In Situ Hybridisatie in de routine pathologie diagnostiek Winand Dinjens Afdeling Pathologie Josephine Nefkens Instituut (JNI) Erasmus MC, Rotterdam Pathologendagen; 11 april 2007, Ede
In Situ Hybridisatie (ISH): * Methode om nucleïne zuren (DNA en RNA) zichtbaar te maken in hun natieve locatie in de cel (in situ) * Gebaseerd op de affiniteit die complementaire DNA of RNA strengen voor elkaar hebben (hybridisatie) en het zichtbaar maken van die interactie
In Situ Hybridisatie (ISH): * Vorm van affiniteits cyto/histochemie : Immunocyto/histochemie: specifieke interactie antilichaam - antigeen In situ hybridisatie: specifieke interactie probe target DNA/RNA (hybridisatie) en het zichtbaar maken van die interacties
In Situ Hybridisatie (ISH, FISH)
Single copy gene FISH #18q, probes centro- and telomeric SYT gene
Chromosome copy number determination # 1 centromere probe CISH
RNA-ISH Seminal Vesicle Secreted Protein 2 35 S-probe Dig-probe
In Situ Hybridisatie (ISH): * Vorm van affiniteits cyto/histochemie : Target DNA DNA RNA RNA Probe DNA RNA DNA RNA
In Situ Hybridisatie (ISH): Vorm van affiniteits cyto/histochemie : * Weefselcoupe (vries of routine paraffine) * Weefsel toegankelijk maken (paraffine: digestie) * Denaturatie van de in situ target (enkelstrengs maken) * Enkelstrengs probe(s) toevoegen * Incuberen (hybridiseren) * Wassen, interactie zichtbaar maken (vgl IHC)
In Situ Hybridisatie (ISH): Vorm van affiniteits cyto/histochemie : * Interactie van probe met target DNA of RNA zichtbaar maken (vgl IHC) - Fluorescent label: FISH (FITC, TRITC, SpectrumGreen, SpectrumOrange Texas red etc) - Chromogeen: CISH (PO, AP, Silver)
In Situ Hybridisatie (ISH): FISH CISH Morfologie - + Overlappende kernen - + Out of focus - + Autofluorescentie - + Evaluatietijd - + Houdbaarheid - + Speciale microscoop - + Gevoeligheid + - Multiple probes + -
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek * Virus detectie (DNA of RNA) * Numerieke chromosomale afwijkingen * Chromosomale translocaties (lymfomen en sarcomen) * Gen-amplificatie/deleties
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek * Virus detectie (DNA of RNA)
EBV RNA ISH EBER
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek * Numerieke chromosomale afwijkingen - Mola diagnostiek (triploidie) - weefselverwisseling - Blaaskanker (recurrence) Urovision: p16 probe en chromosoom 3, 7 en 17
Chromosome copy number determination Complete mola, # 1 ISH
Chromosome copy number determination Partial mola, # 1 ISH
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek * Chromosomale translocaties - Lymfomen: Burkitt (like): Diffuse large B-cell: Folliculair: Mantel cell: MALT: t(14;18) t(8;14), t(14;18) t(14;18) t(11;14) t(11;18)
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek * Chromosomale translocaties -Sarcomen: Synoviosarcoma: t(x;18) Alveolair Rhabdomyo: t(2;13), t(1;13) Ewing s/pnet: t(11;22), t(21;22), t(7;22) t(17;22), t(2;22) Myxoid liposarcoom: t(12;16), t(12;22)
Dual-fusion probes Beide fusiepartners bekend
a Dual-fusion probes
1 fusiepartner (breuk) bekend
Dual color break-apart probes 1 fusiepartner (breuk) bekend
Chromosome translocation (break) FKHR Break Apart Probe 13q14 Region Centromere 13q14 region Telomere SHGC-142993 SHGC-79327 RH98592 RH93960 D13S320 RH26447 RH45465 FKHR 3 5 ELF1 ~720 kb ~650 kb
Dual Color Break Apart FKHR Normal Abnormal
In Situ Hybridisatie (ISH): Toepassing in de routine pathologie diagnostiek * Gen-amplificatie - Her2/neu (17q11), mamma - EGFR (7p12), long - C-MYC (8q24), prostaat * Deleties - PTEN (10q23), gliomen - 1p36/19q13, gliomen - P16 (9p21), blaas
In Situ Hybridisatie (ISH) in de routine pathologie diagnostiek: Succes van Her2 FISH en CISH: - procedure robuust - detectie amplificatie -kit format - klinische impact -incidentie
ISH in de pathologie diagnostiek: Problemen: - over/onder digestie (fixatie) - weefselarchitectuur - interpretatie (vals pos/neg), getrunceerde kernen (deleties), break-aparts - genoom van kanker cel (zeer) complex CONTROLES: procedure, neg/pos, binnen zelfde coupe, externe QC (werkgroep rondzendingen, SKKP)
In Situ Hybridisatie (ISH) in de routine pathologie diagnostiek: Toekomst: - betere toegangkelijkheid paraffine - meer kits - multicolor combinatie IF-FISH - multiple targets (Urovision) - meer translocaties (carcinomen) - automatisering (procedure en evaluatie)