Moleculaire diagnostiek bij melanoom: meer dan BRAF-V600E en vemurafenib

7 Moleculaire diagnostiek bij melanoom: meer dan BRAF-V600E en vemurafenib Molecular diagnostics in melanoma: more than BRAF-V600E and vemurafenib W.A.M. Blokx en P.J.T.A. Groenen Samenvatting Ongeveer 50% van de patiënten met een huidmelanoom heeft een BRAF-mutatie. De meest voorkomende BRAF-mutatie is een mononucleotide puntmutatie in exon 15 ter plaatse van codon 600, officieel genoteerd als c.1799t>a (p.(val600glu)). In de wetenschappelijke literatuur wordt deze mutatie echter vaak als de V600Emutatie beschreven, zo ook in dit artikel. Vemurafenib is een krachtige remmer van het gemuteerde (V600E) BRAF-kinase en kan worden gegeven als behandeling bij volwassen gemetastaseerde melanoompatiënten met een BRAF-gemuteerd melanoom die niet operabel zijn. In dit artikel bespreken wij aspecten die van belang zijn bij het inzetten en de uitvoering van een BRAF-mutatieanalysetest en bespreken wij de voor- en nadelen van de verschillende BRAF-testen. Belangrijk is zich te realiseren dat een BRAF-test niet zinvol is bij metastasen van bepaalde subtypen van primair melanoom, zoals het primair oog- en centraalzenuwstelselmelanoom, omdat deze geen BRAF-mutaties bevatten. De BRAF-mutatieanalysetest vindt bij voorkeur plaats op een recente metastase in verband met genotypische heterogeniteit. Daarnaast dient men zich te realiseren dat tot ongeveer 30% van de BRAF-gemuteerde melanomen niet een V600E-mutatie hebben, maar wel een andere mutatie op codon 600 van het BRAF-gen, en dat deze wel gevoelig zijn gebleken voor therapie met vemurafenib en andere BRAF-remmers. Een gebruikte BRAF-test dient om deze reden zowel BRAF-V600E- als ook andere V600-mutaties te kunnen detecteren. Voor de dit jaar te starten landelijke registratie van alle gemetastaseerde melanoompatiënten in Nederland is het van belang dat in de registratie de exacte omschrijving van een gevonden BRAF-mutatie wordt gegeven, zodat registratie op termijn goed inzicht kan geven in welke BRAF-gemuteerde patiënten het meest gebaat zijn met een BRAF-remmer of andere vorm van targeted of immuuntherapie. Dit geldt ook voor andere bij melanoom relevante genmutaties (zoals in NRAS, KIT, GNAQ en GNA11) die behandelbaar zijn met targeted therapie (nu nog in studieverband). (Ned Tijdschr Oncol 2013;10:281-9) Summary About 50% of all cutaneous melanoma harbor a BRAF mutation. The most common BRAF mutation is a mononucleotide hot spot mutation present in exon 15, leading to an amino-acid switch from Valine (V) to glutamine (E) at codon 600, officially termed as c.1799t>a (p.(val600glu)), however in scientific journals frequently described as V600E mutation, which also applies for this paper. Vemurafenib is a powerful inhibitor of the mutated V600E BRAF kinase, and can be used as a treatment for metastatic melanoma in adults with inoperable disease. In this article we discuss important do s and don ts in BRAFtesting and discuss the advantages and disadvantages Auteurs: mw. dr. W.A.M. Blokx, patholoog, afdeling Pathologie, mw. dr. P.J.T.A. Groenen, moleculair bioloog in de pathologie, afdeling Pathologie, Laboratorium Tumorgenetica, Radboud Universitair Medisch Centrum. Correspondentie graag richten aan mw. dr. W.A.M. Blokx, patholoog, afdeling Pathologie, Radboud Universitair Medisch Centrum, Postbus 9100, 6500 HB Nijmegen, tel.: 024 361 43 14, e-mailadres: willeke.blokx@radboudumc.nl Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. Trefwoorden: BRAF, diagnostiek, melanoom, moleculair, vemurafenib Key words: BRAF, diagnostics, melanoma, molecular, vemurafenib 281

of the currently available different methods and tests to detect a BRAF mutation. It is important to let clinical information about location of the primary guide the BRAF-testing; BRAF-mutational analysis is for instance not useful in case of melanoma metastases of a primary uvea or central nervous system melanoma, since these melanomas lack BRAF mutations. The BRAF-test is preferentially done on a recent metastasis because of genetic heterogeneity. Up to 30% of all BRAF mutated melanomas have a BRAF mutation that is different from the most frequent V600E mutation. Melanomas with non-v600e mutations also have been reported to be sensitive to vemurafenib treatment and therapy with other BRAF inhibitors. Therefore, the method that is used for BRAF-testing needs to detect these other relevant non-v600e mutations as well. In the Netherlands in 2013 central registration of all metastatic melanoma patients will start. It is important that in the national database that will be built up, molecular genotype data on a found BRAF mutation (and/or mutations in other relevant targetable genes in melanoma such as NRAS, GNAQ, GNA11, KIT ) are complete and describe the exact mutation. Only in this way our knowledge on efficacy of different targeted therapies in different patients with specific genotypes can rapidly increase and improve patient care. Inleiding Ongeveer 50% van de patiënten met een huidmelanoom heeft een mutatie in het BRAF-gen. 1 Deze mutaties in het BRAF-gen leiden tot een overactief BRAF-eiwit met constitutieve activering van de MAP-kinasesignaaltransductieroute. Dit leidt tot ongecontroleerde celgroei. Vemurafenib (Zelboraf, Roche Molecular Systems Inc.) is een sterke remmer van het gemuteerde V600E-BRAFkinase en kan als oraal geneesmiddel worden gebruikt bij de behandeling van volwassen melanoompatiënten met een BRAF-V600E-mutatie die inoperabel zijn of metastasen hebben. Een mutatie in het BRAF-gen kan worden vastgesteld door middel van een moleculaire test op melanoomweefsel van de betreffende patiënt. Tot dusver een straight-forward verhaal, maar toch zijn er belangrijke zaken bij de moleculaire diagnostiek voor melanoom en testen van BRAF-genmutaties die men zich moet realiseren. Testen van BRAF is niet zinvol bij alle melanoomsubtypen In de afgelopen 10 jaar is gebleken dat melanomen genetisch heterogeen zijn. Naast BRAF komen er ook andere mutaties voor bij melanoom in genen distaal/proximaal in de MAP-kinasesignaaltransductieroute, zoals NRAS, GNAQ, GNA11 en KIT (zie Figuur 1). Het type gen dat is gemuteerd bij melanoom en de frequentie daarvan hangt samen met de primaire lokalisatie van het melanoom. BRAF-mutaties komen vooral voor in primaire huidmelanomen, vooral die van intermitterende aan zon blootgestelde huid waarin in ongeveer 70% van de gevallen een BRAF-mutatie aanwezig is. 2 Daarentegen komen in melanoom van het oog en het centraal zenuwstelsel bij volwassenen geen BRAF-mutaties voor, maar juist mutaties in de GNAQ- en GNA11-genen. 3 BRAF-mutaties zijn ook weinig frequent bij lentigo maligna melanoom, acrolentigineus melanoom en primaire slijmvliesmelanomen; bij deze subtypen zijn KIT- en NRAS-mutaties meer frequent aanwezig. 3 Het testen van bepaalde typen melanoom op de aanwezigheid van een BRAF-mutatie is derhalve niet zinvol en kan achterwege blijven, terwijl mutatieanalyse van andere genen juist wel zinvol is in verband met overige gerichte therapiemogelijkheden, al dan niet in studieverband. Een overzicht van genmutaties, en remmers van deze, in diverse melanoomsubtypen staan in Tabel 1, pagina 284. In Figuur 1 is te zien waar deze verschillende remmers aangrijpen in de MAP-kinasesignaaltransductieroute. Bij melanoommetastase(n) waarbij de primaire tumor onbekend is, kan deze tabel ook als leidraad dienen om de nadere herkomst van het primaire melanoom vast te stellen en sturend zijn bij eventueel in te stellen gerichte therapie in geval er reeds uitgebreidere metastasering is. Typen BRAF-mutaties en gevoeligheid van deze voor BRAF-remmers De meest frequente mutatie in het BRAF-gen bij melanoom is de mononucleotide puntmutatie in exon 15 ter plaatse van codon 600 (CTG), c.1799t>a, die er toe leidt dat valine (V) wordt vervangen door glutaminezuur (Glu, E), de zogenoemde c.1799t>a (p.(val600glu))- mutatie, die echter in wetenschappelijke artikelen vaak als de V600E-mutatie wordt beschreven, zo ook in dit artikel. Tot recent werd aangenomen dat deze V600Emutatie in ongeveer 85% van de BRAF-gemuteerde melanomen aanwezig is. Verschillende studies laten zien dat andere mutaties van codon 600 van het BRAF-gen meer voorkomen dan aanvankelijk gedacht en dat ook deze melanomen gevoelig zijn voor vemurafenib of andere BRAF-remmers. Een recente grote studie, waarin 1.112 primaire en gemetastaseerde melanomen van diverse primaire herkomst (774 huidmelanomen, 111 acrale 282

7 Figuur 1. In deze figuur staat een schematische weergave van de 2 belangrijkste signaaltransductieroutes bij het ontstaan van melanocytaire tumoren en melanoom; de MAP-kinase- en de AKT/PI3K-signaaltransductieroute (in groen). Activatie van beide routes leidt tot proliferatie en beïnvloedt regulatie van de celcyclus. NRAS speelt een belangrijke rol in - en ook een verbindende rol tussen - beide signaaltransductieroutes. Mutaties in GNAQ, GNA11 en BRAF leiden alle tot activatie van alleen de MAP-kinaseroute. Mutaties in KIT en NRAS kunnen beide routes activeren. Tevens is aangegeven waar de verschillende in dit artikel genoemde vormen van gerichte therapie, zoals nu beschikbaar zijn voor de behandeling van gemetastaseerde melanoompatiënten, aangrijpen (zie ook Tabel 1, pagina 282). De figuur maakt inzichtelijk dat MEK-remmers, vanwege het feit dat deze distaal aangrijpen in de MAP-kinasesignaaltransductieroute, effect kunnen hebben bij mutaties in verschillende genen in deze route. melanomen, 26 slijmvliesmelanomen, 23 uveale melanomen, 1 leptomeningeaal melanoom en 177 metastasen) werden geanalyseerd, bleken 44,9% van de melanomen een BRAF-mutatie te bevatten, waarvan 75,4% met een BRAF-V600E- en 24,6% met non-v600e-mutaties. 3 In de meerderheid van de casus (namelijk 86 cases; 17,2%) betreft dit een V600K-mutatie [c.1798_1799delinsaa (p.(val600lys))]. Dit is een deletie-insertie (delins)- mutatie, waardoor de eerste 2 nucleotiden van codon 600 (GTG) worden vervangen door de nucleotiden AA, hetgeen tot gevolg heeft dat het aminozuur valine op positie 600 wordt vervangen door een basisch aminozuur: lysine (K). Een voorbeeld hiervan staat in Figuur 2, pagina 285. Daarnaast zijn er andere di-nucleotide (delins)-mutaties ter plaatse van BRAF-codon 600, in exon 15, die aanwezig kunnen zijn in melanoom, te weten: c.1798_1799delinsag (p.(val600arg)), waarbij eveneens een basisch aminozuur Arg (R) op codon 600 ontstaat (V600R), of c.1799_1800delinsaa (p.(val- 600Glu)), een mutatie die net als een V600E-mutatie zorgt voor een aminozuurverandering tot glutaminezuur, maar wordt veroorzaakt door di-nucleotide (delins) in plaats van een mononucleotide mutatie, vandaar dat deze mutatie ook wel als V600E2 bekend staat. Een andere gevonden di-nucleotidemutatie is c.1799_1800delinsat (p.(val600asp)), waarbij een asparaginezuur (D) op codon 600 ontstaat (V600D). In genoemde studie kwamen de 3 laatste di-nucleotidemutaties in totaal bij 4,6% van de gevallen voor. In deze studie bleek ook een klein percentage melanomen een exon 11-mutatie te tonen, 283

Tabel 1. Overzicht van genmutatiefrequenties in diverse melanoomsubtypen. In verschillende studies is er wel enige variatie in gerapporteerde mutatiefrequenties. 2,3,22 Primaire locatie melanoom BRAF 7q34 NRAS 1p13.2 KIT 4q12 GNAQ 9p21 GNA11 19p13 chronische zonbeschadigde huid (lentigo maligna melanoom) 8% 15% 28% 1,4% 0 intermitterende aan zon blootgestelde huid 60% 22% 0%-zeer laag 0 0 acrolentigineus 22% 10% 23-36% 0 0 slijmvlies 3-11% 5-24% 16-39% 0 0 uvea 0% 0% 0% 45-50% 32% centraal zenuwstelsel 0% 0% (volwassenen) bij kinderen wel aanwezig (100%?) 19 0% 30% 17,18 (volwassenen) 30% 18 (volwassenen) gevoelig voor therapie met BRAFremmers MEKremmers Resistent voor BRAFremmers imatinib, nilotinib 20 sunitinib 21 dasatinib (preklinisch) MEKremmers (preklinisch) MEKremmers 0,4% van de casus, hetgeen 2 casus betreft. De casus hadden een verschillende exon 11-mutatie, in codon 466 en in codon 469. In geen van de slijmvlies-, uveaen leptomeningeale melanomen in deze studie werden BRAF-exon 15 of exon 11-mutaties gevonden. Ook 2 andere studies toonden in respectievelijk 138 en 183 melanomen en melanoommetastasen bij ongeveer 30% van de gevallen een niet-v600e-mutatie aan, merendeels een V600K-mutatie. 4,5 Aanvankelijk was er niet veel bekend over de gevoeligheid van niet-v600e-gemuteerde melanoompatiënten voor BRAF-remmers, waaronder vemurafenib, omdat patiënten met niet-v600e-mutaties veelal geëxcludeerd waren van studies. Er zijn inmiddels meerdere gegevens die aangeven dat ook patiënten met een niet-v600e-mutatie, zoals een V600K- of V600Rmutatie, reageren op BRAF-remmers, zoals vemurafenib en dabrafenib. 4,6,7 Klein en Menzies beschrijven beiden dat dabrafenib (GSK2118436) effectief is bij patiënten met een V600R- en V600K-mutatie. 6,8 Hierbij geeft de laatste studie aan dat dabrafenib ook effectief is bij breinmetastasen en minder toxiciteit geeft dan vemurafenib bij een vergelijkbare effectiviteit. In Figuur 1, pagina 283, staat een voorbeeld uit onze eigen praktijk, waarin een patiënte met een cutaan gemetastaseerd melanoom met een V600K-mutatie die met vemurafenib is behandeld en stabiel is. De gevoeligheid van V600D-gemuteerde melanomen voor BRAF-remmers is vooralsnog niet gerapporteerd. In celmodellen met een BRAF-V600E-, V600D- en V600R-mutatie is echter wel aangetoond dat vemurafinib, dosisafhankelijk, de productie van perk en pmek inhibeert. 9 Recentelijk is het onderzoeksrapport, uitgevoerd door de European Medicines Agency (EMA) betreffende de effectiviteit van vemurafenib bij volwassen melanoompatiënten verschenen. Op geleide van de bevindingen van deze studie wordt geadviseerd om alle melanoompatiënten met een V600-mutatie te behandelen met vemurafinib en behandeling niet te beperken tot de patiënten met een BRAF-V600E-mutatie. 10 Ontwikkelingen in behandeling van patiënten met kanker gaan snel. Er zijn inmiddels ook studies met combinaties van BRAF-remmers en MEK-remmers gaande, die minder toxiciteit vertonen. 11,12 Concluderend komt bij tot ongeveer 30% van de BRAF-gemuteerde melanoompatiënten een niet-v600e-mutatie voor; dit betreft ongeveer 10-15% van alle melanoompatiënten. Detectie van deze andere subtypen is relevant, omdat ook hier in het merendeel gevoeligheid voor BRAF-remmers is aange- 284

7 A B C Figuur 2. Subcutane melanoommetastase in de huid bij een vrouw die een superficieel spreidend melanoom had in 2005 op de borst links, met een Breslowdikte van 1 mm, zonder ulceratie, mitosen, satellieten of regressie. De subcutane metastasen op de thorax links en bil rechts werden palliatief verwijderd in 2012. Hiervan ziet u de histologie. A. HEkleuring 25 x met een diep subcutaan gelegen celrijke tumornodus omgeven door fibrose. B. HE-kleuring 400 x, een detail van de tumorcellen met duidelijke atypie en mitosen. C. De resultaten van de BRAF-mutatieanalyse door middel van PCR en Sanger sequencing : een BRAF c.1798-1799delinsaa (p.( Val600Lys))-mutatie (ook bekend als p. V600K) werd aangetoond. De patiënte is behandeld met vemurafenib en heeft stabiele ziekte. toond. Komende jaren zal moeten blijken hoe de gevoeligheid van de diverse varianten BRAF-mutaties is voor verschillende BRAF-remmers. Er is een multidisciplinair normeringsdocument opgesteld door de Stichting Oncologische Samenwerking (SON- COS), waarin kwaliteitsnormen zijn opgesteld voor de behandeling van diverse tumortypen, waaronder ook het melanoom, in Nederland (www.soncos.org). Voor het melanoom geldt onder andere dat zorg voor hematogeen gemetastaseerde melanoompatiënten die systeemtherapie krijgen, wordt gecentreerd in melanoomcentra en partners daarvan. Een voorwaarde is dat de melanoomcentra een register bijhouden van alle gemetastaseerde melanoompatiënten waarbij gegevens over kliniek, pathologie, moleculaire afwijkingen en therapie systematisch zullen worden geregistreerd. Naar verwachting zal dit een belangrijke bijdrage leveren aan een beter inzicht welke BRAF-gemuteerde patiënt baat heeft bij welke BRAF-remmende therapie. De recentelijk opgerichte Dutch Institute for Clinical Auditing (DICA), uitkomstregistratie melanomen (www.clinicalaudit.nl), vervult hier een belangrijke functie. Voorwaarde is wel dat het pathologieonderzoek, waarvan de BRAF-mutatieanalyse deel kan uitmaken, gedegen en volledig gebeurt. In het 285

normeringsdocument wordt dan ook gesteld dat de afdeling pathologie van een centrum beschikt over specifieke expertise op het gebied van melanoom en over alle benodigde technieken. Moleculaire BRAF-testen voor predictie van therapierespons: de juiste test op de juiste wijze Technologieën voor detectie van BRAF-mutaties Er zijn verschillende testen beschikbaar voor het aantonen van een BRAF-mutatie in melanoom. Tot op heden is er wereldwijd en ook in Nederland geen standaardprocedure. In de Verenigde Staten heeft de FDA de Cobas 4800 BRAF-V600-mutatietest goedgekeurd als begeleidende diagnostische test om BRAF-mutaties te detecteren. Grofweg zijn drie verschillende strategieën voor mutatiedetectie te onderscheiden. a. Technologieën waarbij volledige genen of exonen van genen worden geanalyseerd en waarbij identificatie van de exacte mutatie mogelijk is. Voorbeelden hiervan zijn Sanger - of Next Generation Sequencing (NGS)- technieken. Klassieke Sanger-sequentieanalyse is voor een laboratorium een universele technologie welke toepasbaar is voor mutatiedetectie van meerdere genen, niet alleen het BRAF-gen. Met behulp van Sangersequencing kunnen zowel hot-spot -mutaties, als ook andere mutaties (substituties, deleties, inserties) buiten de mutatie- hot-spot worden gedetecteerd. Het nadeel van Sanger-sequencing is dat deze beperkt sensitief is (alleldetectie van ongeveer 20%) en dat er voor elke sequentieanalyse een bepaalde hoeveelheid DNA nodig is. Pyrosequencing is sensitiever, kan ook mutante allelen kwantificeren en kan alle mutaties in een interessegebied detecteren. Ontwikkelingen in de NGS-technologie gaan zeer snel. Naast de geavanceerde NGS-instrumenten, waarmee de sequentie van totale genomen of exonen kan worden bepaald en welke nu nog lange tijd aan data-analyse in beslag nemen, zijn er ook relatief simpele NGS-instrumenten te verkrijgen, welke bij uitstek geschikt zijn voor sequentieanalyse van panels van genen. De 2 belangrijkste NGS-tafelmodellen zijn de Ion Torrent-Personalised Genome Machine (IT-PGM) en de Illumina MiSeq. Binnen ons Laboratorium Tumorgenetica is de IT-PGM inmiddels operationeel. De IT-PGM, 1 van de simpelere NGStechnologieën, maakt het mogelijk om gebruik makend van minder DNA (namelijk 10 ng per test) toch van een groot aantal genen tegelijkertijd de sequentie te bepalen, waarbij er een hogere detectiegevoeligheid dan traditionele Sanger-sequencing wordt bereikt, name- lijk ongeveer 5%. De technologie werkt uitstekend, ook voor DNA geëxtraheerd uit formaline-gefixeerd en in paraffine-ingebed weefsel ( paraffineblokjes ), dat standaard is binnen de pathologie. Implementatie van een dergelijke technologie in een laboratorium is geen sinecure. Daarnaast kunnen korte doorlooptijden en kosteneffectiviteit alleen worden gerealiseerd bij voldoende aanbod van samples. b. Technologieën die specifieke hot-spot -mutaties detecteren en een exacte identificatie van de mutatie geven. Voorbeelden van een dergelijke technologie hiervan zijn de BRAF Taqman Mutation Detection Assays en de OncoCarta panels Sequenom. De technologie van de BRAF TaqMan Mutation Detection Assay is gebaseerd op een competitieve allel-specifieke Taqmanassay voor elke mutatie. Deze technologie maakt gebruik van een locus-specifieke primer, een allelspecifieke primer die het mutante (V600E) allel detecteert, een allel-specifieke blocker (van het wildtype allel) en een gelabelde Taqman-probe. Een dergelijk assay kan specifiek en gevoelig een bepaalde mutatie zoals V600E detecteren. Additionele Taqmanassays zijn nodig voor de detectie van niet-v600emutaties. Elke assay gebruikt een minimale hoeveelheid DNA (ongeveer 100 pg per assay), hetgeen een nadeel is wanneer alleen kleine biopten met slechts minimale DNA-opbrengst beschikbaar zijn. De Sequenom-benadering is gebaseerd op PCR-amplificatie en primerverlenging en detectie van de specifieke mutaties via massaspectrometrie. Met de eerste OncoCarta Panel vs. 1.0 kunnen 238 verschillende mutaties van 19 genen worden geïdentificeerd, waaronder meer dan 20 verschillende BRAF-mutaties: zowel de BRAF- V600E- en de V600K-, V600R- en V600D-mutaties, als ook BRAF-exon 11-mutaties. Inmiddels is er ook een OncoCarta v1.0, MelaCarta beschikbaar waarbij 15 verschillende BRAF-mutaties gelegen in exon 15 en 11 kunnen worden gedetecteerd. De detectiegevoeligheid ligt rond 10% en de technologie werkt op DNA dat wordt geëxtraheerd uit gefixeerd en in paraffine ingebed weefsel. Het nadeel, met name in vergelijking met de Ion-Torrent PGM-technologie, is dat er relatief veel DNA nodig is voor een complete analyse (ongeveer 500 ng). c. Technologieën die geen exacte identificatie van de mutatie geven. Voorbeelden hiervan zijn High-Resolution Melting Analysis (HRMA) en de Cobas 4800 BRAF- V600-test. HRMA detecteert kleine verschillen in smelttemperaturen van amplificatieproducten, hetgeen een indicatie is voor de aanwezigheid van een mutatie. HRMA is een gevoelige techniek, echter het identificeren 286

7 van een mutatie vraagt een aanvullende analyse door bijvoorbeeld Sanger-sequencing, welke alleen mogelijk is bij een voldoende hoog tumorpercentage (40%). De Cobas 4800 BRAF-V600-test detecteert BRAF- V600E-mutaties zeer gevoelig, namelijk bij aanwezigheid van 5% gemuteerde allelen in het weefsel. 13 Belangrijke beperkingen van de test zijn de hoeveelheid input van DNA (125 ng) en de beperkte detectiemogelijkheid van de V600K- en V600D-mutaties. Meerdere studies tonen aan dat de gevoeligheid van detectie van de V600K- en V600D- ten opzichte van de V600Emutatie aanzienlijk lager is, waardoor potentieel behandelbare BRAF-V600-gemuteerde melanoompatiënten zullen worden gemist bij uitsluitend gebruik van deze test. 14 Daarnaast geeft deze test geen informatie betreffende de specifieke mutatie die is gedetecteerd, waardoor uiteindelijk het inzicht in welke patiënten met welke BRAF-mutatie goed reageren op specifieke remmers beperkt is. BRAF-testen in de juiste context Bij het testen van BRAF is een goede interactie tussen aanvrager, patholoog en klinisch moleculair bioloog noodzakelijk. Daarnaast is het belangrijk dat de moleculaire test wordt uitgevoerd binnen een CCKL-geaccrediteerd laboratorium voor moleculaire pathologie dat ook voldoet aan de kwaliteitseisen van de beroepsvereniging. Uiteraard dient het moleculair diagnostisch laboratorium dat de test uitvoert te participeren in externe kwaliteitsrondzendingen en daar goede resultaten te behalen. Enkele specifieke zaken worden hierbij nog nader uitgewerkt: De moleculaire test vindt plaats binnen een setting waarbij een patholoog werkzaam is die ervaren is in melanoomdiagnostiek en die voldoende zicht heeft op de mogelijkheden en valkuilen van de moleculaire diagnostiek. De patholoog bevestigt door de weefselcontrole vooraf aan de moleculaire test de diagnose melanoommetastase, tekent het tumorweefsel af voor de analist ten behoeve van tumordissectie en bepaalt het tumorcelpercentage. Daarnaast kan de patholoog op geleide van de voorgeschiedenis mede bepalen of BRAF-testen zinvol zijn (niet bij primair oog- of centraalzenuwstelselmelanoom: zie ook Tabel 1, pagina 284) en op geleide hiervan eventueel moleculair testen uitbreiden voor andere behandelbare mutaties, nu nog in studieverband, zoals KIT of NRAS. In het moleculaire pathologielaboratorium zijn klinischmoleculaire biologen en goed opgeleide moleculair- diagnostische analisten verantwoordelijk voor de uitvoering, analyse, interpretatie en vastlegging van de moleculaire testresultaten. Een goede interactie tussen patholoog en klinisch-moleculair bioloog is noodzakelijk om de diagnostiek zo gericht en optimaal mogelijk te kunnen inzetten. Een moleculair verslag voldoet aan de aanbevelingen zoals gedaan in Groot-Brittannië en zijn conform de richtlijnen zoals opgesteld door de Nederlandse Werkgroep voor moleculaire pathologie (www.moleculairepathologie.nl/richtlijnen.html). 13 De volgende zaken worden vastgelegd in het moleculair verslag: het weefselblokje dat is getest, het tumorpercentage en de beoordelaar daarvan, de gebruikte moleculaire testmethode en waar mogelijk de detectiegevoeligheid van de test, de genen die zijn getest en welke exonen of mutaties zijn getest, de beschrijving van de eventueel aanwezige mutatie volgens de Human Genome Variation Society -nomenclatuur en de interpretatie van de moleculaire gegevens. Een moleculaire BRAF-test wordt uitgevoerd wanneer op basis van de kliniek BRAF-remmers een therapeutische mogelijkheid zijn. Dit betreft momenteel de groep van niet-operabele gemetastaseerde melanoompatiënten die snel progressief zijn. De internist-oncoloog zal over het algemeen degene zijn die de patholoog zal vragen om een BRAF-test te verrichten, aangezien deze het klinisch beeld en progressie daarvan kent. De moleculaire test wordt bij voorkeur gedaan op een op dat moment aanwezige en te behandelen metastase. Hiervoor zijn 2 belangrijke argumenten. Ten eerste wordt zo de diagnose melanoommetastase met zekerheid histologisch bevestigd. Ten tweede is er aanzienlijke tumorheterogeniteit en is in 15% van de gevallen een discrepantie in mutatiestatus tussen het primaire melanoom en de bijbehorende metastase beschreven. 15 Hierbij is in de helft van de gevallen het primaire melanoom wildtype voor BRAF en NRAS, terwijl de metastase wel een mutatie heeft. In de andere helft is de primaire tumor gemuteerd, maar de metastase niet, of heeft het primaire melanoom een andere mutatie dan de metastase. De moleculaire diagnostische test is gevalideerd. Validatie dient gedegen te gebeuren vooraf aan implementatie in de diagnostiek door het testen van samples waarvan de mutatiestatus en tumorload bekend zijn, als ook het testen van de gevoeligheid van de test. Vergelijkbare aanbevelingen zijn recentelijk ook gedaan in Groot-Brittannië. 13 Het is naar onze mening niet ethisch verantwoord een niet-gevalideerde test te gebruiken in een diagnostiek- 287

Aanwijzingen voor de praktijk 1. Een BRAF-test wordt verricht bij gemetastaseerd melanoom indien BRAF-remmers therapeutisch worden overwogen. 2. Een BRAF-test is alleen zinvol bij metastasen van primaire melanomen van de huid en in beperkte mate bij primair slijmvliesmelanoom. BRAF-testen bij metastasen van primair uvea- of centraalzenuwstelselmelanoom is niet zinvol. 3. Bij voorkeur wordt een aanwezige metastase en niet het primaire melanoom getest in verband met heterogeniteit (discrepantie in mutatiestatus tussen het primaire melanoom en metastasen). 4. De aangewende BRAF-test dient alle relevante en voor BRAF-remmers gevoelige BRAF-mutaties te detecteren (tot ongeveer 30% betreft een niet-v600e-mutatie). 5. De gebruikte BRAF-test dient gevalideerd te zijn. 6. Ten behoeve van nationale registratie dient de uitslag van de moleculaire test een exacte omschrijving van de aangetoonde BRAF-mutatie te geven. setting met het risico dat de patiënt onnodig opnieuw moet worden gebiopteerd. Tot aan validatie dient de test te worden uitbesteed aan een laboratorium dat de test wel lege artis heeft gevalideerd. De moleculaire test identificeert de specifieke BRAFmutatie. Gezien eerder geschetste bevindingen waarbij is gebleken dat niet-v600e-braf-mutaties in een substantieel, tot ongeveer 30% van de melanoompatiënten, voorkomen en deze mutaties ook gevoelig zijn voor therapie met BRAF-remmers. Daarom is het essentieel dat er een test wordt gebruikt waarbij alle relevante BRAF-V600- mutaties worden gedetecteerd en geïdentificeerd. Een HRMA-test of de Cobas 4800 BRAF-V600-test voldoen hier niet aan. Immuunhistochemie heeft soortgelijke beperkingen als de Cobas 4800 BRAF-V600-test. Ook door middel van immuunhistochemie worden alleen patiënten met een V600E-mutatie gedetecteerd. 16 Beide zouden wel kunnen worden gebruikt als snelle prescreening bij sterk progressieve patiënten. De vraag is echter of dit kosteneffectief is. Een korte doorlooptijd van de moleculaire test is essentieel. Gezien de vaak snelle progressie van patiënten is een beperkte doorlooptijd tot ongeveer 5 werkdagen vanaf het moment van ontvangst van het materiaal tot aan het autoriseren en versturen van de uitslag een realistisch tijdspad. Het uiteindelijke moleculaire verslag wordt in Nederland geïntegreerd in het pathologieverslag, zodat de testuitslag landelijk inzichtelijk is via het Uniforme Decentrale PALGA-Systeem (UDPS), de verslag- en com- municatiemodule voor pathologielaboratoria van de Stichting PALGA in Nederland. Conclusie Concluderend kunnen we stellen dat een test op de aanwezigheid van een BRAF-mutatie bij gemetastaseerd melanoom met verstand van zaken op het juiste moment en op het meest ge-eigende materiaal moet worden ingezet om patiënten optimaal te kunnen selecteren voor een eventuele behandeling met BRAF-remmers. In dit artikel hebben wij aangegeven dat er melanomen zijn waarin BRAF-mutaties niet voorkomen en waarin derhalve BRAF-testen niet zinvol zijn, dat er meer dan 1 BRAF-mutatie is die gevoelig is voor BRAF-remmers, dat er meerdere BRAF-remmers zijn en dat er een scala aan BRAF-testen is, elk met hun eigen voor- en nadelen. Het is van belang dat alle spelers betrokken in de melanoomzorg goed op de hoogte zijn van de mogelijkheden en beperkingen van de verschillende testen. In het kader van centralisatie en registratie van zorg voor gemetastaseerde melanoompatiënten, zoals die nu plaatsvindt in Nederland, is het van belang dat de voor BRAF-remmers relevante BRAF-mutaties worden getest en goed worden geregistreerd, zodat we te zijner tijd therapie-effecten goed kunnen evalueren en behandelingen nader kunnen optimaliseren. Referenties 1. Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002;417:949-54. 2. Whiteman DC, Pavan WJ, Bastian BC. The melanomas: a synthesis of 288

7 epidemiological, clinical, histopathological, genetic, and biological aspects, supporting distinct subtypes, causal pathways, and cells of origin. Pigment Cell Melanoma Res 2011;24:879-97. 3. Greaves WO, Verma S, Patel KP, et al. Frequency and spectrum of BRAF mutations in a retrospective, single-institution study of 1112 cases of melanoma. J Mol Diagn 2013;15:220-6. 4. Rubinstein JC, Sznol M, Pavlick AC, et al. Incidence of the V600K mutation among melanoma patients with BRAF mutations, and potential therapeutic response to the specific BRAF inhibitor plx4032. J Transl Med 2010;8:67. 5. Amanuel B, Grieu F, Kular J, et al. Incidence of BRAF p.val600glu and p.val600lys mutations in a consecutive series of 183 metastatic melanoma patients from a high incidence region. Pathology 2012;44:357-9. 6. Klein O, Clements A, Menzies AM, et al. BRAF inhibitor activity in V600R metastatic melanoma. Eur J Cancer 2012;49;1073-9. 7. Chapman PB, Hauschild A, Robert C, et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N Engl J Med 2011; 364:2507-16. 8. Menzies AM, Long GV, Murali R. Dabrafenib and its potential for the treatment of metastatic melanoma. Drug Des Devel Ther 2012;6:391-405. 9. Yang H, Higgins B, Kolinsky K, et al. Rg7204 (plx4032), a selective BRAF V600E inhibitor, displays potent antitumor activity in preclinical melanoma models. Cancer Res 2010;70:5518-27. 10. Da Rocha Dias S, Salmonson T, et al. The European medicines agency review of vemurafenib (zelboraf(r)) for the treatment of adult patients with BRAF V600 mutation-positive unresectable or metastatic melanoma: summary of the scientific assessment of the committee for medicinal products for human use. Eur J Cancer 2013;49:1654-61. 11. Kwong LN, Davies MA. Targeted therapy for melanoma: rational combinatorial approaches. Oncogene 2013:1-9. 12. Kudchadkar RR, Smalley KS, Glass LF, et al. Targeted therapy in melanoma. Clin Dermatol 2013;31:200-8. 13. Gonzalez D, Fearfield L, Nathan P, et al. BRAF mutation testing algorithm for vemurafenib treatment in melanoma: recommendations from an expert panel. Br J Dermatol 2013;168:700-7. 14. Halait H, Demartin K, Shah S, et al. Analytical performance of a real-time pcr-based assay for V600 mutations in the BRAF gene, used as the companion diagnostic test for the novel BRAF inhibitor vemurafenib in metastatic melanoma. Diagn Mol Pathol 2012;21:1-8. 15. Colombino M, Capone M, Lissia A, et al. BRAF/NRAS mutation frequencies among primary tumors and metastases in patients with melanoma. J Clin Oncol 2012;30:2522-9. 16. Long GV, Wilmott JS, Capper D, et al. Immunohistochemistry is highly sensitive and specific for the detection of V600E BRAF mutation in melanoma. Am J Surg Pathol 2013;37:61-5. 17. Kusters-Vandevelde HV, Klaasen A, Kusters B, et al. Activating mutations of the GNAQ gene: a frequent event in primary melanocytic neoplasms of the central nervous system. Acta Neuropathol 2009;119:317-23. 18. Gessi M, Hammes J, Lauriola L, et al. GNA11 and NRAS mutations: alternatives for MAPK pathway activating GNAQ mutations in primary melanocytic tumours of the central nervous system. Neuropathol Appl Neurobiol 2013;39:417-25. 19. Pedersen M, Küsters-VandeVelde HV, Viros A, et al. Primary melanoma of the CNS in children in driven by congenital expression of oncogenic NRAS in melanocytes. Cancer Discov 2013;3:458-69. 20. Tran A, Tawbi HA. A potential role for nilotinib in KIT-mutated melanoma. Expert Opin Investig Drugs 2012;21:861-9. 21. Minor DR, Kashani-Sabet M, Garrido M, et al. Sunitinib therapy for melanoma patients with kit mutations. Clin Cancer Res 2012;18:1457-63. 22. Lovly CM, Dahlman KB, Fohn LE, et al. Routine multiplex mutational profiling of melanomas enables enrollment in genotype-driven therapeutic trials. PLoS One 2012;7:e35309. Ontvangen op 8 mei 2013, geaccepteerd op 21 augustus 2013. 289