Het referentielaboratorium verantwoordelijk voor de bestudering van de resistentie tegen aminoglycosiden bevindt zich op het WIV - Departement Pasteur Instituut in Brussel. worden nog steeds veelvuldig gebruikt in het ziekenhuismilieu. Toxiciteit en de ontwikkeling van resistentie zijn de belangrijkste factoren die hun klinische bruikbaarheid beperken. Resistentie tegen aminoglycosiden kan te wijten zijn aan een (i) ribosomiale mutatie, (ii) de aanwezigheid van aminoglycoside-modificerende enzymen (AME), (iii) een verminderde opname en aan (iv) een verhoogde efflux van aminoglycosiden. AME-resistentie is veruit het belangrijkste mechanisme omdat de genetische determinanten meestal plasmide- of transposongebonden zijn. Dit laatste verklaart de belangrijke disseminatie van deze genen bij zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën. bevatten in hun structuur amino- en hydroxylgroepen die enzymatisch geacetyleerd, gefosforyleerd en genucleotidyleerd kunnen worden. De enzymen die deze activiteit uitvoeren zijn dus aminoglycoside-n-acetyltransferasen (AAC), aminoglycoside-o-fosforyltransferasen (APH) en aminoglycoside-o-nucleotidyltransferasen (ANT). Deze drie groepen van enzymen worden nog verder ingedeeld in functie van de plaats van het C-atoom met de amino- of hydroxylgroep die gemodificeerd wordt door het enzym. De plaats van de modificatie wordt na de afkorting van het enzym tussen haakjes weergegeven door een cijfer. Verder kunnen de enzymen van een bepaalde groep nog worden onderscheiden op basis van het substraatprofiel. Deze subtypes worden weergegeven door een Romeins cijfer na het enzymtype en de plaats van modificatie : APH(3')-I, APH(3')-II, APH(3')-III, APH(3')-VI, APH(3')-V, APH(3')-IV. Ten slotte kunnen bepaalde enzymen worden gecodeerd door verschillende genen en de specificatie van dit gen wordt in de regel weergegeven door een kleine letter na het enzymtype, bijv. aac(6')ia, aac(6')ib, aac(6')ic, aac(6')if, aac(6')ig, enz. Analysen verricht in het kader van het referentiecentrum In 2004 ontving het referentiecentrum 76 stammen voor onderzoek naar de aanwezigheid van een resistentiemechanisme. In tabel 1 staat de geografische herkomst van de 76 stammen op basis van de postcode van de patiënten. Tabel 1 : : geografische herkomst van de stalen (N; 2004) Lokalisatie Aantal stalen Lokalisatie Aantal stalen Sint-Truiden 16 Genk 1 Brasschaat 12 Gingelom 1 Kapellen 5 Herk de Stad 1 Kalmthout 4 Herentals 1 Essen 3 Meer 1 Nieuwerkerke 3 Meeuwen-Gruitrode 1 Stabroek 3 Mol 1 Ekeren 2 Pepingen 1 Antwerpen 1 Schoten 1 Berlaer 1 Velm 1 Couvin 1 Zoutleeuw 1 Deurne 1 Onbekend 12 Diest 1 amino_tab1 In totaal betrof het dus 76 stammen waarvan 30 Enterobacteriaceae (39,5%), 30 Pseudomonas aeruginosa of andere nietfermenters (39,5%) en 16 Staphylococcus aureus (21,0%) (tabel 2). Tabel 2 : : overzicht van de micro-organismen (N; 2004) Kiemen Aantal Kiemen Aantal Enterobacteriaceae 30 Pseudomonas en non-fermenters 30 Escherichia coli 15 Pseudomonas aeruginosa 14 Proteus mirabilis 10 Stenotrophomonas maltophilia 10 Serratia marcescens 2 Pseudomonas sp. 2 Enterobacter cloacae 1 Acinetobacter baumannii 1 Enterobacter aerogenes 1 Achromobacter xylosoxidans 1 Morganella morganii 1 Burkholderia cepacia 1 Pseudomonas putida 1 Gram positieve kokken 16 Staphylococcus aureus 16 amino_tab2 1
Urine (38,2%) en sputum (31,6%) waren de meest voorkomende stalen (tabel 3). Tabel 3 : : overzicht van de afgenomen stalen (N; 2004) Afgenomen stalen N Afgenomen stalen N Urine 29 Keeluitstrijk 2 Sputum 24 Bloed 1 Etter 7 Onbekend 13 amino_tab3 Door middel van een microdilutietest werd de gevoeligheid van deze 76 stammen bepaald tegenover klinisch belangrijke aminoglycosiden, nl. Amikacine (Ak), Gentamicine (Gm), Netilmicine (Nt) en Tobramycine (Tm). Op basis van deze gevoeligheidsbepaling, uitgevoerd volgens de NCCLS-criteria, werden de fenotypische resistentieprofielen vastgelegd (tabel 4). Tabel 4 : : aanwezigheid van aminoglycoside-resistentiefenotypen (AGRP) 1 in de verschillende kiemen (2004) AGRP Enterobacteriaceae Niet-fermenters Gram positief Totaal AkGmNtTm 1 18 0 19 GmNtTm 15 8 0 23 GmTm 4 0 1 5 NtTm 1 2 0 3 GmNt 1 1 0 2 Gm 4 0 0 4 Tm 2 0 0 2 Gevoelig (S) 2 1 3 6 Niet getest (NG) 0 0 12 12 Totaal 30 30 16 76 1 Aminoglycoside-resistentieprofiel : Ak = Amikacine; Gm = Gentamicine; Nt = Netilmicine; Tm = Tobramycine amino_tab4 Zes stammen (7,9%) die ons werden toegestuurd, bleken gevoelig te zijn voor de geteste aminoglycosiden. Twaalf S. aureusstammen die enkel ter controle van de genotypische resistentie werden opgestuurd, werden niet getest. In totaal was het fenotypische resistentieprofiel van 58 stammen beschikbaar. Van deze stammen bleken er 53 (91,4%) resistent tegen Gentamicine, 52 (89,7%) tegen Tobramycine, 47 (81,0%) tegen Netilmicine en 19 (32,8%) tegen Amikacine. De meest voorkomende resistentieprofielen binnen de groep van de resistente stammen waren AkGmIpNtTm (32,8%) en GmNtTm (39,7%). Geïsoleerde resistentie werd enkel gevonden voor Gm (6,9%) en Tm (3,4%). Resistentie tegen 3 of meer aminoglycosiden werd gevonden in 72,4% van de stammen. De verschillende resistentiemechanismen die werden gevonden in de diverse kiemen zijn weergegeven in tabel 5. In totaal werd er in 67 stammen een potentieel resistentiemechanisme gedetecteerd. Voor deze resistentiemechanismen waren globaal 89 resistentiegenen verantwoordelijk. Een resistentiemechanisme kon niet worden gedetecteerd in 3 gevoelige stammen. Dit impliceert dat een resistentiemechanisme aanwezig was in 3 fenotypisch gevoelige stammen. In het merendeel van de stammen (38/67; 56,7%) vonden we alleen de aanwezigheid van een modificerend enzym (AME-genen), in 19 stammen (28,4%) vonden we alleen permeabiliteitsresistentie, terwijl in 10 stammen (14,9%) de permeabiliteitsresistentie geassocieerd was met een AME-gen. Het meest gedetecteerde mechanisme was het aac(3)-iic gen (23,9%) gevolgd door de permeabiliteitsresistentie al dan niet door MexZGH (28,4%). De permeabiliteitsresistentie met of zonder de aanwezigheid van een AME-gen (43,3%) werd bijna alleen waargenomen bij de niet-fermenters en 44,8% van deze stammen bleek positief voor het MexZGH (efflux) gen. Een combinatie van resistentiegenen werd gevonden in 17 stammen (25,4%). 2
Tabel 5 : : aanwezigheid van aminoglycoside-resistentiemechanismen (2004) Resistentiemechanismen Enterobacteriaceae Niet-fermenters Gram-positief Totaal aac(3)- Iic 16 0 0 16 aac(3)- IV a 2 0 0 2 aac(3)- VI a 1 0 0 1 aac(6 )- Ib 3 0 0 3 aac(6 )- Ic 2 0 0 2 ant(4,4 ) 0 0 6 6 aph(3 ) 0 0 1 1 aph(2 )-aac(6 )+ ant(4,4 ) 0 0 1 1 aac(3)-ia+ aac(6 )-Ib 0 1 0 1 aac(3)- II c+ aac(6 )- Ib 3 0 0 3 aac(3)- II c+ aac(6 )- I l 1 0 0 1 aac(6 )-Ib + aac(6 )- IIa 0 1 0 1 Impermeabiliteit 1 14 0 15 Impermeabiliteit + aac(6 )- I l 0 1 0 1 MexZGH ( Impermeabiliteit) 0 4 0 4 MexZGH + aac(6 )- Ib 0 4 0 4 MexZGH + aac(6 )- IIa 0 1 0 1 MexZGH +aac(6 )- Ib+aac(6 )- I l 0 1 0 1 MexZGH +aac(6 )- Ib+aac(6 )- IIa 0 2 0 2 MexZGH +aac(3)-ii c+ aac(6 ) IIa+ 0 1 0 1 Niet gedetecteerd : S-stammen 1 1 0 2 3 Niet gedetecteerd : NG-stammen 1 0 0 6 6 Totaal 30 30 16 76 1 S = gevoelige stammen; NG = niet getest voor AGRP amino_tab5 Tabel 6 verstrekt informatie over de relatie tussen de verschillende resistentiemechanismen en de fenotypische expressie van de resistentie. In 3 van de 6 gevoelige stammen bleek toch een resistentiemechanisme aanwezig te zijn, nl. een aac(6 )-Ib gen, een aph(3 ) gen en een MexZGH gen. Anderzijds blijkt ook uit deze tabel dat de aanwezigheid van een resistentiemechanisme niet altijd aanleiding geeft tot een fenotypische expressie van de resistentie. Tabel 6 : : verband tussen resistentiemechanisme en resistentiefenotype 1 (2004) Resistentiemechanisme Resistentiefenotypen Totaal AkGmIpNtTm GmNtTm GmTm NtTm GmNt Gm Tm S* NG* aac(3)-iic 0 11 2 0 1 2 0 0 0 aac(3)-iva 0 1 1 0 0 0 0 0 0 aac(3)-vi a 0 0 0 0 0 1 0 0 0 aac(6 )-Ib 0 1 1 1 0 0 0 1 0 aac(6 )-Ic 0 0 0 0 0 0 2 0 0 ant(4, 4 ) 0 0 0 0 0 0 0 0 6 aph(3 ) 0 0 0 0 0 0 0 1 0 aph(2 )-aac(6 ) + ant(4,4 ) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 aac(3)-ia + aac(6 )-Ib 0 1 0 0 0 0 0 0 0 aac(3)-iic + aac(6 )-Ib 0 2 0 0 0 0 0 0 0 aac(3)-iic + aac(6 )-I l 0 0 0 0 0 1 0 0 0 aac(6 )-Ib + aac(6 )-IIa 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Impermeabiliteit 14 1 0 0 0 0 0 0 0 Impermeabiliteit + aac(6 )-I l 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MexZGH (Impermeabiliteit) 0 2 0 0 1 0 0 1 0 MexZGH + aac (6 )-Ib 0 2 2 2 0 0 0 0 0 MexZGH + aac (6 )-Ila 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MexZGH + aac (6 )-Ib+aac(6 )-I l 1 0 0 0 0 0 0 0 0 MexZGH + aac(6 )-Ib+aac(6 )-IIa 2 0 0 0 0 0 0 0 0 MexZGH + aac(3)-ilc +aac(6 )-IIa + 0 1 0 0 0 0 0 0 0 ant(2 )-Ia Niet gedetecteerd : S-stammen 1 0 0 0 0 0 0 0 3 0 Niet gedetecteerd : NG-stammen 1 0 0 0 0 0 0 0 0 6 Totaal 19 23 6 3 2 4 2 6 12 1 S = gevoelige stammen; NG = niet getest voor AGRP amino_tab6 3
Detectie van aminoglycoside-resistentiemechanismen in methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) isolaten Deze studie werd uitgevoerd in samenwerking met het referentiecentrum voor faagtypering (Dr. Wet. C. Godard) op het Pasteur Instituut van Brussel. De stammen die in deze studie werden geanalyseerd, werden in 2002 verzameld. Het betreft hier het definitieve rapport voor het jaar 2002. In totaal werden 1540 S. aureus-stammen onderzocht. De laboratoria uit West- en Oost-Vlaanderen leverden respectievelijk 35,5% en 30,7% van de stammen (tabel 7). In totaal waren 351 stammen (22,8%) afkomstig uit etter. Verder werden 304 stammen (19,7%) geïsoleerd uit een neusuitstrijkje, dat werd afgenomen om dragers op te sporen (tabel 8). Tabel 7 : : Geografische herkomst van MRSA-stammen (2002) Provincie N % West-Vlaanderen 547 35,5 Oost-Vlaanderen 472 30,6 Limburg 271 17,6 Antwerpen 250 16,2 amino_tab7 Tabel 8 : : overzicht van de afgenomen stalen van MRSA-stammen (2002) Staal Aantal % Etter 351 22,8 Neusuitstrijk 304 19,7 Sputum 268 17,4 Urine 214 13,9 Perineum 69 4,5 Bloed 56 3,6 Keeluitstrijk 31 2,0 Feces 20 1,3 Katheter 13 0,8 Vagina 5 0,3 Andere 186 12,1 Onbekend 23 1,5 amino_tab8 Door gebruik te maken van een microdilutietechniek en volgens de criteria van de NCCLS werd voor alle stammen de minimale remmingsconcentratie (MIC) bepaald van Amikacine, Gentamicine, Isepamicine, Netilmicine en Tobramycine. De resultaten van deze bepalingen zijn samengevat in tabel 9. Met uitzondering van Tobramycine hebben de aminoglycosiden op gewichtsbasis een vergelijkbare activiteit. Voor Netilmicine zijn 99,4% van de stammen gevoelig (MIC 8 µg/ml) terwijl voor Amikacine, Isepamicine (beide MIC 16 µg/ml), Gentamicine en Tobramycine (beide MIC 4 µg/ml) de gevoeligheid respectievelijk 99,0%, 99,1%, 92,9% en 70,1% bedraagt. De modus voor Gentamicine, Netilmicine en Tobramycine is 0,25 µg/ml terwijl dit voor Amikacine en Isepamicine 1 µg/ml is. De MIC90 (MIC voor 90% van de stammen) voor Gentamicine en Netilmicine bedraagt 0,5 µg/ml. Amikacine en Isepamicine hebben een MIC90 van resp. 8 µg/ml en 4 µg/ml terwijl deze waarde voor Tobramycine oploopt tot 64 µg/ml. Tabel 9 : : in vitro gevoeligheid voor aminoglycosiden van 1540 MRSA-stammen (2002) Minimale Inhibitorische Concentraties (µg/ml) Aminoglycoside < 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 > 256 Amikacine 13 245 441 389 279 129 27 7 5 0 4 Gentamicine 1198 186 35 8 4 10 19 30 27 12 11 Isepamicine 10 313 481 336 263 99 24 8 4 1 1 Netilmicine 1105 278 61 40 35 11 6 3 0 0 1 Tobramycine 871 158 35 7 9 39 50 118 130 60 63 amino_tab9 Door gebruik te maken van de PCR hebben we getracht de genen die coderen voor aminoglycosidemodificerende enzymen te detecteren in de 1540 MRSA-stammen. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van sets van primers die specifiek zijn voor het ant(4,4 )-I, het bifunctionele aac(6 )-aph(2 ) en het aph(3 )-III gen. In 1058 MRSA-stammen (68,7%) kon geen gen worden aangetoond terwijl in de overige 482 stammen een totaal van 556 genen werd gedetecteerd (tabel 10). Het belangrijkste resistentiemechanisme was het geïsoleerde ant(4,4 )-I gen (23,2%). Dit mechanisme werd overigens gevonden in 74,3% (358/482) van de gen-positieve stammen. In 72 van de gen-positieve stammen (14,9%) werd een combinatie van genen gevonden. Dit betekent dat een gencombinatie slechts aanwezig is in 4,7% van de totale onderzochte populatie (tabel 11). 4
Tabel 10 : : detectie van AME* genen in 1540 MRSA-stammen (2002) Gen Aantal ant(4',4'')-i 375 aac(6')-aph(2'') 113 aph(3')-iii 68 Geen AME gen 1058 *AME : Aminoglycoside Modificerend Enzym Tabel 11 : Aminoglyc osiden : detectie van resistentiemechan ismen in 1540 MRSA-stammen (2002) amino_tab10 Gen Aantal % ant(4,4 )-I 358 23,2 aac(6 )-aph(2 ) 45 2,9 aph(3 )-III 7 0,5 aac(6 )-aph(2 )+ Aph(3 )-III 55 3,6 aac(6 )-aph(2 )+ Ant(4,4 )-I 11 0,7 aph(3 )-III+ Ant(4,4 )-I 4 0,3 aac(6 )-aph(2 )+ Aph(3 )-III+Ant(4,4 )-I 2 0,1 Geen AME gen 1058 68,7 amino_tab11 Tabellen 12 en 13 geven het verband weer tussen de aanwezigheid van genen die coderen voor een AME en de fenotypische expressie van deze genen. Uit tabel 12 blijkt in de eerste plaats dat ondanks de aanwezigheid van een AME-gen de graad van ongevoeligheid (stammen die intermediair of resistent zijn) laag is. Voor Tobramycine is er duidelijk wel een hogere graad van ongevoeligheid (93,2%) terwijl dit ook het geval is voor Gentamicine (22,2%), zij het dan in veel mindere mate. Het is wel duidelijk dat MRSA-stammen met een AME-gen in de regel een hogere graad van ongevoeligheid voor aminoglycosiden hebben dan MRSA-stammen zonder AME-gen. Uit tabel 13 blijkt dat de aanwezigheid van een resistentiemechanisme niet noodzakelijk resulteert in een fenotypische expressie. De aanwezigheid van bijvoorbeeld het ant(4,4 )-I gen, dat codeert voor een AkIpTm-resistentie, geeft slechts een hoge graad van ongevoeligheid voor Tobramycine (96,4%). Het aac(6 )-aph(2 ) gen dat codeert voor resistentie tegen de vijf aminoglycosiden wordt blijkbaar slechts voldoende geuit voor Gentamicine (91,1%) en Tobramycine (80,0%). Tabel 12 : : % stammen ongevoelig* voor aminoglycosiden (2002) Stammen Aantal Amikacine Gentamicine Isepamicine Netilmicine Tobramycine Totaal 1540 1,1 7,1 0,9 0,6 29,9 Gène EMA positif 482 3,3 22,2 2,7 2,1 93,2 Gène EMA négatif 1058 0,1 0,2 0,1 0,0 1,0 MIC > I/R µg/ml (NCCLS)* > 32 > 8 > 32 > 16 > 8 * I= Intermediair; R= Resistent; NCCLS= National Committee for Clinical Laboratory Standards amino_tab12 Tabel 13 : : % stammen ongevoelig voor aminoglycosiden in functie van het resistentiemechanisme (2002) Stammen Fenotype* N Amikacine Gentamicine Isepamicine Netilmicine Tobramycine Totaal S/I/R 1540 1,1 7,1 0,9 0,6 29,9 ant(4',4'') AkIpTm 358 2,5 0,3 1,4 0,0 96,4 aac(6')-aph(2'') AkGmIpNtTm 45 0,0 91,1 0,0 4,4 80,0 aph(3')-iii AkIp 7 0,0 0,0 0,0 14,3 14,3 aac(6')-aph(2'') + Aph(3')-III AkGmIpNtTm 55 10,9 100,0 9,1 7,3 98,2 aac(6')-aph(2'') + Ant(4',4'') AkGmIpNtTm 11 0,0 63,6 9,1 9,1 81,8 aph(3')-iii + Ant(4',4'') AkIpTm 4 25,0 25,0 25,0 25,0 50,0 aac(6')-aph(2'') + Aph(3')-III + Ant(4',4'') AkGmIpNtTm 2 0,0 100,0 50,0 25,0 100,0 AME-negatief gen S 1058 0,1 0,2 0,1 0,0 1,0 MIC > I/R µg/ml (NCCLS)* > 32 > 8 > 32 > 16 > 8 * Ak=Amikacine; Gm=Gentamicine; Ip=Isepamicine; Nt=Netilmicine; Tm=Tobramycine; S=Gevoelig amino_tab13 * I=Intermediair; R=Resistent; NCCLS=National Committee for Clinical Laboratory Standards 5