Aminoglycosiden. Gegevens van het Referentielaboratorium. Analysen verricht in het kader van het referentiecentrum. Referentielaboratorium

Transcriptie

1 Gegevens van het Dr. R. VANHOOF W.I.V. - Dpt Pasteur - Antibiotica Engelandstraat, Brussel Tel. : 02/ Fax : 02/ Rvanhoof@pasteur.be Het referentielaboratorium verantwoordelijk voor de bestudering van de resistentie tegen aminoglycosiden bevindt zich op het WIV - Departement Pasteur in Brussel. worden nog steeds veelvuldig gebruikt in het ziekenhuismilieu. Toxiciteit en de ontwikkeling van resistentie zijn de belangrijkste factoren die hun klinische bruikbaarheid beperken. Resistentie tegen aminoglycosiden kan te wijten zijn aan een (i) ribosomiale mutatie, (ii) de aanwezigheid van aminoglycoside-modificerende enzymen (AME), (iii) een verminderde opname en aan (iv) een verhoogde efflux van aminoglycosiden. AME-resistentie is veruit het belangrijkste mechanisme omdat de genetische determinanten meestal plasmide- of transposongebonden zijn. Dit laatste verklaart de belangrijke disseminatie van deze genen bij zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën. bevatten in hun structuur amino- en hydroxylgroepen die enzymatisch geacetyleerd, gefosforyleerd en genucleotidyleerd kunnen worden. De enzymen die deze activiteit uitvoeren zijn dus aminoglycoside-n-acetyltransferasen (AAC), aminoglycoside-o-fosforyltransferasen (APH) en aminoglycoside-o-nucleotidyltransferasen (ANT). Deze drie groepen van enzymen worden nog verder ingedeeld in functie van de plaats van het C-atoom met de amino- of hydroxylgroep die gemodificeerd wordt door het enzym. De plaats van de modificatie wordt na de afkorting van het enzym tussen haakjes weergegeven door een cijfer. Verder kunnen de enzymen van een bepaalde groep nog worden onderscheiden op basis van het substraatprofiel. Deze ondertypen worden weergegeven door een Romeins cijfer na het enzymtype en de plaats van modificatie : APH(3')-I, APH(3')-II, APH(3')-III, APH(3')-VI, APH(3')-V, APH(3')-IV. Ten slotte kunnen bepaalde enzymen worden gecodeerd door verschillende genen en de specificatie van dit gen wordt in de regel weergegeven door een kleine letter na het enzymtype, bijv. aac(6')ia, aac(6')ib, aac(6')ic, aac(6')if, aac(6')ig, enz. Analysen verricht in het kader van het referentiecentrum In 2006 ontving het referentiecentrum 56 stammen voor onderzoek naar de aanwezigheid van een resistentiemechanisme. In tabel 1 staat de geografische herkomst van de 56 stammen op basis van de postcode van de patiënten. Tabel 1 : : geografische herkomst van de stalen (N; 2006) Lokalisatie aantal stalen Lokalisatie aantal stalen Yvoir 46 Westerlo 1 Brussel 2 Ekeren 1 Stabroek 2 Kalmthout 1 Brasschaat 1 Onhaye 1 Brecht 1 Totaal 56 In totaal betrof het dus 56 stammen waarvan 36 Enterobacteriaceae (64,3%), 19 Pseudomonas aeruginosa of andere nietfermenters (33,9%) en 1 Staphylococcus aureus stam (1,8%) (tabel 2). Tabel 2 : : overzicht van de micro-organismen (N; 2006) amino_t1 Kiemen aantal Kiemen aantal Enterobacteriaceae 36 Pseudomonas en non-fermenters 19 Escherichia coli 23 Pseudomonas aeruginosa 9 Klebsiella pneumoniae 7 Acinetobacter baumannii 4 Enterobacter aerogenes 2 Alcaligenes xylosoxidans 3 Salmonella spp 2 Pseudomonas sp. 3 Citrobacter amalonaticus 1 Enterobacter cloacae 1 Gram positieve kokken 1 Staphylococcus aureus 1 Totaal 56 amino_t2 1

2 Door middel van een microdilutietest werd de gevoeligheid van deze 56 stammen bepaald tegenover klinisch belangrijke aminoglycosiden, nl. Amikacine (Ak), Gentamicine (Gm), Netilmicine (Nt) en Tobramycine (Tm). Op basis van deze gevoeligheidsbepaling, uitgevoerd volgens de CLSI-criteria, werden de fenotypische resistentieprofielen vastgelegd (tabel 3). Tabel 3 : : aanwezigheid van aminoglycoside-resistentiefenotypen (AGRP) 1 in de verschillende kiemen (N; 2006) AGRP Enterobacteriaceae Niet-fermenters Gram positief Totaal AkGmNtTm GmNtTm AkGmTm AkGmNt GmTm AkTm Tm Gevoelig (S) Totaal Aminoglycoside-resistentieprofiel : Ak = Amikacine; Gm = Gentamicine; Nt = Netilmicine; Tm = Tobramycine amino_t4 Twee stammen (3,6%) die ons werden toegestuurd, bleken gevoelig te zijn voor de geteste aminoglycosiden. In totaal was het fenotypische resistentieprofiel van 54 stammen beschikbaar. Van deze stammen bleken er 53 (98,1%) resistent tegen Tobramycine, 51 (94,4%) tegen Gentamycine, 45 (83,3%) tegen Netilmicine en 44 (81,5%) tegen Amikacine. Het meest voorkomende resistentieprofiel binnen de groep van de resistente stammen was AkGmNtTm (38 stammen; 70,4%). Het fenotypische resistentieprofiel GmNtTm werd gevonden in 6 isolaten (11,1%). Geïsoleerde resistentie werd enkel gevonden voor Tm (1,9%). Resistentie tegen 3 of meer aminoglycosiden werd gevonden in 88,8% van de resistente stammen. De verschillende resistentiemechanismen (= aanwezigheid van een resistentiegen of een combinatie van resistentiegenen) die werden gevonden in de diverse kiemen zijn weergegeven in tabel 4. In totaal werd er in 51 stammen een potentieel resistentiemechanisme gedetecteerd. Het aph(3 )-I gen werd gedetecteerd in een gevoelige stam. In het merendeel van de stammen (40/51; 78,4%) vonden we alleen de aanwezigheid van een modificerend enzym (AME-genen). In 5 stammen (9,8%) vonden we alleen permeabiliteitsresistentie, terwijl in 6 stammen (11,8%) de permeabiliteitsresistentie geassocieerd was met een AME-gen. Het meest gedetecteerde mechanisme was het aac(3)-iic + arma mechanisme (20/51; 39.2%). Het aac(3)-iic + arma mechanisme was nog aanwezig in combinatie met het aac(6 )-Ib gen (2 stammen), het aph(3 )-I gen (1 stam) en de aac(6 )-Ib + aph(3 )-I genen (1 stam). Het arma kwam nog geïsoleerd voor in 4 stammen. Dit wil zeggen dat in totaal het arma gen aanwezig was in 28 stammen (28/51; 54.9%). Het arma gen werd alleen gedetecteerd in Enterobacteriaceae. Permeabiliteitsresistentie al dan niet door MexZGH, met of zonder de aanwezigheid van een AME gen werd alleen waargenomen bij de niet-fermenters en 72.7 % van deze stammen bleken positief voor het MexZGH (efflux) gen. Een combinatie van resistentiegenen werd gevonden in 36 stammen (36/51; 70.6 %). In de groep van stammen met een combinatie van genen, bleken 30 stammen (83.3%) een combinatie van twee genen te hebben, terwijl 5 stammen (13.9%) een combinatie van 3 genen had. In één stam (2.8%) werd een combinatie van 4 genen gevonden. 2

3 Tabel 4 : : aanwezigheid van aminoglycoside-resistentiemechanismen (N; 2006) Resistentiemechanismen Enterobacteriaceae Niet-fermenters Gram positief Totaal aac(6')- Ib aph(3')-i aph(3')-vi a ant(4',4") arma Impermeabiliteit MexZGH (Impermeabiliteit) aac(3)-ii c + arma aac(3)-ii c+ aac(6')- Ib aac(3)-ii c+ aph(3')-i aac(3)-iii a + aac(6')- Ib aac(6')-ib + ant(2")-ia aac(6')-ib + aph(3')via aac(6')-ib + MexZGH ant(2")-ia + MexZGH aac(3)- II c+ aac(6')- Ib+ arma aac(3)- II c+ aph(3')-i + arma aac(6')-ib+aac(6')-iia + MexZGH aac(6')-iia + ant(2")-ia + MexZGH aac(3)-ii c + aac(6')-ib + aph(3')i + arma Niet gedetecteerd : S-stammen Niet gedetecteerd : R-stammen Totaal S = Gevoelige isolaten; R = Resistente isolaten amino_t5 Tabel 5 verstrekt informatie over de relatie tussen de verschillende resistentiemechanismen en de fenotypische expressie van de resistentie. In een gevoelige stam bleek een resistentiemechanisme aanwezig te zijn, nl. het aph(3 )-I gen. Anderzijds blijkt ook uit deze tabel dat de aanwezigheid van een resistentiemechanisme niet altijd aanleiding geeft tot een fenotypische expressie van de resistentie. Tabel 5 : : relatie tussen resistentie mechanisme en resistentie fenotype (N; 2006) Resistentiemechanismen Resistantiefenotypen Totaal AkGmNtTm GmNtTm AkGmTm AkGmNt GmTm AkTm Tm S aac(6')- Ib aph(3')-i aph(3')-vi a ant(4',4") arma Impermeabiliteit MexZGH (Impermeabiliteit) aac(3)-ii c + arma aac(3)-ii c+ aac(6')- Ib aac(3)-ii c+ aph(3')-i aac(3)-iii a + aac(6')- Ib aac(6')-ib + ant(2")-ia aac(6')-ib + aph(3')via aac(6')-ib + MexZGH ant(2")-ia + MexZGH aac(3)- II c+ aac(6')- Ib+ arma aac(3)- II c+ aph(3')-i + arma aac(6')-ib+aac(6')-iia + MexZGH aac(6')-iia + ant(2")-ia + MexZGH aac(3)-ii c + aac(6')-ib + aph(3')i + arma Niet gedetecteerd : S-stammen Niet gedetecteerd : R-stammen Totaal S = Gevoelige isolaten; R = Resistente isolaten amino_t6 3

4 Detectie van Aminoglycoside Resistentiemechanismen in Methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) isolaten geïsoleerd in Vlaanderen. Deze studie werd uitgevoerd in samenwerking met het referentiecentrum voor Faagtypering (C. Wildemauwe) in het Instituut Pasteur te Brussel en 4 ziekenhuizen in Vlaanderen (UZ-Gent, Prof. G. Verschraegen, RZ Jan Yperman, Ieper, Apoth. Biol. R. Joseph; AZ Damiaan, Oostende, Dr. G. Alliet; OLV Ziekenhuis, Aalst, Dr. H. De Beenhouwer). De stammen die werden geanalyseerd werden verzameld in het jaar In totaal werden er 483 methicilline-resistente S. aureus (MRSA) stammen onderzocht. Respectievelijk 47,8 % en 32,1 % van deze stammen waren afkomstig uit West-Vlaanderen en Oost-Vlaanderen leverden. In totaal was 14,9 % van de stammen afkomstig van een uitstrijkje dat werd afgenomen om dragers op te sporen, 14,3 % uit sputum en 11,4 % uit etter. In totaal werd 54,6 % van de stalen afgenomen voor het opsporen van een dragerschap, terwijl 43,7 % afkomstig was van patiënten met een MRSA infectie. Voor 1,7 % van de stalen was deze informatie niet voorhanden. De gemiddelde leeftijd van de patiëntenpopulatie was 72,5 jaar; 77,8 % van de stammen waren afkomstig van patiënten uit de leeftijdscategorie 60 jaar. Door gebruik te maken van een microdilutietechniek en volgens de criteria van de NCCLS werd voor alle stammen de Minimale Inhibitorische Concentraties (MIC) bepaald van Amikacine, Gentamicine, Kanamycine, Netilmicine en Tobramycine. De resultaten van deze bepalingen zijn samengevat in tabel 6. Op gewichtsbasis hebben Gentamicine en Netilmicine de beste activiteit. De MIC50 en MIC90 waarden (MIC voor 50% en 90% van de populatie) voor Gentamicine en Netilmicine zijn 0,5 µg/ml en 1 µg/ml. De MIC50 en MIC90 waarden voor de andere componenten zijn als volgt: Amikacine (4 µg/ml en 16 µg/ml), Kanamycine (4 µg/ml en 128 µg/ml), Tobramycine (0,5 µg/ml en 256 µg/ml). Volgens de CLSI criteria zijn alle stammen gevoelig aan Netilmicine (MIC 8 µg/ml) terwijl voor Gentamicine (MIC 4 µg/ml) en Amikacine (MIC 16 µg/ml) de gevoeligheid respectievelijk 97,7 % en 92,8% bedraagt. Voor de totale populatie was de gevoeligheid voor Kanamycine en Tobramycine respectievelijk 63,6 % en 63,2 %. Er was geen noemenswaardig verschil tussen de MIC distributie en de gevoeligheidsgraad van stammen afkomstig uit de screening en de infecties, noch voor wat betreft de stammen van gehospitaliseerde en ambulante patiënten. Stammen die drager waren van een gen dat codeert voor een aminoglycoside modificerend enzym (AME) hadden voor bepaalde aminoglycosiden significante hogere MIC waarden dan stammen zonder AME gen: Amikacine (gemiddelde MIC 10,99 µg/ml vs. 2,68 µg/ml, P<0,001), Kanamycine (gemiddelde MIC 84,57 µg/ml vs. 2,66 µg/ml, P<0,001), Tobramycine (gemiddelde MIC 104,64 µg/ml vs. 0,49 µg/ml, P<0,001). Met uitzondering van Netilmicine, was voor de andere aminoglycosiden de resistentiegraad significant hoger in AME positieve stammen dan in AME-negatieve stammen: Amikacine (16,8% vs. 1,6%, p<0,001), Gentamicine (5,0 % vs. 0,7 %, 0.01>P>0.001), Kanamycine (91,6 % vs. 3,9 %, P<0,001) en Tobramycine (91,6 % vs. 4,6 %, P<0,001). Tabel 6 : : in vitro gevoeligheid van 483 MRSA stammen voor de verschillende aminoglycosiden (N; 2006) Minimale Inhibitorische Concentraties (µg/ml) Antibioticum 0,125 0,25 0, Amikacine Gentamicine Kanamycine Netilmicine Tobramycine Door gebruik te maken van de PCR hebben we getracht de genen die coderen voor aminoglycoside modificerende enzymen te detecteren in de 483 MRSA stammen. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van sets van primers die specifiek zijn voor het ant((4,4 )-I, het bifunctionele aac(6 )-aph(2 ) en het aph(3 )-III gen. In 304 MRSA stammen (62,9 %) kon geen gen worden aangetoond terwijl in de overige 179 stammen een totaal van 183 genen werd gedetecteerd (Tabel 7). Het belangrijkste resistentiemechanisme was het geïsoleerde ant(4,4 )-I gen (34,8 % van de totale populatie). Dit mechanisme werd overigens gevonden in 93,9 % (168/179) van de gen positieve stammen. In slechts 4 van de gen positieve stammen (2,2 %) werd een combinatie van genen gevonden. Dit betekent dat een gencombinatie slechts aanwezig is in 0,8 % van de totale onderzochte populatie. amino_t7 4

5 Tabel 7 : : detectie van resistentiemechanismen in 483 MRSA stammen (N; 2006) Gen N % Ant(4',4")-I ,8 Aac(6')-aph(2") 6 1,2 Aph(3')-III 1 0,2 Aac(6')-aph(2") + Ant(4',4")-I 3 0,6 Aph(3')-III + Ant(4',4")-I 1 0,2 Geen AME gen ,9 Totaal ,0 Het is wel duidelijk dat MRSA stammen met een AME gen in regel een hogere graad van ongevoeligheid voor aminoglycosiden hebben dan MRSA stammen zonder een AME gen. De aanwezigheid van een resistentiemechanisme resulteert niet noodzakelijk in een fenotypische expressie. De aanwezigheid van bijvoorbeeld het ant(4,4 )-I gen, dat codeert voor een AkKmTmresistentie, geeft alleen maar een hoge graad van ongevoeligheid voor Kanamycine en Tobramycine. amino_t8 5