VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Goedgekeurd door Approuvée par I-MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen in specifieke levensmiddelen Détermination de vitamines liposolubles dans denrées alimentaires spécifiques Vitamines A, D, E HPLC Levensmiddelen (Voedingssupplementen) Denrées alimentaires (Suppléments alimentaires) Totaal Totale Secundair Secondaire Mini-validatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Datum - Date: 2011-12-15 Naam Nom: Mandy Lekens Functie - Fonction: Labomanager Datum - Date: 2011-12-17 Handtekeningen - Signatures: (get.) Handtekeningen - Signatures: (get.) LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 1/12
Stap Phase 1: Bepaling van het toepassingsgebied Déterminer le champs d application De methode moet geschikt zijn voor de kwantitatieve bepaling van de vetoplosbare vitamines A, D en E in voedingssupplementen. Het gehalte aan deze vitamines is relatief hoog voor voedingssupplementen en bedraagt gewoonlijk 1000 tot 3000 IE retinol (Vitamine A), 100 tot 300 IE calciferol (Vitamine D) en/of 8 tot 12 mg alfa-tocoferol equivalenten (Vitamine E) per dagelijkse dosis. Het werkgebied zal zo opgesteld worden dat de courante concentraties voor beide matrices probleemloos kunnen gemeten worden en kritische concentraties niet helemaal aan de uitersten van het werkgebied liggen. Stap Phase 2: Doel en statuut van de analysemethode Le but et status de la méthode d analyse Kwantitatieve bevestigingsmethode, afgeleide methode gebaseerd op Verordening 2009/152/EG (Bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders) en EN12821 (Foodstuffs - Determination of vitamin D by high performance liquid chromatography). Stap Phase 3: Keuze validatieparameters Choisir les paramètres à valider Voor deze methode worden de volgende prestatiekenmerken bepaald: lineariteit en werkgebied, bepaalbaarheidsgrens en aantoonbaarheidsgrens, specificiteit en selectiviteit, juistheid en terugvinding, precisie, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid (intra-) en robuustheid. Stap Phase 4: Externe eisen voor validatieparameters Des exigences externes pour les paramètres à valider Nvt. Stap Phase 5: Keuze van de monsters Le choix d échantillons Gecertificeerd referentiemateriaal dat een grote gelijkenis met praktijkmonsters vertoont: Multivitamin/Multielement tablets: NIST Standard Reference Material (SRM) 328 LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 2012-03-15 2/12
VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaption I-MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen in specifieke levensmiddelen Détermination de vitamines liposolubles dans denrées alimentaires spécifiques Vitamines A, D, E HPLC Levensmiddelen (Voedingssupplementen) 2013/01/30 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 3/12
Overzicht van de prestatiekenmerken: o Zie paragraaf 3 De validatie voldoet aan procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: o Zie paragraaf 3.2 en 3.3 (zowel juistheid als precisie bepaald op minstens 1 niveau)) Historiek validatie Versie Herziening door/datum Reden van herziening Wijzigingen 01 12/2012, M. Vanbrabant Opsteller initiële versie Volledige tekst 01 01/2013, M. Vanbrabant BELAC audit 12/2012 en voorbereiding publicatie (geen versie wijziging) Toevoeging validatieplan en overzicht validatierapport + historiek LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/12
VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par I-MET-FLVVT-143 Bepaling van vetoplosbare vitaminen in specifieke levensmiddelen Détermination de vitamines liposolubles dans denrées alimentaires spécifiques Vitamines A, D, E HPLC Levensmiddelen (Voedingssupplementen) Totaal Totale Secundair Secondaire Mini-validatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie - Fonction: Verantwoordelijke sectie Handtekeningen - Signatures: toevoegingsmiddelen (get.) Datum - Date: 2012-12-10 Johan Vandenbempt : laborant Jean-Pierre De Lannoy : laborant Nele Maris : laborant Martine Bral: laborant Annemie Voets: laborant Start - Début: 03-2012 Einde - Fin: 12-2012 Naam Nom: Mandy Lekens Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Labomanager (get.) Datum - Date: 2012-12-07 Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 5/12
SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS RÉSUMÉ DES DONNÉES DE VALIDATION... 7 1 DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED... 7 2 ANALYSEMETHODE EN ANALISTEN... 7 3 PRESTATIEKENMERKEN... 7 3.1 LINEARITEIT EN WERKGEBIED... 7 3.2 PRECISIE... 8 3.2.1 Herhaalbaarheid (%RSD r ) en intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw )... 8 3.2.1.1 Voedingssupplementen (NIST SRM 3280)... 8 3.3 JUISTHEID... 10 3.3.1 Voedingssupplementen (NIST SRM 3280)... 10 3.4 AANTOONBAARHEIDSGRENS (LOD) EN BEPAALBAARHEIDSGRENS (LOQ)... 10 3.4.1 Vitamine A... 10 3.4.2 Vitamine D... 10 3.4.3 Vitamine E... 11 3.5 SPECIFICITEIT EN SELECTIVITEIT... 11 3.6 REPRODUCEERBAARHEID (INTER)... 11 3.7 ROBUUSTHEID... 11 4 MEETONZEKERHEID... 11 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 6/12
Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation 1 Doel en toepassingsgebied Kwantitatieve bepaling van vitamines A, D en E met behulp van een afgeleide HPLC-methode. Het gehalte aan deze vitamines is relatief hoog voor voedingssupplementen en bedraagt gewoonlijk 1000 tot 3000 IE retinol (Vitamine A), 100 tot 300 IE calciferol (Vitamine D) en/of 8 tot 12 mg alfa-tocoferol equivalenten (Vitamine E) per dagelijkse dosis. Cholecalciferol (Vitamine D3) en ergocalciferol (Vitamine D2) worden nooit samen toegevoegd aan een supplement en worden in de loop van het validatiedossier beide bepaald om de geschiktheid van de methode voor beide componenten aan te tonen. 2 Analysemethode en analisten I-MET-FLVVT-143, versie 01 en 02. Het validatieonderzoek werd uitgevoerd onder toezicht van sectieverantwoordelijke Mieke Vanbrabant (2012) door de volgende analisten: Martine Bral Annemie Voets Nele Maris Johan Vandenbempt Jean-Pierre De Lannoy Alle bepalingen gebeurden op HPLC keten 7. 3 Prestatiekenmerken Ruwe gegevens: Zie bijlage. 3.1 Lineariteit en werkgebied Een ijklijn in solvent en een ijklijn in matrix werden opgesteld op basis van 5 concentratieniveaus (3 maal). De geschiktheid van het lineair model voor beide ijklijnen werd bewezen aan de hand van het statistisch verwerkingsprogramma Statgraphics (Regressie-analyse, Lack-of-fit test). Een Statgraphics vergelijking tussen de ijklijn in solvent en de ijklijn in matrix werd uitgevoerd om aan te tonen dat er geen significant verschil bestaat tussen de ijklijn in solvent en de ijklijn in matrix (Comparison of regression lines). In dit geval wordt er bijgevolg verder gewerkt met een ijklijn in solvent. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 7/12
Het werkgebied wordt gekozen in functie van de meest voorkomende doseringsgehaltes en ligt tussen: Vitamine A : 1,25 10 IE/ml Vitamine D : 22 176 IE/ml Vitamine E : 5 40 µg/ml Aangezien voedingssupplementen gewoonlijk hoge gehaltes aan vitamines bevatten, worden de extracten verdund tot de concentratie van het gewenste vitamine binnen de grenzen van het werkgebied valt. 3.2 Precisie 3.2.1 Herhaalbaarheid (%RSD r ) en intralaboratoriumreproduceerbaarheid (%RSD Rw ) Voor deze bepaling werd er volgens de validatieprocedure gebruik gemaakt van Excel-template LAB 00 P 180 F 004. 3.2.1.1 Voedingssupplementen (NIST SRM 3280) 3.2.1.1.1 Vitamine A FLVVT Horwitz %RSD r 7,79 %RSD r max = 4,26 %RSD Rw 8,75 %RSD Rw max = 6,39 Herhaalbaarheid r (IE/kg) 321000 Reproduceerbaarheid R (IE/kg) 361000 Evaluatie: Het gecertificeerde gehalte aan vitamine A voor SRM 3280 bedraagt 444 +/- 46 mg/kg, dit komt overeen met 1480000 +/- 153000 IE/kg, wat een relatief hoog gehalte is. Zowel herhaalbaarheid (%RSD r ) als intralaboratorium-reproduceerbaarheid (%RSD Rw ) is niet kleiner dan of gelijk aan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz. Gezien de extreem hoge gevoeligheid van vitamine A voor afbraak door oxidatie, is het bijna niet mogelijk om de strikte Horwitz maxima toe te passen. Daarom werden er meerdere bepalingen uitgevoerd, waarvan er 31 van de 36 bepalingen binnen het interval vallen, bepaald door de gemiddelde waarde rekening houdend met de meetonzekerheid. Bovendien is zowel %RSD r / %RSD r max als %RSD Rw / %RSD Rw max groter dan 2, wat op een aanvaardbare variantie wijst. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 8/12
3.2.1.1.2 Vitamine D2 FLVVT Horwitz %RSD r 4,29 %RSD r max = 7,64 %RSD Rw 7,37 %RSD Rw max = 11,46 Herhaalbaarheid r (IE/kg) 43100 Reproduceerbaarheid R (IE/kg) 74100 Evaluatie: Voor vitamine D2 is zowel herhaalbaarheid (%RSD r ) als intralaboratorium-reproduceerbaarheid (%RSD Rw ) is kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz. 3.2.1.1.3 Vitamine D3 FLVVT Horwitz %RSD r 5,54 %RSD r max = 8,37 %RSD Rw 5,54 %RSD Rw max = 12,56 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 32900 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 32900 Evaluatie: Voor vitamine D3 is zowel herhaalbaarheid (%RSD r ) als intralaboratorium-reproduceerbaarheid (%RSD Rw ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz. 3.2.1.1.4 Vitamine E FLVVT Horwitz %RSD r 2,31 %RSD r max = 2,38 %RSD Rw 4,74 %RSD Rw max = 3,57 Herhaalbaarheid r (mg/kg) 1300 Reproduceerbaarheid R (mg/kg) 2660 Evaluatie: Voor vitamine E is enkel de herhaalbaarheid (%RSD r ) kleiner dan de maximaal toegelaten waarde volgens de vergelijking van Horwitz, in tegenstelling tot de intralaboratorium-reproduceerbaarheid (%RSD Rw ). %RSD Rw / %RSD Rw max is echter groter dan 2, wat op een aanvaardbare variantie wijst LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 9/12
3.3 Juistheid Bij herhaalde analyses van een monster moet het resultaat liggen tussen 75 en 125% van het belaste of gecertificeerde gehalte. 3.3.1 Voedingssupplementen (NIST SRM 3280) De juistheid voor de matrix voedingssupplementen werd bepaald aan de hand van een standaard referentiemateriaal (SRM 3280). Alle waarden voldoen aan de vooropgestelde voorwaarde. Vitamine Juistheid (%) A 96,76 D2 97,78 D3 105,83 E 96,68 3.4 Aantoonbaarheidsgrens (LOD) en bepaalbaarheidsgrens (LOQ) De LOD en LOQ worden berekend op basis van de signaal-ruisverhouding (S/N). Voor de LOD dient S/N 3 te zijn; voor de LOQ is S/N 6. Indien S/N 30, dienen de aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens niet bepaald te worden (De Ware(n) Chemicus). 3.4.1 Vitamine A Voor de bepaling van de LOD en LOQ werden 6 deelmonsters belast op 1000 IE/kg en vervolgens geanalyseerd. De signaal/ruis-verhouding (S/N) bedroeg gemiddeld meer dan 30 en de concentratie bedroeg gemiddeld 1040 IE/kg. Aangezien S/N groter is dan 30, dienen de aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens niet bepaald te worden. Gezien de hoge concentraties aan vitamine A in voedingssupplementen, wordt 1000 IE/kg aangenomen als rapporteringsgrens. 3.4.2 Vitamine D Voor de bepaling van de LOD en LOQ werden 6 deelmonsters belast op 5000 IE/kg en vervolgens geanalyseerd. De signaal/ruis-verhouding (S/N) bedroeg gemiddeld 28,3 en de concentratie bedroeg gemiddeld 5210 IE/kg. Gezien de hoge concentraties aan vitamine D in voedingssupplementen, wordt 5000 IE/kg aangenomen als rapporteringsgrens. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 10/12
3.4.3 Vitamine E Voor de bepaling van de LOD en LOQ werden 6 deelmonsters belast op 1 mg/kg en vervolgens geanalyseerd. De signaal/ruis-verhouding (S/N) bedroeg gemiddeld meer dan 30 en de concentratie bedroeg gemiddeld 1,07 mg/kg. Aangezien S/N groter is dan 30, dienen de aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens niet bepaald te worden. Gezien de hoge concentraties aan vitamine E in voedingssupplementen, wordt 1 mg/kg aangenomen als rapporteringsgrens. 3.5 Specificiteit en selectiviteit De piekidentificatie gebeurt aan de hand van de retentietijd. De piekkwantificatie gebeurt aan de hand van de piekoppervlakte. 3.6 Reproduceerbaarheid (Inter) Deelname aan ringtesten indien mogelijk. 3.7 Robuustheid Langetermijnsvalidatie zal uitgevoerd worden op basis van Shewart-controlekaarten (trendanalyse). 4 Meetonzekerheid De meetonzekerheid van de methode wordt berekend, rekening houdend met de juistheid en precisie. Vitamine A D E Uitgebreide Uitgebreide Uitgebreide Niveau Concentratie relatieve Concentratie relatieve Concentratie relatieve (IE/kg) meetonzekerheid U (IE/kg) meetonzekerheid (mg/kg) meetonzekerheid (%) U (%) U (%) Midden 1500000 22,0 200000 23,7 21000 15,2 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 11/12
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 12/12