PVE-SALMONELLA-IQ-II. Versie: Sa-I002

Transcriptie

1 PVE-SALMONELLA-IQ-II Wijzigingen (op hoofdlijnen) ten opzichte van de vorige versie: Als gevolg van wijzigingen in de hygiënebesluiten aangaande het verzenden van monsters is onderdeel 7.1 (van paragraaf 1) aangepast Paragraaf 1 PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van iq- Check TM Salmonella II real-time PCR in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee. 1. Onderwerp Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de iq-check TM Salmonella II kit (Bio-Rad Laboratories b.v.) in dons, mest en vlees afkomstig van pluimvee. 2. Definitie Salmonella: alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd. Met behulp van de real-time polymerase chain reaction (PCR) worden Salmonella-specifieke DNA sequenties gelijktijdig vermenigvuldigd en gedetecteerd middels fluorescente probes. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur. 4. Reagentia en andere materialen De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in paragraaf 2. Er mag echter ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. De iq-check TM Salmonella II kit bestaat uit kant-en-klare reagentia. Alle gebruikte grondstoffen en het water moeten van analysekwaliteit zijn. Voor algemene eisen en richtlijnen voor microbiologische onderzoeken wordt verder verwezen naar NEN-EN-ISO 7218: Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water (BPw) paragraaf iq-check TM Salmonella II kit Bio-Rad code , paragraaf 2.2 Pagina 1 van 7

2 5. Apparatuur en verbruiksmaterialen De gebruikelijke apparatuur voor een moleculair/microbiologisch laboratorium en de voor de iq-check TM Salmonella II test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. Apparatuur 5.1 icycler Thermal Cycler met 96-wells reactiemodule (Bio-Rad cat. #: ) 5.2 icycler iq Optical Module (Bio-Rad cat. #: ) 5.3 icycler iq5 Real Time PCR system (Bio-Rad cat. #: ) 5.4 Chromo4 Real Time PCR system (Bio-Rad cat. #: G) 5.5 Mini-Opticon Real Time PCR system(bio-rad cat. #: ) 5.6 CFX96 Real Time PCR system (Bio-Rad cat. #: ) 5.7 Stomacher 5.8 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 C ± 1 C 5.9 Verhittingsblok voor 1,5 ml buizen 100 C ± 1 C 5.10 Tafelcentrifuge (maximaal rpm, voor 1,5 ml buizen) 5.11 Vortex 5.12 Magnetische roerder µl, 200 µl and 1000 µl micropipetten 5.14 Combi-tips pipetten Opmerking: Het gebruik van een universal power source (UPS) in combinatie met de icycler iqtm wordt aanbevolen. Inmiddels (anno 2009) is de icycler iq niet meer leverbaar en de iq5 alleen nog beperkt als refurbished (2 e hands) te verkrijgen. De gebruiker heeft een keuze uit 5 systemen (icycler iq, iq5, Chromo4, Mini-Opticon en CFX-96). Verbruiksmaterialen 5.15 icycler iq 96-well PCR platen (Bio-Rad cat. #: ) 5.16 icycler iq Optical sealing tape (Bio-Rad cat. #: ) μl 8-strip tubes (Bio-Rad cat. #: ) μl 8-strip caps for 200 µl tubes (Bio-Rad cat. #: ) 5.16 Multiplate PCR plates, white (Bio-Rad cat. #:35M-LL4851), 48wells 5.17 Multiplate PCR plates, white (Bio-Rad cat. #:35M-LL9651), 96wells strip tubes, white (Bio-Rad cat. #:35T-LS0851) strip caps, (Bio-Rad cat. #:35T-CS0803) 5.20 MSB sealing tape (Bio-Rad cat. #:35M-SB1001) 5.21 Stomacher zakken met filter ml en 10 ml pipetten 5.23 Steriele filtertips, passend op 20 µl, 200 µl en 1000 µl micropipetten ,5 ml Eppendorf SafeLock buisjes 5.25 Combi-tips tips, steriel, individueel verpakt ml and 5 ml steriele buizen of flesjes 5.27 Poeder-vrije handschoenen 5.28 Milli-Q of gedestilleerd steriel water 5.29 Ethanol 96% of NaOH 5% Opmerking: Artikelen genoemd onder betreffen artikelen voor Chromo4, Mini-Opticon en CFX Pagina 2 van 7

3 6. Voorzorgsmaatregelen en aanbevelingen De test dient te worden uitgevoerd door getraind personeel. Monsters en kweken dienen te worden behandeld en afgevoerd als potentieel infectieus materiaal. De kwaliteit van de resultaten is afhankelijk van een strikte uitvoering conform Good Laboratory Practice, in het bijzonder aangaande PCR: Gebruik specifieke, gescheiden sets laboratorium benodigdheden zoals pipetten en buizen voor bijvoorbeeld DNA extractie en de bereiding van PCR mix. Het is van groot belang dat gebruik wordt gemaakt van een positieve en negatieve controle in elke serie van amplificatie reacties ( PCR run ). Gebruik geen reagentia waarvan de houdbaarheidsdatum is verstreken. Homogeniseer reagentia voorafgaand aan gebruik. Controleer regelmatig de nauwkeurigheid en precisie van alle pipetten en apparatuur. Verwissel handschoenen met enige regelmaat, vooral indien contaminatie wordt verondersteld. Voer periodieke reiniging uit van de werkplaats met tenminste 5% bleekmiddel. Vermijdt gebruik van latex handschoenen met poeder. Voorkom vingerafdrukken op het optisch sealing tape. Schrijf niet op de caps van PCR-tubes of op de sealtap, danwel tubes. In beide gevallen zal de real-time data-acquisitie hinder ondervinden. Aan de zijkanten van de strips zitten randen of lipjes waarop een ID genoteerd kan worden. Strips zijn gemerkt met letters A en H aan de uiteinden. 7. Werkwijze 7.1 Algemeen Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-8 C) te worden aangeleverd. Zie voor de ontvangst van monsters en registratie van afwijkingen de betreffende bijlage van het Besluit erkenningsvoorwaarden en werkwijzen laboratoria (PPE) 2009 of diens rechts opvolgers. De monsters dienen uiterlijk de tweede dag na monsterneming te worden ingezet. Stel monsters zo min mogelijk bloot aan temperatuurschommelingen. Opmerking: Komen mestmonsters mee met vleesmonsters in een koelbox, sla dan alle monsters gekoeld op. Worden mestmonsters per post ongekoeld verstuurd, sla dan op bij kamertemperatuur, tenzij deze monsters pas de volgende dag worden ingezet. 7.2 Voorbehandeling van het monster en ophoping Ophopingsmedium dient op incubatie temperatuur (37 C) te zijn voorafgaand aan gebruik. Homogenizeer 25 g monster in 225 ml gebufferd pepton water, in een stomacher zak met filter. Incubeer zonder schudden gedurende 18 uur ± 2 uur bij 37 C. Opmerking: Bij verwerking van borstvel ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling. Pagina 3 van 7

4 7.3 DNA extractie Pipetteer 1 ml ophoping met een disposable pipet in een 1,5 ml Eppendorf (schroefdopje) buis (voorkom pipetteren van grote fragmenten van monsterresten). Schudt de ophoping niet voorafgaand aan het pipetteren van het monster. De overige stappen voor de DNA extractie worden uitgevoerd zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de iq-check TM Salmonella II testkit (Bio-Rad, 2007). Opmerking: In geval van ophopingen met een vettig supernatant, neem het monster juist onder deze vetlaag. 7.4 Apparaat en software gebruik, uitvoering PCR, data analyse Apparatuur en software gebruik, uitvoering PCR en data analyse worden allen uitgevoerd zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de iq-check TM Salmonella IItestkit (Bio-Rad, 2007). 7.5 Interpretatie van resultaten Resultaten worden geïnterpreteerd middels analyse van de Ct-waarden (threshold cycle) van elk monster. Volg hiervoor het voorschrift van de fabrikant. Een positief Salmonella monster dient een Ct-waarde >/= 10 voor de FAM fluorophore te hebben. Indien de Ct-waarde lager dan 10 is, dient het verloop van de amplificatiecurve gecontroleerd te worden zoals beschreven in gebruiksaanwijzing; de curve dient een vlakke basislijn te vertonen, gevolgd door een geleidelijke toename van fluorescentie. Indien de curve correct is, kan het monster positief voor Salmonella worden bevonden. Indien geen Ct-waarde (Ct=N/A, not applicable ) voor FAM is toegekend aan een monster, of de curve een niet-kenmerkend verloop vertoont, moet de interne controle van dat monster worden geanalyseerd. Wanneer geen Ct-waarde (Ct=N/A) wordt verkregen voor FAM, dan is de uiteindelijke interpretatie van het resultaat afhankelijk van de interne controle: - Een monster wordt negatief beschouwd voor Salmonella indien geen Ct-waarde voor FAM is toegekend, en de interne controle (HEX) een Ct-waarde > 10 heeft. - Indien de interne controle ook geen Ct-waarde is toegekend (Ct = N/A), dan is interpretatie van het resultaat onmogelijk. Een dergelijk resultaat kan een indicatie zijn van remming van de PCR reactie. In dit geval dient het monster (DNA-extract) 1/10 verdund te worden in steriel gedestilleerd water en moet de PCR reactie worden herhaald. Verdunningsprotocol gaat als volgt: 90μl steriel water met 10μl DNA. Hiervan wordt namengen en kort centrifugeren (short spin) 5μl toegevoegd aan de PCRmix. Interpretatie van monsterresultaten: Salmonella detectie Interne controle detectie Resultaat (FAM-490) (HEX) Ct >/ = 10 Niet van belang Positief Ct = N/A Ct > 10 Negatief Ct = N/A Ct = N/A Inhibitie* * Wanneer zowel Salmonella als interne controle detectie een Ct = N/A oplevert, dient het monster opnieuw getest te worden middels een 1/10 verdunning van het DNAextract. Pagina 4 van 7

5 Opmerking: Bio-Rad heeft inmiddels software ter beschikking gesteld waarin de FAM en HEX waarden via Copy-Paste ingevuld kunnen worden. Er volgen automatisch antwoorden per monster als: positief, negatief en inhibitie. Tevens worden automatisch de waarden van de kitcontroles gevalideerd. Dit rapport kan in een PDF file geconverteerd worden. De software heet : iqcheck Analysis TM. Bovendien hebben de Chromo4 en Mini-Opticon systemen deze software al aan boord, zodat direct een rapport kan worden aangemaakt. Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aangetoond. Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella niet aangetoond. Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de iq-check TM Salmonella II test is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist. Omdat echter in alle gevallen van Salmonella-positieve monsters betreffende het PVE actieplan een nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelfde BPW-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en XLD uitgevoerd te worden volgens PVE-SALMONELLA-MSRV, gevolgd door serotypering van het isolaat (PVE-SALMONELLA-SERO). 8. Controle De iq-check TM Salmonella II test kit bevat een positieve en een negatieve controle. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen. Ten behoeve van de validatie van het gehele experiment dienen de controles te voldoen aan de volgende eisen, weergegeven in onderstaande tabel. Is dit niet het geval, dan moet de PCR reactie worden herhaald. Salmonella detectie (FAM-490) Interne Controle detectie (HEX) Negatieve controle Ct = N/A* 28 < Ct < 40 Positieve controle 26 < Ct < 36 Niet van belang * De software geeft een Ct waarde N/A (not applicable) indien de fluorescentie van een monster niet significant boven de achtergrond ruis uitkomt en dus de threshold niet snijdt. Voor de eerstelijnscontrole van de methode als geheel dienen te worden meegenomen: - Blanco controle, - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen), - Positieve controle. 9. Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als Salmonella aangetoond / niet aangetoond in het betreffende monstermateriaal als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden hoeveel gram monstermateriaal is onderzocht. Pagina 5 van 7

6 Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden (zie bijlage V), dan dient het laboratorium op het analysecertificaat hierover een opmerking te maken en de eventuele gevolgen voor de betrouwbaarheid van de uitslag aan te geven. 10. Bronvermelding AFNOR Validation Certificate, iq-check TM Salmonella II, attest BRD-07/06-07/04. Gebruiksaanwijzing van de iq-check TM Salmonella IITest. Bio-Rad Laboratories b.v., 30 augustus 2007, Veenendaal, NL. Miras I., Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of laga and lagb genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 (1): (1995). NEN-EN-ISO 6579:2002. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders Horizontale methode voor het aantonen van Salmonella spp. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft. NEN-EN-ISO 7218:2007 En. Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken. Nederlands Normalisatie Instituut, Delft. PVE-SALMONELLA-MSRV. PVE Branchemethode voor het aantonen van Salmonella met behulp van MSRV in dons, mest en vlees, afkomstig van pluimvee. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. PVE-SALMONELLA-SERO. Toelichting op de serotypering van Salmonella volgens het Kauffmann-White schema. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Zoetermeer. Tyagi, S. and Kramer, F.R. Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology 14: (1996). Pagina 6 van 7

7 Paragraaf 2 PVE-SALMONELLA-IQ-II: Samenstelling en bereiding van media en reagentia 1. Voorophopingsmedium: Gebufferd pepton water (BPw) Samenstelling: Pepton NaCI Na2HP04.12H20 KH2P04 Water 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1,5 g 1000 ml Bereiding: - Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting); - Indien nodig, stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,0 ± 0,2 bij 25 C bedraagt; - Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen of potten; - Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 C). 2. Samenstelling iq-check TM Salmonella II test kit Samenstelling: ID Reagens Verstrekte hoeveelheid A Lysis reagens 1 fles (20 ml) B Fluorescente probes 1 buis (0.550 ml) C Amplificatie mix 2 buizen (2 x 2.2 ml) D PCR negatieve controle 1 buis (0.5 ml) E PCR positieve controle 1 buis (0.250 ml) De iq-check TM Salmonella II kit, Bio-Rad code , bevat reagentia ten behoeve van 96 testen. Pagina 7 van 7