VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Goedgekeurd door Approuvée par I-MET-FLVVT-152 Kwantitatieve bepaling van ubiquinone in voedingssupplementen Détermination quantitative de ubiquinone dans suppléments alimentaires HPLC Voedingssupplementen Suppléments alimentaires Totaal Totale Secundair Secondaire Mini-validatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie Handtekeningen - Signatures: toevoegingsmiddelen (get.) Datum - Date: 2012-10-01 Naam Nom: Mandy Lekens Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Labomanager (get.) Datum - Date: 2012-10-04 LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 1/11
Stap Phase 1: Bepaling van het toepassingsgebied Déterminer le champs d application De methode moet geschikt zijn voor de kwantitatieve bepaling van ubiquinone, ook coenzyme Q10 (CoQ10), ubidecarenone en ubiquinol-10 genoemd, in voedingssupplementen. Het gehalte aan ubiquinone in voedingssupplementen bedraagt gewoonlijk 30 tot 200 mg per dagelijkse dosis, wat overeenkomt met courante gehaltes van 40000 tot 300000 mg/kg. Het werkgebied zal zo opgesteld worden dat de courante concentraties voor beide matrices probleemloos kunnen gemeten worden en kritische concentraties niet helemaal aan de uitersten van het werkgebied liggen. Stap Phase 2: Doel en statuut van de analysemethode Le but et status de la méthode d analyse Kwantitatieve bevestigingsmethode, afgeleide methode gebaseerd op AOAC methode 2008.07 (Coenzyme Q10 in grondstoffen en voedingssupplementen). 1. Determination of Ubidecarenone (Coenzyme Q10, Ubiquinol-10) in raw materials and dietary supplements by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection: Single-laboratory validation. [Orozco et al., Journal of AOAC INTERNATIONAL, Vol. 90, No.5, 2007 (1227-1236)] 2. Determination of Coenzyme Q10 content in raw materials and dietary supplements by high-performance liquid chromatography-uv: Collaborative study. [Lunetta & Roman, Journal of AOAC INTERNATIONAL, Vol. 91, No.4, 2008 (701-708)] Stap Phase 3: Keuze validatieparameters Choisir les paramètres à valider Voor deze methode worden de volgende prestatiekenmerken bepaald: lineariteit en werkgebied, bepaalbaarheidsgrens (rapporteringsgrens) en aantoonbaarheidsgrens, specificiteit en selectiviteit, juistheid en terugvinding, precisie, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid (intra-) en robuustheid. Stap Phase 4: Externe eisen voor validatieparameters Des exigences externes pour les paramètres à valider Nvt. Stap Phase 5: Keuze van de monsters Le choix d échantillons In de eerste plaats gecertificeerd referentiemateriaal dat een grote gelijkenis met praktijkmonsters vertoont. Indien er geen referentiemateriaal beschikbaar is, zal de geschiktheid van de methode getest worden op routinemonsters en geaddeerde praktijkmonsters. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 2/11
VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaption I-MET-FLVVT-152 Kwantitatieve bepaling van ubiquinone in voedingssupplementen Détermination quantitative de ubiquinone dans suppléments alimentaires HPLC Voedingssupplementen Suppléments alimentaires 2013/10/31 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 3/11
Overzicht van de prestatiekenmerken: o Zie paragraaf 3 De validatie voldoet aan procedure LAB 00 P 180 Validatie van analysemethoden De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: o Zie paragraaf 3.2 en 3.3 (zowel juistheid als precisie bepaald op minstens 1 niveau) Historiek validatie Versie Herziening datum/door Reden van herziening Wijzigingen 01 10/2013, M. Vanbrabant Opsteller initiële versie Volledige tekst LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/11
VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par I-MET-FLVVT-152 Kwantitatieve bepaling van ubiquinone in voedingssupplementen Détermination quantitative de ubiquinone dans suppléments alimentaires HPLC Voedingssupplementen Suppléments alimentaires Totaal Totale Secundair Secondaire Mini-validatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie Handtekeningen - Signatures: toevoegingsmiddelen (get.) Datum - Date: 2013-10-30 Anne-Marie Voets : laborant Martine Bral : laborant Nele Maris : laborant Start - Début: 10-2012 Einde - Fin: 10-2013 Naam Nom: Mandy Lekens Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Labomanager (get.) Datum - Date: 2013-10-31 Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 5/11
SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS RÉSUMÉ DES DONNÉES DE VALIDATION... 7 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED... 7 2. ANALYSEMETHODE EN ANALISTEN... 7 3. PRESTATIEKENMERKEN... 7 3.1 LINEARITEIT EN WERKGEBIED... 7 3.2 PRECISIE... 8 3.2.1 Herhaalbaarheid (%RSD r ) en intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw )... 8 3.2.1.1 Voedingssupplement... 8 3.2.1.1.1 Laag niveau (± 40000 mg/kg)... 8 3.2.1.1.2 Middelhoog niveau (± 70000 mg/kg)... 8 3.2.1.1.3 Hoog niveau (± 250000 mg/kg)... 9 3.3 JUISTHEID & TERUGVINDING... 9 3.4 AANTOONBAARHEIDSGRENS (LOD) EN BEPAALBAARHEIDSGRENS (LOQ)... 9 3.5 SPECIFICITEIT EN SELECTIVITEIT... 10 3.6 REPRODUCEERBAARHEID (INTER)... 10 3.7 ROBUUSTHEID... 10 4. MEETONZEKERHEID... 10 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 6/11
Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation 1. Doel en toepassingsgebied Kwantitatieve bepaling van ubiquinone, ook coenzyme Q10 (CoQ10), ubidecarenone en ubiquinol-10 genoemd, in voedingssupplementen met behulp van een afgeleide HPLC-methode (AOAC 2008.07). Het gehalte aan ubiquinone (of de gereduceerde vorm ubiquinol) in voedingssupplementen bedraagt gewoonlijk 30 tot 200 mg per dagelijkse dosis, wat overeenkomt met courante gehaltes van 40000 tot 300000 mg/kg. Het werkgebied zal zo opgesteld worden dat de courante concentraties voor beide matrices probleemloos kunnen gemeten worden en kritische concentraties niet helemaal aan de uitersten van het werkgebied liggen. 2. Analysemethode en analisten I-MET-FLVVT-152, versie 01. Het validatieonderzoek werd uitgevoerd onder toezicht van sectieverantwoordelijke Mieke Vanbrabant (2012-2013) door de volgende analisten: Martine Bral Annemie Voets Nele Maris 3. Prestatiekenmerken Ruwe gegevens: Zie bijlage. 3.1 Lineariteit en werkgebied Een ijklijn in solvent en een ijklijn in matrix werden opgesteld op basis van 5 concentratieniveaus (12,5-25- 50-75-100 µg/ml). De geschiktheid van het lineair model voor beide ijklijnen werd bewezen aan de hand van het statistisch verwerkingsprogramma Statgraphics (Regressie-analyse, Lack-of-fit test). Een Statgraphics vergelijking tussen de ijklijn in solvent en de ijklijn in matrix werd uitgevoerd om aan te tonen dat er geen significant verschil bestaat tussen de ijklijn in solvent en de ijklijn in matrix (Comparison of regression lines). In dit geval wordt er bijgevolg verder gewerkt met een ijklijn in solvent. Het werkgebied wordt gekozen in functie van de meest voorkomende doseringsgehaltes en ligt tussen 12,5 en 100 µg/ml. Door verdunning van de testoplossing of door minder monster in bewerking te nemen, kunnen monsters met hoge gehaltes aan ubiquinone geanalyseerd worden. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 7/11
3.2 Precisie 3.2.1 Herhaalbaarheid (%RSD r ) en intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw ) Voor de gelijktijdige bepaling van herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid werd er volgens de validatieprocedure gebruik gemaakt van Excel-template LAB 00 P 180 F 004. De bekomen %RSD r en %RSD Rw per niveau moeten lager zijn dan of gelijk aan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz. 3.2.1.1 Voedingssupplement 3.2.1.1.1 Laag niveau (± 40000 mg/kg) Monsternummer = 13070759; Waarborg = 41200 mg/kg FLVVT Horwitz %RSD r 2,09 %RSD r max = 2,15 %RSD Rw 2,11 %RSD Rw max = 3,23 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 2464,86 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 2495,04 HorRat = 0,65 Evaluatie: Voor de matrix voedingssupplementen (middelhoog niveau) is zowel herhaalbaarheid (%RSD r ) als intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz. Zowel de herhaalbaarheid als de intralaboratoriumreproduceerbaarheid voldoen bijgevolg aan de criteria vermeld in de validatieprocedure. 3.2.1.1.2 Middelhoog niveau (± 70000 mg/kg) Monsternummer = 13411947; Waarborg = 66000 mg/kg FLVVT Horwitz %RSD r 1,89 %RSD r max = 1,99 %RSD Rw 2,97 %RSD Rw max = 2,98 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 3297,38 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 5181,31 HorRat = 1,00 Evaluatie: Voor de matrix voedingssupplementen (middelhoog niveau) is zowel herhaalbaarheid (%RSD r ) als intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz. Zowel de herhaalbaarheid als de intralaboratoriumreproduceerbaarheid voldoen bijgevolg aan de criteria vermeld in de validatieprocedure. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 8/11
3.2.1.1.3 Hoog niveau (± 250000 mg/kg) Monsternummer = 13060229; Waarborg = 275000 mg/kg FLVVT Horwitz %RSD r 1,49 %RSD r max = 1,62 %RSD Rw 1,58 %RSD Rw max = 2,43 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 11493,12 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 12189,46 HorRat = 0,65 Evaluatie: Voor de matrix voedingssupplementen (hoog niveau) is zowel herhaalbaarheid (%RSD r ) als intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz. Zowel de herhaalbaarheid als de intralaboratoriumreproduceerbaarheid voldoen bijgevolg aan de criteria vermeld in de validatieprocedure. 3.3 Juistheid & terugvinding Bij herhaalde analyses van een monster moet het resultaat liggen tussen 70 en 120% van het belaste gehalte. De terugvinding werd bepaald aan de hand van controlekaartgegevens (spike 10 mg/kg) tijdens de periode november 2012 oktober 2013. Er werden geen resultaten bekomen die niet voldeden aan de recoveryaanvaardingscriteria en het terugvindingspercentage bedraagt 99,9 %, wat voldoet aan de vooropgestelde voorwaarde. Aangezien er geen CRM beschikbaar was, werd de terugvinding bepaald voor routinemonsters op 3 niveaus, meerbepaald 40000, 70000 en 275000 mg/kg. De terugvindingspercentages bedroegen respectievelijk 102,5 %, 89,0 % en 100,3 %, waardoor ze alle drie voldoen aan de vooropgestelde voorwaarde. 3.4 Aantoonbaarheidsgrens (LOD) en bepaalbaarheidsgrens (LOQ) De LOD en LOQ worden berekend op basis van de signaal-ruisverhouding (S/N). Voor de LOD dient S/N 3 te zijn; voor de LOQ is S/N 6. Voor de bepaling van de LOQ werden 18 deelmonsters van NIST SRM 3280 (bevat geen ubiquinon) gespiked met een gehalte van 2,5 mg/kg. De signaal/ruis-verhouding (S/N) bedroeg gemiddeld meer dan 30 en de concentratie bedroeg gemiddeld 2,522 mg/kg. De recovery-waarde bedroeg 100,88 % en de RSD 1,99 %. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 9/11
Aangezien de verhouding tussen het signaal en de ruis groter dan of gelijk is aan 30 (S/N 30), dienen de bepaalbaarheidsgrens en aantoonbaarheidsgrens niet bepaald te worden (De Ware(n) Chemicus). Dit is geen probleem omdat het gehalte in routinemonsters (voedingssupplementen) meestal veel hoger ligt. We spreken dan ook niet van een bepaalbaarheidsgrens, maar wel van een rapporteringsgrens van 2,5 mg/kg. 3.5 Specificiteit en selectiviteit De piekidentificatie gebeurt aan de hand van de retentietijd. De piekkwantificatie gebeurt aan de hand van de piekoppervlakte. 3.6 Reproduceerbaarheid (Inter) Er werd nog niet deelgenomen aan ringtesten. In afwachting hiervan werd er intern een tweedelijnscontrole uitgevoerd, welke voldeed aan de aanvaardingscriteria. 3.7 Robuustheid Langetermijnsvalidatie wordt uitgevoerd op basis van Shewart-controlekaarten (trendanalyse). 4. Meetonzekerheid De meetonzekerheid van de methode wordt berekend, rekening houdend met de juistheid en precisie. 2 Omwille van de beperkte bijdrage van de intra-reproduceerbaarheid variantie %u Rw aan de meetonzekerheid (volgend uit de beperkte hoeveelheid gegevens van de controlekaart), wordt de meetonzekerheid voor alle niveaus vastgelegd op 20%. De meetonzekerheid zal opnieuw geëvalueerd worden zodra er meer controlekaartgegevens beschikbaar zijn. Niveau Concentratie Uitgebreide relatieve (mg/kg) meetonzekerheid U (%) Laag 2,5-40000 19,1 Midden 40000 250000 21,7 Hoog > 250000 18,2 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 10/11
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 11/11