VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date du dernière adaption MET-FLVVT-096 Bepaling van deoxynivalenol (DON) in dierenvoeders, voedingsmiddelen en bier HPLC granen Initieel dossier: 2004, aanpassing layout/vorm : juni 2013; laatste aanpassing inhoud: juni 2013

Overzicht van de prestatiekenmerken: - lineariteit: werkgebied range 100 1000 ng/ml (0,4 4 mg/kg) - Bepaalbaarheidsgrens (LOQ): 150 µg/kg - Aantoonbaarheidsgrens (LOD): 80 µg/kg - Herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding: niveau herhaalbaarheid (%) reproduceerbaarheid (%) 400 µg/kg 5,7 13,1 750 µg/kg 4,5 2,6 1200 µg/kg 2,6 3,8 - Meetonzekerheid %U Concentratie Laag niveau 40% Midden 30% Hoog 25% - Robuustheid: vergelijking uitdamping extract op 70 C en 60 C De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: Prestatiecriteria uit EU-verordening 401/2006 Inhoud: Initieel dossier: 2003, aanpassing layout/vorm : juni 2013; laatste aanpassing inhoud: juni 2013

VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse MET-FLVVT-096 Bepaling van deoxynivalenol (DON) in dierenvoeders, voedingsmiddelen en bier Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par HPLC-UV Granen Totaal Jeroen Vancutsem sectiehoofd microscopie/mycotoxines Naam Nom: Jeroen Vancutsem Functie - Fonction: sectiehoofd microscopie/mycotoxines Datum - Date: juni 2013 Ruth Vanhoof, analist Rudy Van Meerbeek, analist Roel Tits, analist Start - Début: 2003 Einde - Fin: 2013 Naam Nom: Mandy Lekens Functie - Fonction: laboratoriummanager Datum - Date: 24 juni 2013 Handtekeningen - Signatures: (Get.) Handtekeningen - Signatures: (Get.) Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180.

Validatiedossier 1 Lineariteit: range 100-1000 ng/ml (400-4 mg/kg) De lineariteitscurve werd opgesteld in het gebied van 100 1000 ng/ml (400 4000 µg/kg). De concentraties die geïnjecteerd werden, zijn: 100 ng/ml ; 250 ng/ml ; 500 ng/ml ; 1000 ng/ml Resultaat: concentratie Piekoppervlak 100 ng/ml (400 µg/kg) 11524 250 ng/ml (1000 µg/kg) 29540 500 ng/ml (2000 µg/kg) 60437 1000 ng/ml (4000 µg/kg) 120150 Resultaten: parameter waarde limiet resultaat R 2 0,9999 > 0,99 OK intercept -451,12 (p = 0,32) p > 0,05 OK standaardstoringen tussen -0,62 en 1,42 tussen -2 en 2 OK Besluit: De rechte is lineair en loopt door het nulpunt. 2 Bepaling in blanco granen (selectiviteit/specificiteit) Een reeks van 20 monsters werd opgenomen en beoordeeld op het voorkomen van storende pieken. 3 De aantoonbaarheidsgrens (LOD) De aantoonbaarheidsgrens werd bepaald door spiking op tarwe van 80 µg/kg. Reeks (01/06/04) nummer concentratie (µg/kg) 1 113 2 110 3 110 4 114 5 112 6 104 Op basis van deze monsters werd een gemiddelde S/N-verhouding van 3,7 berekend (> 3) gemiddelde 111 gemiddelde recovery 138% Besluit: De LOD kan vastgelegd worden op 80 µg/kg. LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/14

4 De bepalingsgrens: De bepalingsgrens werd bepaald door spiking van 150 µg/kg op tarwe. Reeks (01/06/04) nummer concentratie (µg/kg) recovery (%) 1 124 83 2 155 103 3 161 107 4 159 106 5 149 99 6 161 107 Op basis van deze monsters werd een gemiddelde S/N-verhouding van 11,5 berekend (> 6) gemiddelde 152 gemiddelde recovery 101 herhaalbaarheid RSD (%), 9,39 2,8 x STDEV 39,83 outliers (Grubbs test) G hoogste waarde OK G kritisch : 1,89 G laagste waarde* NOK *De laagste waarde is een outlier volgens de Grubbs test maar voldoet aan de voorwaarden van Verordening 401/2006 en werd meegenomen in de berekeningen. Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSD r van 20% toegestaan en een terugvindingspercentage van 60-110%. Besluit: De LOQ kan vastgelegd worden op 150 µg/kg. 5 De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid, terugvinding en juistheid: De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden bepaald conform template LAB 00 P 180 F 004 (2012-03-15_LAB-00-P-180-F-004-validatie-berekeningen-formules_v01_NL-FR). De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid, terugvinding en juistheid werden bepaald - door spiking op tarwe van 150 µg/kg (zie 4. Bepalingsgrens, herhaalbaarheid en terugvinding) Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSD r van 20% en een terugvindingspercentage van 60-110% toegestaan voor gehalten 100-500 µg/kg Besluit: De herhaalbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 5/14

- door standaardadditie op tarwe van 400 µg/kg (1/2 norm). De monsters werden gespiket met 100 µl van de standaardoplossing van 100 µg/ml. Reeks nummer concentratie (µg/kg) recovery (%) Reeks 1 1 396 99 11/06/13 2 423 106 R. Tits 3 433 108 4 423 106 5 418 105 Reeks 2 12/06/13 R. Vanhoof Reeks 3 13/06/13 R. Van Meerbeek 1 335 84 2 373 93 3 343 86 4 355 89 5 339 85 6 338 85 1 367 92 2 287 72 3 359 90 4 336 84 5 319 80 6 343 86 gemiddelde 363,94 gemiddelde recovery 91,0 herhaalbaarheid RSD (%), 5,70 2,8 x STDEV 58,10 reproduceerbaarheid RSD (%) 13,06 2,8 x STDEV 133,11 outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,62 G hoogste waarde OK G laagste waarde OK Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSD r van 20%, een maximale RSD R van 40% en een terugvindingspercentage van 70-120% toegestaan voor gehalten > 500 µg/kg. Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 6/14

- door standaardadditie op tarwe van 750 µg/kg (norm). De monsters werden gespiket met 187,5 µl van de standaardoplossing van 100 µg/ml. Reeks nummer concentratie (µg/kg) recovery (%) Reeks 1 1 632 84 11/06/13 2 677 90 R. Tits 3 654 87 4 679 91 5 676 90 Reeks 2 12/06/13 R. Vanhoof Reeks 3 13/06/13 R. Van Meerbeek 1 591 79 2 587 78 3 581 77 4 604 81 5 585 78 6 606 81 1 635 85 2 729 97 3 673 90 4 599 80 5 658 88 6 658 88 gemiddelde 636,71 gemiddelde recovery 84,9 herhaalbaarheid RSD (%), 4,50 2,8 x STDEV 80,14 reproduceerbaarheid RSD (%) 7,52 2,8 x STDEV 134,03 outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,62 G hoogste waarde OK G laagste waarde OK Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSD r van 20%, een maximale RSD R van 40% en een terugvindingspercentage van 70-120% toegestaan voor gehalten > 500 µg/kg. Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 7/14

- door spiking op tarwe van 1200 µg/kg (1,5 X norm). De monsters werden gespiket met 300 µl van de standaardoplossing van 100 µg/ml Reeks nummer concentratie recovery (%) (µg/kg) Reeks 1 1 997 83 11/06/13 2 1008 84 R. Tits 3 1003 84 4 1003 84 Reeks 2 12/06/13 R. Vanhoof Reeks 3 13/06/13 R. Van Meerbeek 5 996 83 1 995 83 2 917 76 3 942 79 4 1020 85 5 946 79 6 925 77 1 997 83 2 1020 85 3 1021 85 4 1013 84 5 1021 85 6 1012 84 gemiddelde 990,35 gemiddelde recovery 82,5 herhaalbaarheid RSD (%), 2,55 2,8 x STDEV 70,62 reproduceerbaarheid RSD (%) 3,84 2,8 x STDEV 106,44 outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,62 G hoogste waarde OK G laagste waarde OK Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSD r van 20%, een maximale RSD R van 40% en een terugvindingspercentage van 70-120% toegestaan voor gehalten > 500 µg/kg. Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 8/14

- De juistheid werd bepaald door analyse van CRM s 1. CRM 378 Maïs 0,43 mg/kg (Nr 153) De gecertificeerde waarde is 0,43 ± 0,04 mg/kg Nummer (16/01/03) oppervlakte concentratie (mg/kg) Concentratie na correctie voor recovery (mg/kg) 1 1409 0,35 0,39 2 1673 0,41 0,45 3 1578 0,39 0,43 4 1578 0,39 0,43 5 1627 0,40 0,44 6 1253 0,31 0,34 gemiddelde 0,41 STDEV 0,042 RSD (%) 10,1 herhaalbaarheid = 2,8 x STDEV 0,11 Wegens de beperkte hoeveelheid CRM werd 20g afgewogen ipv 25g. Volgens de instructies van het gebruik van de CRM moet minstens 20g afgewogen worden. Om de waarden van de herhaalbaarheidstest te vergelijken met het gehalte DON in de CRM, passen we de volgende methode toe volgens de instructies van de leverancier: Eerst wordt nagegaan of de standaardfout (s/ n i ) op het gemiddelde van de test kleiner is dan de standaarddeviatie (SD) in de validatiestudie waarbij SD voortkomt uit de gemiddelde waarden gevonden door de labo s. Standaardfout (s/ n i ) 0,017 SD 0,036 resultaat OK Als aan deze voorwaarde voldaan is, wordt gekeken of het gemiddelde binnen de toegestane grenzen ligt: (gecertificeerde waarde 2SD) < y < (gecertificeerde waarde + 2SD) Dit interval bevat 95% van de populatie van de gemiddelden van de labo s die deelnamen aan de certificatietest. (gecertificeerde waarde 2SD) < y < 0,35-0,50 (gecertificeerde waarde + 2SD) y 0,41 resultaat OK Besluit: De bepaling van de juistheid voldoet aan de criteria. LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 9/14

2. CRM 379 TARWE 0,67 mg/kg (nr 305) De gecertificeerde waarde is 0,67 ± 0,02 mg/kg Nummer (21/01/03) oppervlakte concentratie (mg/kg) Concentratie na correctie voor recovery (mg/kg) 1 2597 0,62 0,76 2 2923 0,70 0,86 3 2693 0,64 0,79 4 2579 0,61 0,75 5 2649 0,63 0,77 6 2681 0,64 0,79 gemiddelde 0,64 STDEV 0,032 RSD (%) 4,9 herhaalbaarheid 0,090 = 2,8 x STDEV Wegens de beperkte hoeveelheid CRM werd 20g afgewogen ipv 25g. Volgens de instructies van het gebruik van de CRM moet minstens 20g afgewogen worden. Om de waarden van de herhaalbaarheidstest te vergelijken met het gehalte DON in de CRM, passen we de volgende methode toe volgens de instructies van de leverancier: Eerst wordt nagegaan of de standaardfout (s/ n i ) op het gemiddelde van de test kleiner is dan de standaarddeviatie (SD) in de validatiestudie waarbij SD voortkomt uit de gemiddelde waarden gevonden door de labo s. Standaardfout (s/ n i ) 0,013 SD 0,019 resultaat OK Als aan deze voorwaarde voldaan is, wordt gekeken of het gemiddelde binnen de toegestane grenzen ligt: (gecertificeerde waarde 2SD) < y < (gecertificeerde waarde + 2SD) Dit interval bevat 95% van de populatie van de gemiddelden van de labo s die deelnamen aan de certificatietest. (gecertificeerde waarde 2SD) < y < 0,64-0,71 (gecertificeerde waarde + 2SD) y 0,79 resultaat OK, rekening houdend met meetonzekerheid Besluit: De bepaling van de juistheid voldoet aan de criteria. LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 10/14

6 Meetonzekerheid: Voor het bepalen van de meetonzekerheid werd de volgende strategie gevolgd: Eerst wordt nagegaan of de bias significant is (in dat geval is de bias > 2s RW ). concentratie bias 2s RW bias > 2s RW? 400 ppb 36,06 95,08 NEE 750 ppb 113,29 95,74 JA 1200 ppb 209,65 76,03 JA Dit is het geval bij een concentratie van 750 en 1200 µg/kg. De uitgebreide meetonzekerheid is daar gelijk aan: U b 2* s RW Dit geeft volgende waarden: b 2*s RW U (µg/kg) U (rel, %) 750 µg/kg 113,29 95,74 209,03 27,9% 1200 µg/kg 209,65 76,03 285,68 23,8% Bij 400 µg/kg < 2s RW en kiezen we volgende formule: u c 2 2 ubias u(rw) met u bias RMS bias 2 u ( spiking ) 2 u(cref, spike) 2 (meetonzekerheid op basis van recovery) en u(r W ) = s R Met RMS bias 2 (%) 400 µg/kg 182,81 Met u(spiking) 2 Voor 400 µg/kg werd 100 µl van de standaard van 100 µg/ gepiket met een micropipet van 10-100 µl. Volgende onzekerheidsparameters werden in rekening gebracht: a. onzekerheid op precisie van de pipet om te spiken (driehoeksverdeling) pipet 10-100 µl: accuracy: 0,8% (voor 100µl)-> onzekerheid: 0,33% b. reproduceerbaarheid in pipetteren: 1% (geschat, zie cursus meetonzekerheid) u(spiking) 400µg/kg 2 = 0,33 2 +1 2 = 1,11 Met u(cref spike) 2 Concentratie (µg/ml) 99,1 onzekerheid 2,24 Onzekerheid relatief 2,26 u(cref spike) 2 5,11 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 11/14

Samengevat 400 µg/kg RMS 2 bias (%) 182,81 u(spiking) 2 1,11 u(cref spike) 2 5,11 som 189,03 u Rw 2 = s R 2 (rel) 400 µg/kg 170,56 u c 400 µg/kg (189,03+170,56)= 18,96 U = 2u c 400 µg/kg 37,9 % Samengevat meetonzekerheid: 400 µg/kg 37,9% 750 µg/kg 27,9% 1200 µg/kg 23,8% Besluit meetonzekerheid: meetonzekerheid gebied LOQ-1/2 norm 40% gebied ½ norm 3/2 norm 30% gebied > 3/2 norm 25% LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 12/14

7 Robuustheid De invloed van de temperatuur op het uitdampen van het extract na opzuivering werd nagegaan. De monsters werden op 70 C uitgedampt in plaats van 60 C. Volgende resultaten werden bekomen (datum uitvoering 11/06/13): 60 C 70 C 1 632 652 2 677 612 3 654 637 4 679 598 5 676 671 gemiddelde 663,6 634 Om na te gaan of er een significant verschil is, werd gebruik gemaakt van volgende formule (referentie: Statistiek, validatie en meetonzekerheid voor het laboratorium, Klaessens): met Uitwerking van het eerste lid geeft als resultaat: 1,64. Besluit: Er is geen significant effect van de temperatuur bij het uitdampen op 70 C in plaats van 60 C. REFERENTIEMETHODE: Methode gebaseerd op: NBN EN 15891 : 2010 Voedingsmiddelen - Bepaling van deoxynivalenol in granen, graanproducten en op granen gebaseerde voeding voor peuters en jonge kinderen - HPLC methode met immunoaffiniteitszuivering en UV detectie LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 13/14

8 Foto's a) Extractie met Ultraturrax b) Opzuivering met immunoaffiniteitskolom c) Chromatografie d) Chromatogram LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 14/14