Van staal tot protocol: wat zegt het APD resultaat? Liesbeth Ferdinande Dienst Pathologische Anatomie Laboratorium voor kankerdiagnostiek en pathologie
Stalen en klinische vraagstelling Verwerken van stalen Routine Vriescoupe Cytologie Bijkomende analyses Immuunhistochemie FISH Kwaliteitszorg
STALEN Biopsies Chirurgische resectiestukken Cytologische stalen Autopsies Consulten UZ Gent 2017 21766 biopten/resecties (incl. consulten) 3093 cytologiestalen 5538 cervixuitstrijkjes 58 autopsies
KLINISCHE VRAAGSTELLING Diagnostiek Oncologisch Diagnostiek, staging, prognostische en predictieve biomerkers Inflammatoir Functioneel Medicolegaal Kwaliteitscontrole
Biopten Oppervlakkige biopten (Punch)biopten van huidafwijkingen Wegname van kleine huidletsels Endoscopische biopten Laryngoscopie, bronchoscopie, gastroscopie, coloscopie, colposcopie Biopten van mucosale afwijkingen of tumoren Wegname van kleine letsels, vb. darmpoliepen Naald-, cilinder- en truecutbiopten Lever(tumoren), nier, longtumoren (transthoracaal), borsttumoren Aanprikken van oppervlakkige letsels Onder echo- of CT-geleide van diepere letsels Chirurgische biopten Incisiebiopten, vb. open longbiopsie Excisiebiopten, vb. wigresectie van longnodule
Chirurgische resectiestukken Macroscopie!
Cytologische stalen Cervixuitstrijkjes Urine Ascitesvocht, pleuravocht, cystevocht, cerebrospinaal vocht Fine Needle Aspiration Cytology (FNAC): Percutaan aanprikken van lymfeklieren of letsels Oppervlakkig Onder echo- of CT-geleide Transoesofagaal (EUS=esophageal ultrasound)/transrectaal/transbronchiaal (EBUS=endobronchial ultrasound) aanprikken van lymfeklieren of letsels (echo-endoscopie)
VERWERKEN VAN STALEN Staalontvangst en registratie in LIMS (Laboratory Information Management System) Fixatie in formol Macroscopie Dehydrateren en inbedden in paraffine Snijden en kleuren van paraffinecoupes Evaluatie van coupes door patholoog Eventueel bijkomende analyses Protocol maken in LIMS Export van protocol naar EPD
Staalontvangst en registratie Order met klinische informatie noodzakelijk! Voor correcte registratie Voor correcte verwerking van staal Uniek registratienummer in LIMS per patiënt per ingreep
Fixatie in formol Time to fixation tot een minimum beperken Staal onmiddellijk in formol Eventueel in frigo Problemen met bijkomende analyses Voldoende formol (ideaal: verhouding 1/10) Fixatiesnelheid formol: 1-2mm/uur Fixatieduur van cruciaal belang: Ideaal: 6-72h (24h) Niet lang genoeg = onderfixatie: Morfologie van weefsel niet goed bewaard Problemen met technicering (weefsel moeilijk te snijden) Problemen met bijkomende analyses Te lang = overfixatie: Problemen met bijkomende analyses
impact van te lange time to fixation op oestrogeenreceptor immuunhistochemie in borsttumoren Qiu et al. Am J Clin Pathol 2010
3h 8h impact van fixatieduur op PD-L1 immuunhistochemie 24h 48h 72h 96h Ilie et al. Virchows Arch 2016
Macroscopie Beschrijven van het staal en in genummerde cassettes steken Grote biopten of stukken: versnijden en gericht nemen van prelevementen voor microscopisch onderzoek Door patholoog en/of bevoegde macroscopie-assistent Volgens orgaan- en/of pathologiespecifieke richtlijnen Voor of na fixatie Gebruik van inkt voor snijvlakken
Gebruik van inkt voor snijvlakken
facies costalis = zwart mediaal = rood pericard = geel diafragma = groen
Partiële hepatectomie - weeg en meet de resectie - inkt het parenchymale snijvlak - lamelleer loodrecht op dit snijvlak - meet en beschrijf de tumor(en), noteer de afstand tot het snijvlak en het kapsel -neem prelevementen van de tumor(en) : naar het parenchymaal snijvlak naar het kapsel - neem een prelevement van het niettumorale leverparenchym Blokkensleutel C1: tumor naar snijvlak C2: tumor naar kapsel C3: lever at random
TNM classificatie T : tumor N : lymfeklieren M : metastase klinisch : ctnm pathologisch : ptnm = bepalen van de uitgebreidheid van de ziekte : prognostisch en therapeutisch belang!
R status: volledigheid van resectie R2 = macroscopisch onvolledige resectie R1 = macroscopisch volledige resectie, maar microscopisch onvolledige resectie R0 = macroscopisch en microscopisch volledige resectie
Dehydrateren en inbedden in paraffine Cassettes in tissue processor Overnacht dehydratie en impregneren met paraffine Maken van paraffineblokken
Snijden en kleuren van paraffinecoupes Dikte van paraffinecoupes: 1,5 4 µm dik Op glaasjes met uniek registratienummer: 1-6 coupes op 1 draagglaasje per paraffineblok Standaardkleuring voor routinediagnostiek: hematoxylineeosine kleuring
Evaluatie van coupes door patholoog
Eventueel bijkomende analyses Aanvraag via LIMS Status te volgen via LIMS
Protocol maken in LIMS Klinische informatie (EPD order) Macroscopie Microscopie Conclusie
Oncologisch protocol Procedure Type tumor Differentiatiegraad Grootte / diepte-invasie Snijvlakken Aan/afwezigheid van lymfovasculaire invasie Aan/afwezigheid van perineurale invasie Therapie-effect Resultaten bijkomende analyses voor prognostische/predictieve merkers Lymfeklieren ptnm R status
Voorbeeld: Coloncarcinoom
Tumortype Adenocarcinoma Mucineus adenocarcinoom Zegelringcelcarcinoom Medullair carcinoom Serrated adenocarcinoma
Differentiatiegraad laaggradig hooggradig goed gedifferentieerd: >95% klierbuizen matig gedifferentieerd: 50-95% klierbuizen weinig gedifferentieerd: 0-49% klierbuizen
Diepte-invasie
Diepte-invasie
Snijvlakken
Lymfovasculaire invasie immuunhistochemische kleuring voor podoplanine = D2-40: merker voor lymfevaten
Perineurale invasie immuunhistochemische kleuring voor S100: merker voor zenuwen
Therapie-effect: regressiegraad
Lymfeklieren
VRIESCOUPE Dringende evaluatie nodig (+/- 30min na ontvangst staal): Peroperatoir: vraag naar evaluatie van snijvlakken of diagnostiek die verder verloop van operatie zullen beïnvloeden Transplantatiepathologie: vraag naar geschiktheid van donororgaan voor transplantatie vraag naar rejectie van transplantorgaan Weefsel wordt niet gefixeerd, maar onmiddellijk ingevroren Snijden van vriescoupes met manueel uitvoeren van hematoxylineeosinekleuring
VERWERKEN VAN CYTOLOGIESTALEN Uitstrijkje Dunnelaagcytologie (liquid based cytology) Celblokje
Uitstrijkje
Dunnelaagcytologie
Celblokje
BIJKOMENDE ANALYSES Histochemische kleuringen Immuunhistochemische kleuringen Immuunfluorescentie Elektronenmicroscopie Fluorescente In Situ Hybridisatie (FISH) Chromogene In Situ Hybridisatie (CISH) Mutatie-analyse moleculaire pathologie
Histochemische kleuringen Op basis van chemische reacties tussen kleurstoffen en weefsel- of celcomponenten (Beperkte) rol in diagnostiek: Opsporen van gisten/schimmels/zuurvaste staven (PAS kleuring, Grocott kleuring, Ziehl-Neelsen kleuring) Mucus aantonen in cellen (PAS kleuring) Aantonen van amyloïddeposities (Kongorood) Aantonen van elastine in bloedvaten, pleura (orceïnekleuring)
Grocott kleuring: schimmelorganismen
Ziehl-Neelsen: zuurvaste staven
Immuunhistochemische kleuringen avidine- Aanwezigheid van eiwitten in het weefsel aantonen door middel van specifieke antilichamen Belangrijke rol in dagelijkse diagnostiek Rol in farmacodiagnostiek muis IgG anti-humaan A horse radish peroxidase complex gebiotinyleerd schaap IgG DAB HRP DAB anti-muis IgG antigen A
nucleaire aankleuring membranaire aankleuring cytoplasmatische aankleuring
Immuunhistochemische kleuringen Diagnostiek: Bevestigen van morfologische diagnose vb. S100, melan A, HMB45, SOX10 in melanomen Typeren van morfologisch moeilijk herkenbare cellen of weefsel vb. gecrushte cellen in kleine biopsie: tumor of immuuncellen? Metastasen van tumoren van ongekende oorsprong vb. cytokeratine 7 / cytokeratine 20 profiel in epitheliale tumoren Aantonen van specifieke bacteriële of virale infecties vb. Helicobacter pylori, CMV,
Metastasen van carcinomen van ongekende oorsprong antilichaam CDX2 cytokeratine 7 / cytokeratine 20 ER / PR GATA-3 PAX8 PSA / PSAP SATB2 TTF-1 WT-1 primaire origine gastrointestinaal TABEL borst, gynaecologisch borst, blaas nier, schildklier, gynaecologisch prostaat colorectaal, appendix long, schildklier mesotheel, ovarium
Conner et al. Adv Anat Pathol 2015
Immuunhistochemische kleuringen Farmacodiagnostiek: Selectie van kankerpatiënten die in aanmerking komen voor targeted therapy Oestrogeen- en progesteronreceptor (ER/PR) in borsttumoren tamoxifen (Nolvadex) HER2Neu prescreening in borst- en maagtumoren trastuzumab (Herceptine) EGFR in longtumoren erlotinib (Tarceva) in tweede lijn PD-L1 in longtumoren pembrolizumab (Keytruda) ALK en ROS1 prescreening in longtumoren crizotinib (Xalkori)
In situ hybridisatie Chromogeen (CISH): Chromogeen gelabelde probes binden op specifieke DNA sequenties van viraal (humaan papillomavirus, Epstein-Barr virus) DNA Aflezen met gewone lichtmicroscoop: positief of negatief Aankleuring = aanwezigheid van viraal DNA Fluorescent (FISH): Met rode of groene fluoroforen gelabelde probes binden op specifieke DNA sequenties Aflezen met fluorescentiemicroscoop: signalen en/of signaalpatronen tellen Verschillende signaalpatronen en/of cut-offs voor verschillende testen
HPV CISH
FISH Aantonen van amplificaties of rearrangements van bepaalde genen normaal normaal normaal amplificatie fusie split vb. Her2Neu amplificatie vb. BCL2 rearrangement vb. ALK rearrangement
FISH Her2Neu FISH: amplificatie ALK FISH: rearrangement (split)
FISH Diagnostiek van sarcomen en lymfomen: bevestigen van diagnose gesteld dmv morfologie en immuunhistochemie vb. MDM2 amplificatie in liposarcomen vb. EWS rearrangement in Ewing sarcomen vb. BCL2 rearrangement in folliculaire lymfomen Farmacodiagnostiek HER2Neu amplificatie in borst- of maagtumoren trastuzumab (Herceptine) ALK rearrangement in longtumoren crizotinib (Xalkori) ROS1 rearrangement in longtumoren crizotinib (Xalkori) prescreening met immuunhistochemie (sneller en goedkoper)
Mutatie-analyse Technieken: PCR-gebaseerde technieken Next Generation Sequencing (NGS): multiplex assay (MDG platform) DNA isolatie uit paraffinemateriaal Macrodissectie voor aanrijking van tumorcelpercentage
Mutatie-analyse Farmacodiagnostiek: EGFR mutatie-analyse in longtumoren erlotinib (Tarceva) en gefitinib (Iressa) KRAS en NRAS mutatie-analyse in colorectale tumoren GEEN cetuximab (Erbitux) BRAF mutatie-analyse in melanomen vemurafinib (Zelboraf) c-kit en PDGFRα mutatie-analyse in Gastro-Intestinale Stromale Tumoren (GIST) imatinib (Gleevec)
KWALITEITSZORG Accreditatie volgens ISO15189 Via BELAC op basis van externe audits van het labo
www.apd-uzg.be