie van de procedureblanco (matrix zonder chromogeen reagens) steeds kleiner is dan 0,005 volgens de validatiegegevens, gaan we ervan uit dat de absorbanties gemeten op LOQ- en LOD-niveau (gemiddeld 0,052 en 0,037) duidelijk te onderscheiden zijn van de absorbantie van een blanco of negatief monster. Aangezien 200 mg/kg binnen het werkgebied valt en we vooral werken naar de doseringsgehaltes in voedingssupplementen en zuigelingenmelk, wordt dit gehalte aangenomen als rapporteringsgrens. 3.5 Specificiteit en selectiviteit De piekidentificatie gebeurt door middel van het gebruik van een specifieke golflengte. De piekkwantificatie gebeurt aan de hand van de absorbantie bij deze karakteristieke golflengte. 3.6 Reproduceerbaarheid (Inter) Er werd nog niet deelgenomen aan ringtesten. In afwachting hiervan werd er intern een tweedelijnscontrole uitgevoerd, welke voldeed aan de aanvaardingscriteria. 3.7 Robuustheid Langetermijnsvalidatie wordt uitgevoerd op basis van Shewart-controlekaarten (trendanalyse). 4. Meetonzekerheid De meetonzekerheid van de methode wordt berekend, rekening houdend met de juistheid en precisie. 2 Omwille van de beperkte bijdrage van de intra-reproduceerbaarheid variantie %u Rw aan de meetonzekerheid (volgend uit de beperkte hoeveelheid gegevens van de controlekaart), wordt de meetonzekerheid voor alle niveaus vastgelegd op 20%. De meetonzekerheid zal opnieuw geëvalueerd worden zodra er meer controlekaartgegevens beschikbaar zijn. Matrix Niveau Concentratie Uitgebreide relatieve (mg/kg) meetonzekerheid U (%) Voedingssupplement Laag 200 7500 18,1 Voedingssupplement Midden 7500 12500 22,2 Voedingssupplement Hoog > 12500 14,7 Zuigelingenmelk Midden 200-2000 15,8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 11/12

LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 12/12