VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date du dernière adaption Microscopische identificatie en bepaling van het gehalte (sclerotiën van Claviceps purpurea Tul.) in granen I-MET-FLVVT-111 Microsocpie niet gemalen granen december 2012

FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE Overzicht van de prestatiekenmerken: - Bepaalbaarheidsgrens (LOQ): 80 mg/kg - Aantoonbaarheidsgrens (LOD): 40 mg/kg - Herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding: niveau herhaalbaarheid reproduceerbaarheid terugvinding LOQ 4,0% 4,0% 99,4% 500 mg/kg 6,9% 9,8% 94,0% 1000 mg/kg 4,9% 5,7% 97,2% 1500 mg/kg 4,6% 5,4% 98,0% - Meetonzekerheid meetonzeker heid Laag niveau 30% Midden 20% Hoog 15% - Robuustheid, selectiviteit, specificiteit: De prestatiekenmerken worden gehaald in aanwezigheid van storende bestanddelen De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: Vooropgestelde recovery halen van 70-110% Inhoud: validatierapporten van 2008 en 2011

FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Microscopische identificatie en bepaling van het gehalte (sclerotiën van Claviceps purpurea Tul.) in granen I-MET-FLVVT-111 Microscopie niet gemalen granen Totaal Naam Nom: Jeroen Vancutsem Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Sectiehoofd Get. Microscopie/mycotoxines Datum - Date: 01/02/2008 + 24/11/2011 Jeroen Vancutsem Marc Verschueren Start - Début: november 2007 - januari 2008 / augustus 2011 Einde - Fin: Naam Nom: Mandy Lekens Handtekeningen - Signatures: Functie - Fonction: Laboratoriummanager Datum - Date: 24/11/2011 Get. Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180.

Validatiedossier Microscopische identificatie en schatting van het gehalte (sclerotiën van Claviceps purpurea Tul.) in granen - microscopie 1 Blanco monster Er werden 5 X 6 monsters rogge van 200 g bereid. De rogge werd vooraf nagekeken op aanwezigheid van. Het werd geselecteerd uit natuurlijk gecontamineerde monsters. Er werd gewerkt met korrels die maximaal even groot zijn als normale roggekorrels. 2 De aantoonbaarheidsgrens (LOD) De aantoonbaarheidsgrens werd bepaald door standaardadditie van 1 partikel zodat een concentratie van ongeveer 40 mg/kg bekomen werd. Afgewogen hoeveelheid: Afgewogen Spike Conc. (mg/kg) # deeltjes 1 200,5479 0,0079 39,4 1 2 200,458 0,008 39,9 1 3 199,8382 0,0082 41,0 1 4 200,0275 0,0075 37,5 1 5 200,1776 0,0076 38,0 1 6 201,548 0,008 39,7 1 Gemiddelde concentratie 39,2 mg/kg LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 4/16

Voorbeeld monster Nr 5: Resultaat: Analist 1 (J. Vancutsem) analysedatum: 3/12/07 Analist 2 (M. Verschueren) analysedatum: 23/11/07 Afgewogen Spike Conc. (mg/kg) # deeltjes Afgewogen Spike Conc. (mg/kg) # deeltjes 1 200,28 0,008 39,9 1 1 200,2 0,0113 56,4 2 2 199,75 0,008 40,1 1 2 200,34 0,0084 41,9 1 3 199,77 0,0083 41,5 1 3 199,66 0,0083 41,6 1 4 199,76 0,0076 38,0 1 4 199,76 0,0076 38,0 (1) 5 199,94 0,0075 37,5 1 5 199,79 0,0136 68,1 2 6 201,11 0,0081 40,3 1 6 201,08 0,0081 40,3 1 Gemiddelde (mg/kg) 39,6 Gemiddelde (mg/kg) 47,7 gemiddelde recovery 101% gemiddelde recovery 122% STDEV (mg/kg) 1,51 STDEV (mg/kg) 11,9 RSD (%) 3,8 RSD (%) 25,0% herhaalbaarheid = 2,8 x STDEV 4,2 herhaalbaarheid = 2,8 x STDEV 33,3 outliers (Grubbs G hoogste waarde 1,36 outliers (Grubbs G hoogste waarde 1,71 test), G kritisch : 1,89 G laagste waarde 1,29 test), G kritisch : 1,89 G laagste waarde 0,81 Besluit: Op basis van deze resultaten wordt aangetoond dat de aantoonbaarheidsgrens (LOD) 40 mg/kg bedraagt. In elk van de monsters werd 1 partikel teruggevonden. Bij 2 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 5/16

analyses werden 2 deeltjes teruggevonden. Een mogelijke verklaring is de aanwezigheid van kleine op lijkende partikels zoals de aanwezigheid van raapzaad. 3 De bepaalbaarheidsgrens (LOQ) De bepaalbaarheidsgrens werd bepaald door standaardadditie van 2 partikels zodat een concentratie van ongeveer 80 mg/kg bekomen werd. Afgewogen hoeveelheid: Afgewogen Spike Conc. (mg/kg) # deeltjes 1 200,0649 0,0149 74,5 2 2 199,9859 0,0159 79,5 2 3 200,5667 0,0167 83,3 2 4 200,0959 0,0159 79,5 2 5 200,2657 0,0157 78,4 2 6 200,1254 0,0154 77,0 2 Gemiddelde concentratie 78,7 mg/kg Resultaat: Reeks Reeks 1 3/12/07 J. Vancutsem Afgewogen Uitgezocht Conc. (mg/kg) Rec. (%)# deeltjes 1 199,52 0,015 75,2 100,94 2 2 199,24 0,016 80,3 101,01 2 3 200,23 0,0152 75,9 91,12 2 4 199,84 0,016 80,1 100,75 2 5 199,79 0,0156 78,1 99,62 2 6 199,76 0,0157 78,6 102,08 2 1 199,51 0,0149 74,7 100,27 2 2 199,25 0,0092 46,2* 2 Reeks 2 3 200,12 0,0035 17,5* 1 23/11/07 M. Verschueren 4 199,75 0,0161 80,6 101,38 2 5 199,73 0,0156 78,1 99,62 2 6 199,78 0,0152 76,1 98,83 2 1 198,27 0,0149 75,2 100,94 2 Reeks 3 2 197,82 0,0158 79,9 100,50 2 J. Vancutsem 3 198,91 0,0150 75,4 90,52 2 07-14/01/2008 4 198,49 0,0157 79,1 99,50 2 5 198,54 0,0159 80,1 102,17 2 6 198,30 0,0156 78,7 102,21 2 1 198,13 0,0149 75,2 100,94 2 2 197,64 0,0158 79,9 100,50 2 Reeks 4 M. Verschueren 15-22/01/2008 3 198,78 0,0150 75,5 90,64 2 4 198,36 0,0158 79,7 100,25 2 5 198,35 0,0155 78,1 99,62 2 6 198,19 0,0157 79,2 102,86 2 *: voldoet niet aan vooropgestelde eisen voor recovery: weggelaten uit berekening LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 6/16

gemiddelde* 74,06 gemiddelde recovery** 99,4% herhaalbaarheid RSD (%) 4,0 2,8 x s r 8,13*** reproduceerbaarheid RSD (%) 4,0 2,8 x S R 8,13*** outliers (Grubbs test) G hoogste waarde OK G kritisch : 2,65 G laagste waarde OK *: niet gecorrigeerd tov spike **:na correctie van de individuele spikes ***: gebaseerd op de gemiddelde waarde Besluit: Op basis van deze resultaten wordt aangetoond dat de bepaalbaarheidsgrens (LOQ) 80 mg/kg bedraagt. Voor 23 van de 24 analyses werden 2 deeltjes teruggevonden. Er wordt een recovery van 70-110% vooropgesteld. 4 De herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding: De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden bepaald conform template LAB 00 P 180 F 004 (2012-03-15_LAB-00-P-180-F-004-valkidatie-berekeningen-formules_v01_NL-FR) De herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid werd bepaald a. door standaardadditie van 80 mg/kg op rogge (zie 3. bepaalbaarheidsgrens) Besluit: De terugvinding voldoet aan de vooropgestelde eisen b. door standaardadditie van 500 mg/kg op rogge (1/2 norm) Afgewogen hoeveelheid: Voorbeeld nr 5: Afgewogen Spike Conc. (mg/kg) # deeltjes 1 200,3296 0,0996 497,2 11 2 200,1298 0,0998 498,7 11 3 200,1637 0,1037 518,1 11 4 200,4625 0,1025 511,3 10 5 200,4496 0,0996 496,9 11 6 200,3011 0,1011 504,7 11 Gemiddelde concentratie 504,5 mg/kg LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 7/16

Reeks Reeks 1 3/12/07 J. Vancutsem Reeks 2 1/12/07 M. Verschueren Reeks 3 J. Vancutsem 3-13/12/07 Reeks 4 M. Verschueren 23/11-04/12/2008 Afgewogen Uitgezocht Conc. (mg/kg) 1 199,84 0,0938 469,4 2 199,88 0,1005 502,8 3 199,88 0,103 515,3 4 200,24 0,1039 518,9 5 200,22 0,1001 500,0 6 200,04 0,1025 512,4 1 199,67 0,0931 466,3 2 199,66 0,0784 392,7 3 199,64 0,0862 431,8 4 200,18 0,0981 490,1 5 200,14 0,0867 433,2 6 199,98 0,0812 406,0 1 199,38 0,1008 505,6 2 199,45 0,1005 503,9 3 199,38 0,104 521,6 4 199,75 0,1023 512,1 5 199,79 0,1 500,5 6 1 199,77 0,1004 502,6 2 199,91 0,0932 466,2 3 199,88 0,09 450,3 4 200,25 0,0849 424,0 5 200,26 0,1 499,4 6 200,1 0,076 379,8 Rec. (%) # deeltjes 94,41 10 100,82 11 99,46 11 101,49 10 100,62 11 101,53 11 93,79 78,74 83,34 95,85 87,18 80,44 101,69 11 101,04 11 100,68 11 100,16 10 100,72 11 101,09 10 93,48 10 86,91 9 82,93 8 100,50 10 75,25 8 gemiddelde* 474,13 gemiddelde recovery* 94,0 herhaalbaarheid RSD (%) 6,94 2,8 x s r 92.12*** reproduceerbaarheid RSD (%) 9,80 2,8 x S R 130,15*** outliers (Grubbs test) G hoogste waarde OK G kritisch : 2,65 G laagste waarde OK *: niet gecorrigeerd tov spike **:na correctie van de individuele spikes ***: gebaseerd op de gemiddelde waarde Besluit: De terugvinding voldoet aan de vooropgestelde eisen LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 8/16

c. door standaardadditie van 1000 mg/kg op rogge (norm) Afgewogen hoeveelheid: afgewogen spike Conc. (mg/kg) # deeltjes 1 200,6222 0,2022 1007,9 19 2 200,0697 0,1997 998,2 17 3 200,2523 0,2023 1010,2 16 4 200,6598 0,1998 995,7 13 5 200,3106 0,2006 1001,4 16 6 200,1815 0,2015 1006,6 13 Gemiddelde concentratie 1003,3 mg/kg Reeks Reeks 1 7/12/07 J. Vancutsem Reeks 2 30/11/07 M. Verschueren Reeks 3 J. Vancutsem 7-17/12/07 Reeks 4 M. Verschueren 23/11-4/12/07 Afgewogen Uitgezocht Conc. (mg/kg) 1 200,12 0,2035 1016,9 2 199,31 0,2024 1015,5 3 199,56 0,1982 993,2 4 199,97 0,201 1005,2 5 199,74 0,2 1001,3 6 199,52 0,2021 1012,9 1 200,36 0,1864 930,3 2 199,72 0,1603 802,6 3 199,96 0,1911 955,7 4 200,34 0,2011 1003,8 5 200,08 0,1912 955,6 6 199,6 0,1877 940,4 1 200,17 0,2034 1016,1 2 3 199,47 0,1961 983,1 4 199,6 0,2003 1003,5 5 199,5 0,1988 996,5 6 198,98 0,1999 1004,6 1 200,59 0,1911 952,7 2 199,86 0,2018 1009,7 3 200,06 0,2057 1028,2 4 200,41 0,2012 1003,9 5 200,16 0,1725 861,8 6 199,57 0,1876 940,0 Rec. (%) # deeltjes 100,89 19 101,73 18 98,32 17 100,95 13 99,99 16 100,63 13 92,30 80,40 94,61 100,81 95,43 93,42 100,81 19 97,32 17 100,78 13 99,51 16 99,80 13 94,52 101,15 18 101,78 17 100,82 13 86,06 13 93,38 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 9/16

gemiddelde* 975,37 gemiddelde recovery** 97,2 herhaalbaarheid RSD (%) 4,92 2,8 x s r 134,33*** reproduceerbaarheid RSD (%) 5,74 2,8 x S R 156,83*** outliers (Grubbs test) G hoogste waarde OK G kritisch : 2,65 G laagste waarde NOK,recovery OK *: niet gecorrigeerd tov spike **:na correctie van de individuele spikes ***: gebaseerd op de gemiddelde waarde Besluit: De terugvinding voldoet aan de vooropgestelde eisen d. door standaardadditie van 1500 mg/kg op rogge (1,5 X norm) Afgewogen hoeveelheid: Afgewogen Spike Conc. (mg/kg) # deeltjes 1 200,3203 0,3003 1499,1 22 2 200,861 0,301 1498,5 20 3 199,6213 0,3013 1509,4 21 4 200,6513 0,3013 1501,6 20 5 200,3498 0,2998 1496,4 20 6 200,7908 0,3008 1498,1 20 Gemiddelde concentratie 1500,5 mg/kg Voorbeeld Nr 5: LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 10/16

Reeks Reeks 1 7/12/07 J. Vancutsem Reeks 2 30/11/07 M. Verschueren Reeks 3 J. Vancutsem 7-17/12/07 Afgewogen Uitgezocht Conc. (mg/kg) 1 199,41 0,3036 1522,5 2 199,92 0,3049 1525,1 3 198,7 0,3011 1515,3 4 199,83 0,2954 1478,3 5 199,49 0,3038 1522,9 6 199,85 0,3024 1513,1 1 199,97 0,2964 1482,2 2 200,19 0,2856 1426,6 3 199,97 0,2902 1451,2 4 200,35 0,2934 1464,4 5 200,07 0,3049 1524,0 6 199,6 0,1877 940,4* 1 2 199,65 0,2905 1455,0 3 198,4 0,2937 1480,3 4 199,6 0,3052 1529,1 5 199,29 0,3034 1522,4 Rec. (%) # deeltjes 101,56 22 101,78 20 100,39 20 98,45 20 101,77 20 101,00 20 98,87 95,20 96,14 97,52 101,84 97,10 98,07 101,83 101,74 100,74 6 199,25 0,3007 1509,2 20 1 200,3 0,3049 1522,2 101,54 2 200,15 0,2879 1438,4 95,99 3 198,9 0,2771 1393,2 92,30 Reeks 4 4 200,45 0,2924 1458,7 97,14 M. 5 200,14 0,2877 1437,5 96,06 Verschueren 23/11-4/12/07 6 199,93 0,2358 1179,4 78,73 *: voldoet niet aan vooropgestelde eisen voor recovery: weggelaten uit berekening gemiddelde* 1447,45 gemiddelde recovery** 98,0 herhaalbaarheid RSD (%) 4,59 2,8 x s r 189,08*** reproduceerbaarheid RSD (%) 5,35 2,8 x S R 220,39*** outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,65 *: niet gecorrigeerd tov spike G hoogste waarde G laagste waarde **:na correctie van de individuele spikes ***: gebaseerd op de gemiddelde waarde Besluit: De terugvinding voldoet aan de vooropgestelde eisen 19 19 21 20 OK NOK,recovery NOK, weggelaten uit berekening LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 11/16

5 Meetonzekerheid: Voor het bepalen van de meetonzekerheid werd de volgende strategie gevolgd: Eerst wordt nagegaan of de bias significant is (in dat geval is de bias > 2s RW ). conc. bias (%) 2s RW (%) b > 2s RW? LOQ -0,63 8,0 500 mg/kg -5,99 19,60 1000 mg/kg -2,81 11,48 1500 ppb -2,01 10,70 We kiezen de volgende formule: 2 2 uc ubias u(rw) met u bias RMS bias 2 2 2 u ( spiking) u(cref, spike) (meetonzekerheid op basis van recovery) en u(r W ) = s R Met RMS 2 bias (%) LOQ 13,07 500 mg/kg 108,39 1000 mg/kg 35,96 1500 ppb 28,82 u(spiking): de onzekerheid op de spiking zelf. Hierbij wordt de onzekerheid op het gewicht van het afgewogen monster in rekening gebracht. De limiet van de balans is 0,1 mg. De onzekerheid heeft een rechthoekige verdeling. u(spiking) = 0,1 / 2 * 3 mg = 0,029 mg = 0,000014% (op 200g) u(spiking) 2 =2.10-10 u(cref, spike) Dit is de onzekerheid op de referentiewaarde. Hier wordt de onzekerheid genomen op het gewicht van het. 0,1 / 2 * 3 mg = 0,029 mg. Uitgedrukt in % geeft dit volgende relatieve waarden: Conc. u(cref, spike) 2 (%) 80 mg/kg 0,0361 500 mg/kg 0,0008 1000 mg/kg 0,0002 1500 mg/kg 0,0001 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 12/16

Samengevat LOQ 500 mg/kg 1000 mg/kg 1500 mg/kg RMS 2 bias (%) 13,07 108,39 35,96 28,82 u(spiking) 2 - - - - u(cref spike) 2 0,04 - - - som (u 2 bias ) 13,11 108,39 35,96 28,82 u 2 Rw = s 2 R (rel) LOQ 16,00 0,5 mg/kg 96,04 1 mg/kg 32,95 1,5 mg/kg 28,62 u c LOQ 5,40 0,5 mg/kg 14,30 1 mg/kg 8,30 1,5 mg/kg 7,58 U = 2u c LOQ 10,79% 0,5 mg/kg 28,60% 1 mg/kg 16,60% 1,5 mg/kg 15,16% Samengevat Relatieve meetonzekerheid: LOQ 10,79 0,5 mg/kg 28,60 1 mg/kg 16,60 1,5 mg/kg 15,16 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 13/16

Besluit meetonzekerheid: meetonzekerheid gebied LOQ-1/2 norm 30% gebied ½ norm 3/2 norm 20% gebied > 3/2 norm 15% 6 ringonderzoeken jaar organisatie Resultaat (%) Referentiewaarde (%) Gemiddelde resultaat uit ringtest STDEV 2004 IAG 0,975 0,99 0,86 0,35 0,254 0,25 0,25 0,20 0,05 0,05 0,055 0,088 0,226 0,25 0,27 0,20 2005 IAG 0,165 0,15 0,12 0,061 0,263 0,25 0,21 0,086 0,0482 0,03 0,051 0,035 LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 14/16

7 Robuustheid, selectiviteit en specificiteit: Analyse van in aanwezigheid van storende bestanddelen: negerzaad, koolzaad, zwarte rijst Door een derde (Rudy Van Meerbeek, afdeling mycotoxines) werden 6 monsters rogge (250g) blind bereid. De enige gegeven aanwijzingen waren: storende bestanddelen en 0-0,5g en minstens 1 blanco. Volgende monsters werden bereid en nadien geanalyseerd door 2 bevoegde analisten: Jeroen Vancutsem en Marc Verschueren Analist monsternr Marc Verschueren Jeroen Vancutsem 1 11330178 0,0400g (160 mg/kg, 5 partikels), koolzaad 0,2160g, Negerzaad 162 mg/kg (6 deeltjes) 156 mg/kg (5 deeltjes) 0,1520g, Zwarte rijst 0,2836g 2 11330179 0,1530g (612 mg/kg, 7 partikels),, Negerzaad 0,2948g 615 mg/kg (6deeltjes) 640 mg/kg (7 deeltjes) 3 11330180 koolzaad 0,068g, Negerzaad 0,058g Afwezig Afwezig 4 11330181 0,1316g (526 mg/kg, 3 partikels), koolzaad 0,2883g, Negerzaad 530 mg/kg (3 deeltjes) 530 mg/kg (3 deeltjes) 0,040g 5 11330182 Zwarte rijst 0,1322g Afwezig Afwezig 6 11330183 0,1731g (692 mg/kg, 7 partikels), Negerzaad 0,3848g, Zwarte rijst 0,2566g 691 mg/kg (6deeltjes) 720 mg/kg (7 deeltjes) Deze resultaten voldoen aan de verwachte terugvinding van 70-110% en de reproduceerbaarheid uit het validatiedossier. LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 15/16

8 Beschrijving referentiemateriaal Het referentiemateriaal werd geselecteerd uit besmette roggemonsters en wordt bewaard in de referentiecollectie als P165. Tevens zijn er als vergelijkingsmateriaal besmette tarwekorrels met Tilletia indica beschikbaar. REFERENTIEMETHODE: IAG-methode: Nachweis und Schätzung von Mutterkornbestandteilen in Futtermitteln (Sklerotien von Claviceps purpurea Tul.) LAB 00 P 180 F 002 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-01-20 16/16