S-DiaMGTV TM Real-Time PCR detectie van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis

Transcriptie

1 DIAGENODE Human Rhinovirus Real-Time PCR kit INSTRUCTIONS FOR USE Kit Referentie: DDGS-60-L100 Versie 01 Laatste herzieningsdatum: S-DiaMGTV TM Real-Time PCR detectie van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis

2 Diagenode sa / CHU - Tour GIGA - B34 3 rd Floor // Avenue de l Hôpital, 1 // 4000 Liège (Sart Tilman) // Belgium // Phone: (+32) // Mail: info@diagenode.com P a g e 2

3 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie: Vorige versie: Herzieningsdatum Omschrijving Kleine wijzigingen in de tabel op pagina 40 Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

4

5 P a g e 1 1. INTRODUCTIE WOORDENLIJST ALGEMENE INFORMATIE BEOOGD GEBRUIK INFORMATIE OVER DE PATHOGENEN PRINCIPE TARGET SEQUENTIES INHOUD VAN DE KIT KWALITEITSCONTROLE REAGENS OPSLAG, HANTERING EN STABILITEIT WAARSCHUWINGEN EN VOORZORGSMAATREGELEN PROTOCOL ALGEMEEN OVERZICHT ROCHE MAGNA PURE 96 SYSTEEM EN ROCHE LIGHTCYCLER 480 REAL-TIME PCR SYSTEEM... 9 I. BENODIGDHEDEN (NIET MEEGELEVERD) II. MATERIAAL AFNAME, OPSLAG EN TRANSPORT III. EXTRACTIE PROCEDURE IV. MIX BEREIDING EN DOSERING V. REAL-TIME PCR SYSTEEM INSTELLEN VI. INTERPRETATIE VAN RESULTATEN ABBOTT M2000 APPARAAT I. BENODIGDHEDEN (NIET MEEGELEVERD) II. MATERIAAL AFNAME, OPSLAG EN TRANSPORT III. EXTRACTIE PROCEDURE IV. MIX BEREIDING EN DOSERING V. REAL-TIME PCR SYSTEEM INSTELLEN VI. INTERPRETATIE VAN RESULTATEN ROCHE COBAS 4800 SYSTEEM I. BENODIGDHEDEN (NIET MEEGELEVERD) II. MATERIAAL AFNAME, OPSLAG EN TRANSPORT III. EXTRACTIE PROCEDURE IV. MIX BEREIDING EN DOSERING V. REAL-TIME PCR SYSTEEM INSTELLEN VI. INTERPRETATIE VAN RESULTATEN HANDLEIDING PROBLEMEN OPLOSSEN EVALUATIE VAN DE KIT ANALYTISCHE GEVOELIGHEID NAUWKEURIGHEID ANALYTISCHE SPECIFICITEIT INTERFERENTIE KLINISCHE WERKING PREVALENTIE... 45

6 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 10. TEST BEPERKINGEN KWALITEIT CERTIFICERING REFERENTIES VERKLARING VAN SYMBOLEN MEDEDELING AAN KOPER... 48

7 P a g e 1 1. Introductie De real-time polymerase chain reaction (polymerase ketting reactie), ook kwantitatieve realtime polymerase chain reaction (qpcr) genoemd, is een op nucleïnezuur gebaseerde technologie die gebruikt wordt om specifieke DNA sequenties, die verkregen zijn door directe extractie of door reverse transcriptie van RNA sequenties, te detecteren en te kwantificeren. Deze kwantificatie kan in een absoluut of relatief aantal kopieën gemeten worden. Real-time PCR technologie resulteert in snelle, specifieke en kwantitatieve bepalingen van de aanwezigheid van genen die betrokken zijn bij infectieziekten, kanker en genetische afwijkingen. Deze krachtige technologie wordt gebruikt in de kits van Diagenode om nauwkeurig het aantal ziekte pathogenen te bepalen. Een van de belangrijkste kenmerken van qpcr technologie is de real-time kwantificatie gedurende alle PCR amplificatie cycli van geamplificeerd DNA terwijl het zich vormt in de reactie, hetgeen dus nauwkeurigere metingen oplevert vergeleken met traditionele eindpunt PCR. Deze real-time metingen zijn mogelijk door het kwantificeren van signalen van fluorescente kleurstoffen die intercaleren met het dubbelstrengs DNA geproduceerd in elke amplificatie cyclus. Als alternatief gebruikt men gelabelde DNA oligonucleotide probes met een fluorofoor (bijv. een TaqMan probe) die hybridiseren met het complementaire DNA om real-time metingen te realiseren tijdens qpcr. De gevormde fluorescente signalen kunnen nauwkeurig worden gemeten en gekwantificeerd door gebruikt te maken van een apparaat zoals een thermocycler die is aangepast voor qpcr. Figuur 1: Technologie die dubbel-gelabelde hydrolyse probes gebruikt Figuur 2: Specifieke hybridisatie van primers en probes aan het target gen Figuur 3: Elongatie en afsplitsing van fluorofoor door Taq polymerase.

8 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 2. Woordenlijst C + C - CI Cp Ct DNA DR EIC Ex. Em. IVD LC LoD MG MGP MGTV MM PBS PCR PP PPc PPp qpcr RD RNA STM TM TR TV UIC YD Positieve controle Negatieve controle Betrouwbaarheidsinterval (Confidence Interval) Snijpunt (Crossing Point) Drempelwaarde van cyclus (Cycle Threshold) Deoxyribonucleïnezuur Dragonfly orange (kleurstof) Extractie en Inhibitie Controle Excitatie Emissie In-vitro Diagnostisch LightCycler Detectielimiet (Limit of Detection) Mycoplasma genitalium Magnetische glas deeltjes (Magnetic Glass Particles) Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis Master Mix Fosfaat gebufferde zoutoplossing (Phosphate Buffered Saline) Polymerase Ketting Reactie (Polymerase Chain Reaction) Probe en Primers Probe en Primers voor controle Probe en Primers voor pathogeen Kwantitatieve Polymerase Ketting Reactie (quantitative PCR) Rode Kleurstof (Red Dye) Ribonucleïnezuur Materiaal Transport Medium (Specimen Transport Medium) Transport Medium Texas Red (kleurstof) Trichomonas vaginalis Universele Inhibitie Controle Gele Kleurstof (Yellow Dye) P a g i n a 2

9 P a g i n a 3 3. Algemene Informatie 3.1 Beoogd Gebruik De S-DiaMGTV TM kit is een in vitro diagnostische assay waarmee met PCR de kwalitatieve detectie van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis in klinisch materiaal (mannelijke en vrouwelijke urine, urogenitale uitstrijken in Abbott, Cobas en Amplicor transport medium) van patiënten, die mogelijk geïnfecteerd zijn met deze pathogenen, mogelijk is. Deze IVD assay is bedoeld als een hulpmiddel bij de diagnose van seksueel overdraagbare aandoeningen en mag alleen in diagnostieklaboratoria worden gebruikt door gekwalificeerde technici. 3.2 Informatie over de Pathogenen Mycoplasma genitalium is een kleine parasitaire bacterie die leeft op de trilhaarepitheelcellen van zowel het voortplantings- als het ademhalingssysteem van primaten. Besmetting met Mycoplasma genitalium komt relatief veel voor, kan worden overgedragen tussen partners tijdens onbeschermde geslachtsgemeenschap en kan worden behandeld met antibiotica. Mycoplasma genitalium wordt in verband gebracht met urethritis bij zowel mannen als vrouwen en met cervicitis bij vrouwen. Bij Mycoplasma genitalium geïnfecteerde mannen komt symptomatische urethritis meer voor dan asymptomatische urethritis. Ten gevolge van langzame celdeling en strikte groeicondities is het gebruik van een kweek in klinische praktijken niet mogelijk. Polymerase ketting reactie (PCR) is momenteel de voorkeursmethode voor detectie. Trichomonas vaginalis is een anaerobe, protozoa met flagellen, een soort micro-organisme dat de veroorzaker is van trichomoniasis. Trichomoniasis is de meest voorkomende pathogene protozoa infectie bij mensen in geïndustrialiseerde landen (1). Bij benadering doen zich ieder jaar 7,4 miljoen nieuwe gevallen voor bij vrouwen en mannen (2). Het aantal besmettingen bij mannen en vrouwen is gelijk, maar alleen vrouwen vertonen symptomen (vaginitis, urethritis, en cervicitis) terwijl besmettingen bij mannen meestal asymptomatisch zijn. Overdracht vindt direct plaats omdat de trofozoïeten zich niet ontwikkelen naar het cyste stadium. Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

10 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 3.3 Principe De S-DiaMGTV TM assay wordt uitgevoerd na de extractie van nucleïnezuren uit het materiaal van een urogenitale uitstrijk of van urine. De S-DiaMGTV TM kit is een multiplex kit die primers bevat waarmee de amplificatie van een specifiek deel van het Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis genoom in één reactie mogelijk is. Elk geamplificeerd target gen wordt gedetecteerd door een specifieke hydrolyse probe die gelabeld is met een unieke fluoriserende kleurstof. De uitgestraalde fluorescentie wordt gemeten en geanalyseerd door het optische deel van de real-time PCR machine. Het wel of niet meten van het fluorescentie signaal geeft de aan- of respectievelijk de afwezigheid aan van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis in het klinisch materiaal in kwestie. 3.4 Target Sequenties De primers zijn ontwikkeld om specifiek te hybridiseren met de meest geconserveerde sequentie van het target pathogeen. Pathogeen Target Sequenties (3), (4), (5) Mycoplasma genitalium mgpa en mg219 gen Trichomonas vaginalis Repeatsequentie De probe is ontwikkeld om specifiek te hybridiseren met de meest geconserveerde sequentie van het target pathogeen en bevat een reporter kleurstof op zijn 5' uiteinde waarvan de emissie wordt geremd door een tweede kleurstof op zijn 3' uiteinde. Pathogenen Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis Reporter Kleurstoffen FAM (Ex./Em.: 494/520 nm) YELLOW (Ex./Em.: 530/549 nm) 3.5 Inhoud van de Kit Deze kit bevat de volgende reagentia: Reagentia box Reagentia Kleur Dopje Volume Hoeveelheid M.genitalium/T.vaginalis (FAM/YD) Double-Dye Probe & Primers Rood 250 µl 1 epje M.genitalium/T.vaginalis negative control Licht blauw 250 µl 1 epje M.genitalium/T.vaginalis positive control Groen 250 µl 1 epje H 2O (Rnase/Dnase-vrij) Donker Blauw 1000 µl 1 epje M.genitalium/T.vaginalis PCR mix* 1 Bruin Leeg 1 epje * Enkel voor gebruik in combinatie met het LightCycler 480 systeem. De hoeveelheid probes en primers is voldoende voor 100 PCR reacties met een eindvolume van 25 µl. P a g i n a 4

11 P a g i n a 5 4. Kwaliteitscontrole Kwaliteitscontrole procedures zijn bedoeld om de werking van reagentia en assay te monitoren. Kwaliteitscontrole voorschriften moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met lokale, provinciale en/of federale regelgeving of accreditatie eisen en standaard kwaliteitscontrole procedures van uw laboratoria. Er zijn verschillende controles: Positieve en negatieve controles Interne controle Voor elke run: De PCR procedure moet een negatieve en een positieve controle bevatten om de werking van de testen te monitoren. Een positieve controle is essentieel voor het beoordelen van de efficiëntie van de amplificatie stap en maakt een uit te voeren controle van de kwaliteit van de gebruikte reagentia mogelijk (bijv. Integriteit van de probes en primers). De Diagenode positieve controle wordt in het bijzonder herkend door de in de S-DiaMGTV TM kit aanwezige primers en probes gelabeld met de FAM en YD reporter. Een negatieve controle is essentieel om gecontamineerde reagentia (bijv. master mix, RNase/DNase-vrij water, primers en probes) of een gecontamineerde omgeving (bijv. nucleïnezuren, target genen in amplicons) te kunnen detecteren. De Diagenode negatieve controle is RNase/DNase-vrij water en mag geen enkel amplificatie signaal geven. Voor al het materiaal: Diagenode raadt sterk aan om een interne controle toe te voegen aan uw samples om te garanderen dat het DNA succesvol uit het materiaal is geëxtraheerd, geamplificeerd en gedetecteerd. Een extractie en inhibitie controle (EIC) maakt het voor gebruikers van diagnostische assays mogelijk om de efficiëntie van de extractie te bepalen evenals het detecteren van aanwezige PCR inhibitoren en proces fouten. Hiervoor is de S-DiaMGTV TM kit op de Roche LightCycler 480 gevalideerd in combinatie met DIA-EIC/DNA(Cy5)-050 of DICD-Cy-L100. Universele Inhibitie controle (UIC) maakt het voor gebruikers van diagnostische assays mogelijk om de efficiëntie van de PCR te bepalen evenals het detecteren van aanwezige PCR inhibitoren en proces fouten. Hiervoor is de S-DiaMGTV TM kit op de Abbott m2000 gevalideerd in combinatie met DIA- UIC(Cy5)-050 of DICU-Cy-L100. Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

12 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 5. Reagens Opslag, Hantering en Stabiliteit Conditie Opslag temperatuur Stabiliteit Ongeopend reagens -20 C Houdbaarheidsdatum (zie etiket) Geopend reagens 2-8 C 3 maanden PCR mix (MM + PP + water) 2-8 C 3 maanden Bescherm reagentia tegen licht. Hanteer alle onderdelen van de kit op ijs. Het bewaren van de kit op kamertemperatuur kan leiden tot degradatie van de in de kit aanwezige onderdelen. Dit heeft een verminderde gevoeligheid tot gevolg en wij raden in dit geval sterk aan een nieuwe kit te gebruiken. Voorkom meer dan 12 vries-dooi cycli van de reagentia om degradatie ervan te voorkomen. Maak zo nodig kleinere porties. Onze kits worden bevroren verstuurd, dienen bevroren te worden ontvangen en na ontvangst bij -20 C te worden opgeslagen. P a g i n a 6

13 6. Waarschuwingen en Voorzorgsmaatregelen P a g i n a 7 Indien u een beschadigd pakket of ontdooide kit ontvangt, gelieve contact met ons op te nemen. logistics@diagenode.com / Lees alle instructies voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment. Gebruik reagentia niet als de beschermende doos geopend of gescheurd is bij ontvangst. Gebruik reagentia niet als het epje geopend of beschadigd is. Gebruik geen verlopen reagentia en/of materiaal. Verwissel reagentia uit de kit niet met die van andere batchnummers of met die van andere fabrikanten. Dit product mag enkel worden gebruikt door wetenschappers/analisten die een training hebben gehad over de technieken van real-time PCR. GLP moet worden nageleefd, in het bijzonder: - Het openen, isoleren en real-time amplificeren van nucleïnezuur moeten worden uitgevoerd in gescheiden laboratorium ruimten. Het PCR laboratorium (biologisch veiligheidskabinet, DNA/RNA extractie locatie, werkblad, etc.) moet na elk PCR experiment worden schoon gemaakt en gedesinfecteerd met de juiste oplossingen. - Voer de kwaliteitscontrole uit zoals beschreven in paragraaf 4. - Draag beschermende kleding en wegwerphandschoenen tijdens het werken met reagentia uit de kit. Was en desinfecteer uw handen grondig na het uitvoeren van de test. - Houd alle epjes en flacons gesloten als deze niet worden gebruikt. Voorkom onderlinge verwisselingen van dopjes van epjes evenals hergebruik van dopjes. Dit kan leiden tot contaminatie en verstoring van resultaten van de test. - Filter tips (aerosol resistant) moeten worden gebruikt voor alle pipetteer handelingen. Virussen die dienen ter interne controle, moeten worden gehanteerd in een biologisch veiligheidskabinet voor een handmatige extractie procedure of in een specifieke ruimte voor een automatische extractie procedure; zoals voorgesteld door de fabrikant. De kit mag niet worden gebruikt door iemand die symptomen vertoont van de ziekte die met behulp van de kit wordt gedetecteerd. Gooi iedere kit die mogelijk gecontamineerd is weg. Na gebruik moeten het gebruikte materiaal en de gebruikte reagentia worden behandeld als potentieel besmet en worden weggegooid in een specifiek voor biologisch materiaal bedoelde afvalbak. Gooi ongebruikte reagentia en afval weg in overstemming met landelijke, federale, provinciale, staat en lokale regelgeving. Hanteer materiaal en controle reagentia altijd alsof deze besmet zijn en werk ermee in overeenstemming met laboratorium veiligheidsvoorschriften zoals deze beschreven staan in de lokale regelgevingshandleiding. Niet met de mond pipetteren. Voorkom inname van onderdelen uit de kit. Rook, drink, of eet niet in de ruimtes waar wordt gewerkt met materiaal of reagentia. Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

14 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 7. Protocol 7.1. Algemeen Overzicht MagNA pure 96 & LightCycler 480 Abbott m2000 Cobas 4800 Hoofdstuk Laboratorium ruimte Vereisten Materiaal Zie punt I Materiaal Afname Zie punt II Materialen Transport medium Extractie Zie punt III Extractie ruimte Biologisch veiligheidskabinet Materialen DNA isolatie kit Interne controle (virus) Mix Bereiding & Dosering Zie punt IV Reagens bereidingsruimte Laminaire flowkast Geëxtraheerd materiaal S-DiaMGTV TM kit Master Mix Interne controle (pp) Real-Time PCR Systeem Instellen Zie punt V Amplificatie ruimte PCR mix met geëxtraheerd materiaal Resultaat Analyse & Interpretatie Zie punt VI Amplificatie ruimte Geamplificeerde samples P a g i n a 8

15 P a g i n a Roche MagNA Pure 96 Systeem en Roche LightCycler 480 Real-Time PCR Systeem Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com MagNA Pure 96 & LightCycler 480

16 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING I. Benodigdheden (niet meegeleverd) Disposables Steriele pipet tips met filters (DNase/RNase-vrij) RNase/DNase-vrije microcentrifuge epjes (1,5 en/of 2 ml) MagNA Pure 96 disposables (Output Plate, Filter Tips, Processing Cartridges, Intern Controle Epje, afdekfolie) 96-well plate en afplakstrip voor LightCycler 480 Laboratorium apparatuur Biologisch veiligheidskabinet, laminaire flowkast Koelblok/ijs Pipetten (nauwkeurig tussen µl) Vortex Microcentrifuge Stopwatch of klokje Roche MagNA Pure 96 Systeem met software versie 2.02 Roche LightCycler 480 real-time PCR Systeem met software versie Reagentia Voor extractie: MagNA Pure 96 DNA en Viral NA Small Volume Kit, Roche (ref: ) Voor amplificatie: Interne controle Bijv. Diagenode DNA Extractie & Inhibitie Controle (Nieuwe ref: DICD-xx*-L100 / Oude ref: Dia-EIC/DNA-050) *De letters xx verwijzen naar kleurstoffen beschikbaar voor de S- DiaMGTV TM kit: Texas Red (TR), Cy5 (CY) en Red Dye (RD). Optima DU Master Mix 5x DNA (ref: DMML-D5-D100) MagNA Pure 96 & LightCycler 480 P a g i n a 10

17 P a g i n a 11 II. Materiaal Afname, Opslag en Transport De op PCR-gebaseerde diagnose van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis is afhankelijk van de afname van geschikt materiaal, het snelle transport hiervan in aangepaste containers naar het laboratorium en de juiste opslag voorafgaand aan de analyse. Type Afname* Opslag - Transport** Uitstrijk Urine Urogenitale uitstrijk afgenomen en getransporteerd in 1-3 ml Amplicor Transport Medium (Roche ). Gebruik geen hard staafje of houten staafje Eerst 10 ml tot 50 ml urine, bij voorkeur 2 tot 6 uur na de laatste mictie verkregen in een steriel buisje met schroefdop zonder conserveermiddel - Gekoeld bij 2-8 C voor 72 uur - Bevroren bij -70 C voor een langere periode voorafgaand aan de verwerking - Gekoeld bij 2-8 C voor 24 uur - Bevroren bij -20 C of -70 C voor 24 uur * Standaard afname procedures zijn geschikt om urogenitaal materiaal te verkrijgen. ** Zorg ervoor dat het transport van menselijke materialen voldoet aan alle lokale en nationale regelgeving met betrekking tot transport van etiologisch materiaal. III. Extractie Procedure Nucleïnezuur extractie is het proces dat gebruikt wordt voor het isoleren van DNA en/of RNA uit materiaal (gelyseerde cellen) en het extraheren van nucleïnezuur van eiwitten, vetten, Voer de gegevens volgens de instructies van de fabrikant in in de MagNa Pure Systeem software. Extractie Apparaat MagNA pure 96 Software Versie 2.02 Extractie Protocol V.2.0 Pathogen Universal 200 Extractie Kit Materiaal Volume MagNA Pure 96 DNA en Viral NA Small Volume 200 µl urogenitale uitstrijk in Amplicor transport medium 200 µl urine Extractie Volume 200 µl Intern Controle Volume 10 µl EIC viruskweek + 10 µl PBS Elutie Volume 50 µl Wij raden aan om alle samples die mogelijk besmet zijn in een biologisch veiligheidskabinet te hanteren. 1. Ontdooi EIC virus op ijs. 2. Plaats alle reagentia behalve Magnetic Glass Particles (MGP) en benodigde verbruiksmaterialen inclusief tips en output plate in de machine volgens de instructies van de software (workplace). 3. Pipetteer 200 µl transport medium of urine in een Processing Cartridge, kolom per kolom. 4. Plaats de Processing Cartridge met al het materiaal in het betreffende rek. 5. Voer, in veelvouden van 8, het aantal samples voor extractie in in de software om het totale EIC volume te bepalen. 6. Pipetteer de helft van het door de software berekende EIC volume in een intern controle epje. Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com MagNA Pure 96 & LightCycler 480

18 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 7. Voeg een gelijke hoeveelheid PBS toe aan het interne controle epje met de EIC. 8. Vortex het epje kort. 9. Plaats het interne controle epje in de houder. 10. Vortex elk MGP flesje 1 minuut. 11. Plaats deze flesjes in de houder. 12. Na de extractie stap, verwijder de output plate die de materiaal extracten bevat. 13. Sluit de plaat af met MagNA Pure 96 afdekfolie en bewaar op ijs. Voer nooit nucleïnezuur isolatie uit op de positieve controle Voer de PCR uit op dezelfde dag en bewaar de geëxtraheerde nucleïnezuren op ijs. Het voor een langere periode op kamertemperatuur bewaren van materiaal extracten kan leiden tot degradatie van nucleïnezuren met een verlaagde PCR gevoeligheid als gevolg. IV. Mix Bereiding en Dosering Werkwijze 1 Bereiding 2 3 Dosering Dosering PCR mix Materiaal extract Positieve controle Negatieve controle Aanbeveling voorafgaand aan het starten van de mix bereiding MagNA Pure 96 & LightCycler 480 Werkplek Materiaal bereidingsruimte Reagens bereidingsruimte Opslag tijdens het experiment Materiaal extract (+ EIC) C + (plasmide) MM PP H 20 (Rnase/Dnase-vrij) C - Hanteer mogelijk besmet materiaal in een biologisch veiligheidskabinet. Hanteer reagentia in een laminaire flowkast die ver weg of op zijn minst gescheiden is van de amplificatieruimte. ijs ijs ijs ijs kamertemperatuur kamertemperatuur Voordat de mix wordt bereidt dienen alle oplossingen na het ontdooien kort P te a gworden i n a 12 afgedraaid. Pipetteer ze vervolgens op en neer om ze te homogeniseren.

19 P a g i n a 13 IV.a PCR mix bereiding 1 PCR mix bedoeld voor direct gebruik MM PP pathogeen PP controle Water Diagenode Optima DU Master Mix 5x DNA MGTV dubbele-kleurstof probe en primers Dubbele-kleurstof probe en primers (DNA EIC) H 2O (RNase/DNase-vrij) 1. Tel het totale aantal samples en controles (negatieve en positieve) die in één run worden getest. 2. Vermenigvuldig het volume van elke component (MM, PP, H 2O) met het totale aantal samples en controles (positieve C + en negatieve C - ), plus 1 of 2 extra (zie voorbeeld figuur 1). 3. Kort voor het runnen van de assay, bereid de hier onderstaande PCR mix berekend op een eindvolume van 25 µl: MM PPp PPc W 5x geconcentreerd MM Voor één 25 µl PCR reactie 5 µl 2,5 µl 2,5 µl 10 µl X (n samples + 1 C + + 1C - ) Eindvolume zonder sample: 20 µl Figuur 1: Tabel met berekeningen voor bepaalde aantallen samples. Het totale aantal samples en controles Extra Master Mix 5X DNA (µl) PPp (µl) PPc (µl) H 2O (Rnase/Dnase-vrij) (µl) Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Totaal volume PCR mix (µl) ,5 12, ,0 15, ,5 17, ,5 22, ,5 27, ,5 32, ,5 37, ,5 42, ,5 47, ,5 52, MagNA Pure 96 & LightCycler 480

20 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING PCR mix bedoeld voor langdurig gebruik Diagenode voegt een bruin epje toe aan deze kit voor het maken van een reserve voorraad PCR mix. Deze voorraad dient te worden bewaard bij 2-8 C voor maximaal 3 maanden. IV.b PCR mix dosering 2 1. Pipetteer 20 µl van de bereidde PCR mix in ieder cupje van de 96-well plate. 2. Pipetteer de mix voor de negatieve en positieve controle zo ver mogelijk van de test samples om contaminatie te voorkomen. PCR MIX voor negatieve controle PCR MIX voor positieve PCR MIX voor samples IV.c Pipetteren van de samples en controles 3 1. Neem de output plate met het geëxtraheerde materiaal. 2. Neem 5 µl extract. 3. Voeg deze 5 µl toe aan de 20 µl PCR mix die eerder is gepipetteerd in de 96-well plate. Dit resulteert in een eindvolume van 25 µl (uitgezonderd de controle cupjes). 4. Voeg 5 µl van positieve of negatieve controle toe aan de PCR mix aan het bestemde cupje van de 96-well plate. Dit resulteert in een eindvolume van 25 µl. Test sample Positieve controle Negatieve controle Voor één 25 µl PCR reactie C+ C- PCR mix 20 µl Materiaal, C +, C µl MagNA Pure 96 & LightCycler Dek de reactie plaat af met een doorzichtige afplakstrip. 6. Centrifugeer de 96-well plate kort (5 tot 10 seconden). 7. Plaats de 96-well plate in het amplificatie systeem. P a g i n a 14

21 P a g i n a 15 V. Real-Time PCR Systeem Instellen Voer deze procedure uit in een ruimte met het geschikte biosafety level. Volg de fabrikant zijn instructies voorafgaand aan het gebruik van het real-time PCR systeem. 1. Selecteer het kanaal in de LightCycler 480 software: 465/510 voor MG en 533/580 voor TV. De interne controle zal worden gedetecteerd in het kanaal dat correspondeert met de kleurstof van uw keuze (TR, Cy5, of RD). Ex. (nm) Em. (nm) M.G T.V Diagenode soortnaam FAM YD DR TR Cy5 RD NB: Compensatie file (ccc) moet klaar zijn voor elke gebruikte master mix. 2. Run de PCR gebruik makend van het volgende temperatuur protocol: Activatie van Enzym PCR stappen 1 Denaturatie Amplificatie 2* Annealing en Elongatie Temperatuur 50 C 95 C 95 C 60 C Tijd 2 min 10 min 15 sec 60 sec Cyclus 1 x 1X 45 X *Detectie Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com MagNA Pure 96 & LightCycler 480

22 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING VI. Interpretatie van Resultaten Resultaten van Controles Om er zeker van te zijn dat de run goed is, dienen de controle resultaten als volgt geïnterpreteerd te worden: In het analysis menu, kies de Fit point manier. Pas de drempelwaarde handmatig aan voorafgaand aan het interpreteren van de resultaten. Plaats de lijn net boven de achtergrond. Negatieve controle FAM en/of Yellow signaal boven de drempelwaarde Geen FAM en Yellow signaal boven de drempelwaarde Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen Test is geldig Controleer de C + en interne controle Positieve controle FAM en Yellow signaal met een Ct waarde ±3,3 ten opzichte van het analyse certificaat Geen FAM en/of Yellow signaal boven de drempelwaarde Test is geldig Controleer de interne controle Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen MagNA Pure 96 & LightCycler 480 Interne controle 1. Signaal* met een Ct/Cp waarde 36 Test is geldig Zie pagina 17 Resultaten van test samples. 2. Geen signaal boven de drempelwaarde en een lage Ct waarde van pathogeen Test is geldig Het EIC signaal kan verdwijnen in positieve samples waar het pathogeen DNA in hoge concentraties aanwezig is (competitie voor reagentia) Zie pagina 17 Resultaten van test samples. 3. Geen signaal boven de drempelwaarde Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen 4. Signaal* met een Ct/Cp waarde 36 Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen *Het waargenomen signaal hangt af van de kleurstof die u gekozen heeft voor de interne controle (TR, Cy5 of RD). P a g i n a 16

23 P a g i n a 17 Resultaten van test samples Zodra u zeker bent dat de run geldig is, interpreteer de resultaten van de samples. In het analysis menu, kies de Fit point manier. Pas de drempelwaarde handmatig aan voorafgaand aan het interpreteren van de resultaten. Plaats de lijn net boven de achtergrond. FAM signaal voor de detectie van Mycoplasma genitalium: Geen Ct/Cp waarde Ct/Cp waarde Sample is NEGATIEF Sample is POSITIEF YELLOW signaal voor de detectie van Trichomonas vaginalis: Geen Ct/Cp waarde Ct/Cp waarde Sample is NEGATIEF Sample is POSITIEF Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com MagNA Pure 96 & LightCycler 480

24 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 7.3 Abbott m2000 apparaat Abbott m2000 P a g i n a 18

25 P a g i n a 19 I. Benodigdheden (niet meegeleverd) Disposables Steriele pipet tips met filters (DNase/RNase-vrij) RNase/DNase-vrije microcentrifuge epjes (1,5 en/of 2 ml) Abbott m2000 sp disposables (96 Deep Well Plates, Tips, reactie vaatjes) Abbott m2000 rt disposables (doorzichtige afplakstrip, 96-Well Optical Reaction Plate) Laboratorium apparatuur Biologisch veiligheidskabinet, laminaire flowkast Koelblok/ijs Pipetten (nauwkeurig tussen µl) Vortex Microcentrifuge Stopwatch of klokje Extractie: Abbott m2000 sp met software versie 6 Real-time PCR systeem: Abbott m2000 rt met software versie 6 Abbott m2000 Systeem Chlamydia trachomatis en Neisseria gonorrhoeae applicatie Cd-Rom Reagentia Voor materiaal afname: Abbott multi-collect Specimen Collection kit (ref: 9K12-03) Voor extractie: msample Preparation Systems DNA (ref: 04J70-24) Voor amplificatie: Abbott RealTime CT/NG (ref: 8L07-91) Interne controle Bijv. Diagenode Universele Inhibitie Controle (UIC) (Nieuwe ref: DICU-xx*-L100 / Oude ref: Dia-UIC-050) *De letters xx verwijzen naar de kleurstoffen beschikbaar voor de S- DiaMGTV TM kit: Texas Red (TR), Cy5 (CY) en Red Dye (RD). Optima DU Master Mix 5x DNA (ref: DMML-D5-D100) Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Abbott m2000

26 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING II. Materiaal Afname, Opslag en Transport De op PCR-gebaseerde diagnose van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis is afhankelijk van de afname van geschikt materiaal, het snelle transport hiervan in aangepaste containers naar het laboratorium en de juiste opslag voorafgaand aan de analyse. Type Afname* Opslag - Transport** Uitstrijk Urine Urogenitale uitstrijk afgenomen en getransporteerd in de Abbott transport buis die 1,2 ml Spicemen Transport Buffer bevat. Gebruik geen hard staafje of houten staafje Urine afgenomen en getransporteerd in de Abbott transport buis die 1,2 ml Spicemen Transport Buffer bevat. - Gekoeld bij 2-8 C voor 72 uur - Bevroren bij -70 C voor een langere periode voorafgaand aan de verwerking - Gekoeld bij 2-8 C voor 24 uur - Bevroren bij -20 C of -70 C voor 24 uur * Standaard afname procedures zijn geschikt om urogenitaal materiaal te verkrijgen. ** Zorg ervoor dat het transport van menselijke materialen voldoet aan alle lokale en nationale regelgeving met betrekking tot transport van etiologisch materiaal. III. Extractie Procedure Nucleïnezuur extractie is het proces dat gebruikt wordt voor het isoleren van DNA en/of RNA uit materiaal (gelyseerde cellen) en het extraheren van nucleïnezuur van eiwitten, vetten, De extractie procedure voor de detectie van MG/TV is dezelfde als die voor de detectie van CT/NG. Het eluaat kan zowel voor de Abbott RealTime CT/NG kit als voor de S-DiaMGTV TM kit worden gebruikt. Voer de gegevens volgens de instructies van de fabrikant in in de Abbott m2000 sp software. Extractie Apparaat Extractie module van het Abbott m2000 apparaat Extractie Protocol Abbott CT/NG protocol Extractie Kit msample Preparation Systems DNA Input Volume -1,2 ml urogenitale uitstrijk verdund in Specimen Transport Buffer -3,5 ml urine verdund in Specimen Transport Buffer Extractie Volume 400 µl Intern Controle Volume Geen* Elutie Volume 60 µl - 25 µl gebruikt voor het Abbott CT/NG assay - 35 µl achterhouden voor het S-DiaMGTV TM assay * Een Interne Controle is toegevoegd aan de CT/NG extractie en deze wordt gedetecteerd door de CT/NG amplificatie. Zie de Abbott CT/NG test instructies voor verdere informatie over de interne controle. Abbott m2000 P a g i n a 20

27 P a g i n a 21 Wij raden aan om alle samples die mogelijk besmet zijn in een biologisch veiligheidskabinet te hanteren. 1. Extraheer het materiaal zoals beschreven in de Abbott m2000sp handleiding. 2. Pipetteer 60 µl eluaat uit de deep-well plate: - 25 µl wordt gebruikt voor de CT/NG test met behulp van de Abbott kit. - 5 µl, of meer indien duplo s worden ingezet, wordt gebruikt voor de MG/TV test. - Het restant van het eluaat wordt overgebracht naar een epje en bewaard bij -70 C. Voer nooit nucleïnezuur isolatie uit op de positieve controle Voer de PCR voor MG/TV detectie uit vooraf of na afloop van de CT/NG test, op dezelfde dag, en bewaar geëxtraheerde nucleïnezuren op ijs. Het voor een langere periode op kamertemperatuur bewaren van materiaal extracten kan leiden tot degradatie van nucleïnezuren met een verlaagde PCR gevoeligheid als gevolg. IV. Mix Bereiding en Dosering Werkwijze 1 Bereiding 2 3 Dosering Dosering PCR mix Materiaal extract Positieve controle Negatieve controle Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Abbott m2000

28 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING Aanbeveling voorafgaand aan het starten van de mix bereiding Werkplek Materiaal bereidingsruimte Reagens bereidingsruimte Opslag tijdens het experiment Materiaal extract C + (plasmide) MM PP H 20 (Rnase/Dnase-vrij) C - Hanteer mogelijk besmet materiaal in een biologisch veiligheidskabinet. Hanteer reagentia in een laminaire flowkast die ver weg of op zijn minst gescheiden is van de amplificatieruimte. ijs ijs ijs ijs kamertemperatuur kamertemperatuur Voordat de mix wordt bereidt dienen alle oplossingen na het ontdooien kort te worden afgedraaid. Pipetteer ze vervolgens op en neer om ze te homogeniseren. IV.a PCR mix bereiding 1 Wanneer enkel het MG/TV assay wordt uitgevoerd raadt Diagenode sterk aan om een interne controle (UIC) toe te voegen aan de PCR mix om zo de efficiëntie van de PCR te verifiëren. MM Diagenode Optima DU Master Mix 5x DNA PP pathogeen MGTV dubbele-kleurstof probe en primers PP controle Water Dubbele-kleurstof probe en primers (UIC) (niet meegeleverd met de S-DiaMGTV TM kit) H 2O (Rnase/Dnase-vrij) 1. Tel het totale aantal samples en controles (negatieve en positieve) die in één run worden getest. 2. Vermenigvuldig het volume van elke component (MM, PP, H 2O) met het totale aantal samples en controles (positieve C + en negatieve C - ), plus 1 of 2 extra (zie voorbeeld figuur 1). 3. Kort voor het runnen van de assay, bereid de hier onderstaande PCR mix berekend op een eindvolume van 25 µl: MM PPp PPc W 5x geconcentreerd MM Voor één 25 µl PCR reactie 5,0 µl 2,5 µl 2,5 µl 7,5 µl X (n samples + 1 C + + 1C - ) Abbott m2000 Eindvolume zonder sample en UIC plasmide: 17,5 µl P a g i n a 22

29 P a g i n a 23 Figuur 1: Tabel met berekeningen voor bepaalde aantallen samples. Het totale aantal samples en controles Extra Master Mix 5X DNA (µl) PPp (µl) PPc (µl) H 2O (Rnase/Dnase-vrij) (µl) Totaal volume PCR mix (µl) ,5 12,5 37,5 87, ,0 15, ,5 17,5 52,5 122, ,5 22,5 67,5 157, ,5 27,5 82,5 192, ,5 32,5 97,5 227, ,5 37,5 112,5 262, ,5 42,5 127,5 297, ,5 47,5 142,5 332, ,5 52,5 157,5 367, IV.b PCR mix dosering 2 1. Pipetteer 17,5 µl van de bereidde PCR mix in ieder cupje van de 96-Well Optical Reaction Plate. 2. Pipetteer de mix voor de negatieve en positieve controle zo ver mogelijk van de test samples om contaminatie te voorkomen. PCR MIX voor negatieve controle PCR MIX voor positieve controle PCR MIX voor samples Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Abbott m2000

30 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING IV.c Pipetteren van de samples en controles 3 1. Voeg 5 µl extract toe aan de 20 µl PCR mix reeds gepipetteerd in de 96-Well Optical Reaction Plate. 2. Voeg nu 2,5 µl van de UIC plasmide aan de reeds in de 96-Well Optical Reaction Plate gepipetteerde PCR mix. De UIC plasmide mag niet worden toegevoegd aan de positieve en negatieve controle cupjes. Voeg aan deze cupjes in plaats van 2,5 µl UIC plasmide 2,5 µl H 2O toe. 3. Voeg 5 µl positieve of negatieve controle toe aan de 17,5 µl PCR mix in het bestemde cupje van de 96-Well Optical Reaction Plate. Test sample Positieve controle Negatieve controle C+ C- Voor één 25 µl PCR reactie PCR mix..17,5 µl UIC plasmide.2,5 µl Materiaal, C +, C - 5,0 µl 4. Dek de reactie plaat af met een doorzichtige afplakstrip. 5. Centrifugeer de 96-Well Optical Reaction Plate kort (5 tot 10 seconden). 6. Plaats de 96-Well Optical Reaction Plate in het amplificatie systeem. V. Real-Time PCR Systeem Instellen Voer deze procedure uit in een ruimte met het geschikte biosafety level. Volg de fabrikant zijn instructies voorafgaand aan het gebruik van het real-time PCR systeem. 1. Selecteer het kanaal in de Abbott m2000 rt software: FAM voor MG en VIC voor TV. De interne controle zal worden gedetecteerd in het kanaal dat correspondeert met de kleurstof van uw keuze (TR, Cy5, of RD). Ex. (nm) Em. (nm) M.G T.V Diagenode soortnaam FAM YD DR TR Cy5 RD FAM VIC ROX CY5 CY5 Diagenode Optima DU Master Mix 5x DNA bevat geen ROX. Abbott m2000 P a g i n a 24

31 P a g i n a Run de PCR gebruik makend van het volgende temperatuur protocol: Activatie van Enzym PCR stappen 1 Denaturatie Amplificatie 2* Annealing en Elongatie Temperatuur 50 C 95 C 95 C 60 C Tijd 2 min 10 min 15 sec 60 sec Cyclus 1 x 1X 45 X *Detectie VI. Interpretatie van Resultaten Resultaten van Controles Om er zeker van te zijn dat de run goed is, dienen de controle resultaten als volgt geïnterpreteerd te worden: Negatieve controle FAM en/of Yellow signaal boven de drempelwaarde Geen FAM en Yellow signaal boven de drempelwaarde Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen Test is geldig Controleer de C + en interne controle Om de positieve controle te analyseren dient de drempelwaarde handmatig boven de achtergrond te worden geplaatst. Positieve controle FAM en Yellow signaal met een Ct waarde ± 3,3 ten opzichte van het analyse certificaat (op aanvraag) Geen FAM en/of Yellow signaal boven de drempelwaarde Test is geldig Controleer de interne controle Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Abbott m2000

32 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING Interne controle 1. Signaal* met een Ct/Cp waarde van 27,0 ± 3,3 Test is geldig Zie pagina 26 Resultaten van test samples 2. Geen signaal boven de drempelwaarde Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen *Het waargenomen signaal hangt af van de kleurstof die u gekozen heeft voor de interne controle (TR, Cy5 of RD). Resultaten van test samples Zodra u zeker bent dat de run geldig is, interpreteer de resultaten van de samples. FAM signaal voor de detectie van Mycoplasma genitalium: Geen Ct/Cp waarde Ct/Cp waarde Sample is NEGATIEF Sample is POSITIEF YELLOW signaal voor de detectie van Trichomonas vaginalis: Geen Ct/Cp waarde Ct/Cp waarde Sample is NEGATIEF Sample is POSITIEF Abbott m2000 P a g i n a 26

33 P a g i n a Roche Cobas 4800 Systeem Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Cobas 4800

34 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING I. Benodigdheden (niet meegeleverd) Disposables Steriele pipet tips met filters (DNase/RNase-vrij) RNase/DNase-vrije microcentrifuge epjes (1,5 en/of 2 ml) Cobas x480 disposables (DWP Deepwell Plate, MWP Microwell Plate, reagens reservoir, Tips High Volume 1 ml met filter) Cobas PCR Media buis of 13 ml buis met een ronde bodem van 16,5 mm bij 101 mm van Sarstedt 96-Well Reaction Plate en afplakstrip voor Cobas z480 Laboratorium apparatuur Biologisch veiligheidskabinet, laminaire flowkast Koelblok/ijs Pipetten (nauwkeurig tussen µl) Vortex Microcentrifuge Roche Cobas 4800 Systeem: - Cobas x480 apparaat - Cobas z480 analyzer Reagentia Voor materiaal afname: Cobas PCR Urine Sample Kit, Roche (ref: ) Cobas PCR Female Swab Sample Kit Roche (ref: ) Voor extractie: Cobas 4800 System Sample Preparation Kit (HPV, CT/NG, 240 tests], Roche (ref: ) Cobas 4800 System Wash Buffer Kit [HPV, CT/NG, 240 tests], Roche (ref: ) Cobas 4800 System Control Diluent Kit [CT/NG], Roche (ref: ) Cobas 4800 CT/NG Controls Kit 10 Sets, Roche (ref: ) Voor amplificatie: Cobas 4800 CT/NG Amplification/Detection Kit (240 testen), Roche (ref: ) LightCycler 480 Probes Master, Roche (ref: ) Cobas 4800 P a g i n a 28

35 P a g i n a 29 II. Materiaal Afname, Opslag en Transport De op PCR-gebaseerde diagnose van Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis is afhankelijk van de afname van geschikt materiaal, het snelle transport hiervan in aangepaste containers naar het laboratorium en de juiste opslag voorafgaand aan de analyse. Type Afname* Opslag - Transport** Uitstrijk Urine Urogenitale uitstrijk afgenomen en getransporteerd in de Cobas PCR Media buis die 4,3 ml Cobas PCR media bevat. Gebruik geen hard staafje of houten staafje Urine (4,3 ml) afgenomen en getransporteerd in de Cobas PCR Media buis die 4,3 ml Cobas PCR media bevat. - Gekoeld bij 2-8 C voor 72 uur - Bevroren bij -70 C voor een langere periode voorafgaand aan de verwerking - Gekoeld bij 2-8 C voor 24 uur - Bevroren bij -20 C of -70 C voor 24 uur * Standaard afname procedures zijn geschikt om urogenitaal materiaal te verkrijgen. ** Zorg ervoor dat het transport van menselijke materialen voldoet aan alle lokale en nationale regelgeving met betrekking tot transport van etiologisch materiaal. III. Extractie Procedure Nucleïnezuur extractie is het proces dat gebruikt wordt voor het isoleren van DNA en/of RNA uit materiaal (gelyseerde cellen) en het extraheren van nucleïnezuur van eiwitten, vetten, De extractie procedure voor de detectie van MG/TV is dezelfde als die voor de detectie van CT/NG. Het eluaat kan zowel voor de Cobas 4800 CT/NG Amplificatie/Detectie Kit als voor de S-DiaMGTV TM kit worden gebruikt. Voer de gegevens volgens de instructies van de fabrikant in in de Cobas x480 software. Extractie Apparaat Cobas x480 Extractie Protocol CT/NG Werkwijze: UUT voor urine samples / UT voor uitstrijk samples Extractie Kit Benodigde reagentia voor het Cobas 4800 CT/NG assay Input Volume 1 ml urogenitale uitstrijk verdund in Cobas PCR media 1,5 ml urine verdund in Cobas PCR media Extractie Volume Urogenitale uitstrijk: 400 µl Urine: 850 µl Intern Controle Volume Geen* Elutie Volume 100 µl: - 25 µl gebruikt voor het Roche CT/NG assay - 75 µl achterhouden voor het S-DiaMGTV assay * Een Interne Controle is toegevoegd aan de Roche CT/NG extractie en deze wordt gedetecteerd door de CT/NG amplificatie. Zie de Cobas CT/NG test instructies voor verder informatie over de interne controle. Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Cobas 4800

36 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING Wij raden aan om alle samples die mogelijk besmet zijn in een biologisch veiligheidskabinet te hanteren. 1. Pipetteer 1 ml urogenitaal materiaal of 1,5 ml urine in de 13 ml Sarstedt buis. 2. Laad het sample rek met de geopende sample buizen. 3. Schuif het sample rek in het automatische laad rek van het apparaat. Volg de werkwijze zoals voorgeschreven in de gebruiksaanwijzing van de Cobas CT/NG test (onderhoud, laden van sample, laden van verbruiksartikelen, en laden van reagentia). Na afloop van de test is het belangrijk om de DWP Deepwell Plate niet weg te gooien: pipetteer de overgebleven 75 µl eluaat uit de Deepwell Plate gebruik makend van een magnetische plaat (meegeleverd met het Cobas 4800 Systeem). Voer nooit nucleïnezuur isolatie uit op de positieve controle Voer de PCR voor MG/TV detectie uit na afloop van de CT/NG test, op dezelfde dag, en bewaar geëxtraheerde nucleïnezuren op ijs. Het voor een langere periode op kamertemperatuur bewaren van materiaal extracten kan leiden tot degradatie van nucleïnezuren met een verlaagde PCR gevoeligheid als gevolg. IV. Mix Bereiding en Dosering Werkwijze 1 Bereiding 2 3 Dosering Dosering PCR mix Materiaal extract Positieve controle Negatieve controle Cobas 4800 P a g i n a 30

37 P a g i n a 31 Aanbeveling voorafgaand aan het starten van de mix bereiding Werkplek Materiaal bereidingsruimte Reagens bereidingsruimte Opslag tijdens het experiment Specimen extract C + (plasmide) MM PP H 20 (Rnase/Dnase-vrij) C - Hanteer mogelijk besmet materiaal in een biologisch veiligheidskabinet. Hanteer reagentia in een laminaire flowkast die ver weg of op zijn minst gescheiden is van de amplificatieruimte. ijs ijs ijs ijs kamertemperatuur kamertemperatuur Voordat de mix wordt bereidt dienen alle oplossingen na het ontdooien kort te worden afgedraaid. Pipetteer ze vervolgens op en neer om ze te homogeniseren. IV.a PCR mix bereiding 1 PCR mix bedoeld voor direct gebruik MM PP pathogeen Water LightCycler 480 Probes Master MGTV dubbele-kleurstof probe en primers H 2O (Rnase/Dnase-vrij) 1. Tel het totale aantal samples en controles (negatieve en positieve) die in één run worden getest. 2. Vermenigvuldig het volume van elke component (MM, PP, H 2O) met het totale aantal samples en controles (positieve C + en negatieve C - ), plus 1 of 2 extra (zie voorbeeld figuur 1). 3. Kort voor het runnen van de assay, bereid de hier onderstaande PCR mix berekend op een eindvolume van 25 µl: MM PPp W 2x geconcentreerd MM Voor één 25 µl PCR reactie 12,5 µl 2,5 µl 5 µl X (n samples + 1 C + + 1C - ) Eindvolume zonder sample: 20 µl Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Cobas 4800

38 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING Figuur 1: Tabel met berekeningen voor bepaalde aantallen samples. Het totale aantal samples en controles Extra Master Mix 2X DNA (µl) PPp (µl) H 2O (Rnase/Dnasevrij) (µl) Totaal volume PCR mix (µl) ,5 12, , ,5 17, ,5 22, ,5 27, , ,5 37, ,5 42, ,5 47, ,5 52, IV.b PCR mix dosering 2 1. Pipetteer 20 µl van de bereidde PCR mix in ieder cupje van de 96-Well Reaction Plate. 2. Pipetteer de mix voor de negatieve en positieve controle zo ver mogelijk van de test samples om contaminatie te voorkomen. PCR MIX voor negatieve controle PCR MIX voor positieve controle PCR MIX voor samples Cobas 4800 P a g i n a 32

39 P a g i n a 33 IV.c Pipetteren van de samples en controles 3 1. Voeg 5 µl extract toe aan de 20 µl PCR mix reeds gepipetteerd in de 96-Well Reaction Plate (uitgezonderd de controle cupjes). 2. Voeg 5 µl positieve of negatieve controle toe aan de 20 µl PCR mix in het bestemde cupje van de 96-Well Reaction Plate. Test sample Positieve controle Negatieve controle C+ C- Voor één 25 µl PCR reactie PCR mix..20 µl Materiaal, C +, C - 5 µl 3. Dek de reactie plaat af met een doorzichtige afplakstrip. 4. Centrifugeer de 96-Well Reaction Plate kort (5 tot 10 seconden). 5. Plaats de 96-Well Reaction Plate in het amplificatie systeem. V. Real-Time PCR Systeem Instellen Voer deze procedure uit in een ruimte met het geschikte biosafety level. Volg de fabrikant zijn instructies voorafgaand aan het gebruik van het real-time PCR systeem. 1. Selecteer het kanaal in de Cobas z480 software: 465/510 voor MG en 540/580 voor TV. Ex. (nm) Em. (nm) M.G T.V Diagenode soortnaam FAM YD DR TR Cy5 RD Run de PCR gebruik makend van het volgende temperatuur protocol: Activatie van Enzym PCR stappen 1 Denaturatie Amplificatie 2* Annealing en Elongatie Temperatuur 50 C 95 C 95 C 60 C Tijd 2 min 10 min 15 sec 60 sec Cyclus 1 x 1X 45 X *Detectie Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com Cobas 4800

40 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING VI. Interpretatie van Resultaten Resultaten van Controles Om er zeker van te zijn dat de run goed is, dienen de controle resultaten als volgt geïnterpreteerd te worden: Negatieve controle FAM en/of Yellow signaal boven de drempelwaarde Geen FAM en Yellow signaal boven de drempelwaarde Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen Test is geldig Controleer de C + Positieve controle FAM en Yellow signaal met een Ct waarde ± 3,3 ten opzichte van het analyse certificaat Geen FAM en/of Yellow signaal boven de drempelwaarde Test is geldig Test is ongeldig Zie punt 8. Handleiding Problemen Oplossen Resultaten van test samples Zodra u zeker bent dat de run geldig is, interpreteer de resultaten van de samples. FAM signaal voor de detectie van Mycoplasma genitalium: Geen Ct/Cp waarde Ct/Cp waarde Sample is NEGATIEF Sample is POSITIEF YELLOW signaal voor de detectie van Trichomonas vaginalis: Geen Ct/Cp waarde Ct/Cp waarde Sample is NEGATIEF Sample is POSITIEF Cobas 4800 P a g i n a 34

41 P a g i n a Handleiding Problemen Oplossen Waarneming: lage* of geen amplificatie curvee Samples & Controle Alle behalve C - (Sample, EIC/UIC en C + ) EIC en sample Globale analyse Potentiële Oorzaken 1. Incorrecte opslagomstandigheden: - Master Mix - Probe & primers van kit 2. Suboptimale PCR condities (thermische cyclus, aantal cycli) 1. Aanwezigheid van inhibitoren 2. Afgenomen extractie efficiëntie of incorrecte extractie methode Oplossingen Controleer de opslagcondities van de kit (zie punt 5) Controleer de toegepaste PCR condities (zie punt V horend bij uw apparaat) Gebruik een extra portie van het originele materiaal met de gevalideerde extractie methode (zie punt III horend bij uw apparaat) Herhaal het extractie proces met de gevalideerde extractie methode (zie punt III horend bij uw apparaat) Individuele analyse Controle Potentiële Oorzaken Oplossingen C + 1. Incorrecte opslag condities van C + Controleer de opslag condities van de kit (verwijs naar punt 6) 2. Foute kleurstof keuze Controleer de gekozen kleurstof (zie punt V horend bij uw apparaat) 3. Foute hantering Herhaal het PCR assay EIC 1. Afgenomen extractie efficiëntie of incorrecte extractie methode Herhaal het extractie proces met de gevalideerde extractie methode (zie punt III horend bij MagNA Pure 96) 2. Incorrecte opslag condities voor EIC Controleer de opslag condities van de controle kit 3. Foute kleurstof keuze Controleer de gekozen kleurstof (zie punt V horend bij LC 480) 4. Foute hantering Herhaal de test en begin met het extractie proces UIC 1. Incorrecte opslag condities voor UIC Controleer de opslag condities van de controle kit 2. Foute kleurstof keuze Controleer de gekozen kleurstof (zie punt V horend bij Abbott m2000 rt) 3. Foute hantering Herhaal de test en begin met het extractie proces * Slecht fluorescentie signaal of een vertraagde Ct C - Waarneming: amplificatie curvee Controle Potentiële Oorzaken Oplossingen Gecontamineerde reagentia en/of Goede Laboratorium Werkwijzen gecontamineerde omgeving moeten worden nageleefd (zie punt 6) Herhaal de test met een nieuwe kit en begin met de extractie stap. Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

42 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 9. Evaluatie van de Kit 9.1 Analytische Gevoeligheid De Analytische Gevoeligheid (LoD) van de S-DiaMGTV TM kit is bepaald met behulp van seriële verdunningen van gekwantificeerd Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis DNA in verschillende matrices. Hiervoor zijn samples gespiked en met verschillende extractie methoden geëxtraheerd. Elk geëxtraheerd sample is geamplificeerd door middel van PCR op verschillende apparaten met óf de Optima DU Master Mix 5x (Diagenode) óf de LightCycler Probe Master (Roche). De resultaten zijn geanalyseerd door een Probit analyse met behulp van de Minitab 16 Software. De analytische gevoeligheden voor Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis, gedefinieerd als de laagste concentratie waarbij 95% van alle geteste kopieën positief zijn (LoD C 95), zijn weergegeven in de onderstaande tabellen: MagNA Pure 96 / LightCycler 480 / Optima DU Master Mix 5x : Pathogeen Matrix LoD (kopieën/ ml) Amplicor Specimen Transport Medium 921 Mycoplasma genitalium Mannelijke urine 428 Vrouwelijke urine 592 Amplicor Specimen Transport Medium 168 Trichomonas vaginalis Mannelijke urine 183 Vrouwelijke urine 185 Cobas 4800 Systeem / LightCycler Probe Master : Pathogeen Matrix LoD (kopieën/ ml) Cobas PCR Medium 3989 Mycoplasma genitalium Mannelijke urine 1017 Vrouwelijke urine 959 Cobas PCR Medium 1325 Trichomonas vaginalis Mannelijke urine 1480 Vrouwelijke urine 608 Abbott m2000 / Optima DU Master Mix 5x : Pathogeen Matrix LoD (kopieën/ ml) Abbott Multi-Collect 4769 Mycoplasma genitalium Urine 1702 Abbott Multi-Collect 3050 Trichomonas vaginalis Urine 695 P a g i n a 36

43 P a g i n a Nauwkeurigheid Voor de beoordeling van de herhaalbaarheid (intra-assay variatie) en de reproduceerbaarheid (inter-assay variatie) van de S-DiaMGTV TM kit, zijn de Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis DNA concentraties in verschillende matrices dicht in de buurt van hun betreffende LoD 95 gekozen. Hiervoor zijn samples gespiked en met verschillende extractie methoden geëxtraheerd. Elk geëxtraheerd sample is geamplificeerd door middel van PCR op verschillende apparaten met óf de Optima DU Master Mix 5x (Diagenode) óf de LightCycler Probe Master (Roche). De intra-run variatie is berekend uit de Ct waarden van sample kopieën uit één experiment. Op een zelfde manier is de inter-run variatie berekend uit de Ct waarden van sample kopieën uit drie tot zes onafhankelijke experimenten. Resultaten zijn weergegeven in de onderstaande tabellen: MagNA Pure 96 / LightCycler 480 / Optima DU Master Mix 5x : Pathogeen Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis Matrix Amplicor STM Concentratie K/mL (%LoD) Gemiddelde Ct CV intrarun (%) CV interrun (%) 1333 (98%) 36,0 1,18 1, (100%) 34,4 1,51 2,33 Mannelijke urine 500 (97%) 37,4 1,86 2, (100%) 36,2 1,51 1,98 Vrouwelijke urine 500 (93%) 37,7 2,36 2,43 Amplicor STM 1000 (99%) 36,6 1,02 2, (98%) 36,1 2,82 1, (100%) 34,6 1,72 1,65 Mannelijke urine 250 (98%) 36,4 1,85 2, (100%) 35,3 1,42 2,02 Vrouwelijke urine 250 (97%) 36,8 2,57 3, (100%) 35,3 1,98 1,96 Cobas 4800 Systeem / LightCycler Probe Master : Pathogeen Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis Matrix Cobas PCR Medium Concentratie K/mL (%LoD) Gemiddelde Ct CV intrarun (%) Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com CV interrun (%) 1333 (65) 38,3 2,24 0, (96) 36,6 1,73 1,99 Mannelijke urine 1111 (96) 37,1 1,88 2, (100) 35,9 1,54 4,91 Vrouwelijke urine 1111 (96) 37,0 1,83 1, (100) 34,6 1,11 0,56 Cobas PCR 667 (85) 37,3 2,56 3,37 Medium 2000 (99) 35,5 1,81 5,74 Mannelijke urine 667 (85) 36,5 1,74 3, (97) 35,3 2,58 6,39 Vrouwelijke urine 667 (96) 36,4 2,18 1, (100) 33,4 1,59 0,87

44 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING Abbott m2000/ Optima DU Master Mix 5x : Pathogeen Mycoplasma genitalium Trichomonas vaginalis Matrix Abbott Multi- Collect Urine Abbott Multi- Collect Urine Concentratie K/mL (%LoD) Gemiddelde Ct CV intrarun (%) CV interrun (%) 5000 (96) 37,01 1,07 0, (85) 40,54 1,92 2, (100) 38,95 1,57 2, (98) 39,91 1,46 0, (96) 36,50 0,86 5, (93) 38,85 1,14 3, (96) 38,97 3,66 2, (92) 39,48 3,05 1, Analytische Specificiteit De specificiteit van de S-DiaMGTV TM kit was bovenal gegarandeerd door de selectie van de primers en probes, evenals door de selectie van strikte reactieomstandigheden. De primers en probes zijn gecontroleerd op mogelijke homologieën met behulp van sequentie-alignering in databases van DNA sequenties. Om de experimentele specificiteit van de S-DiaMGTV TM kit te bepalen zijn de in onderstaande tabel genoemde pathogenen getest op kruisreactiviteit bij een eindconcentratie van 10 6 kopieën/µl. Het onderzoek naar de specificiteit liet een geringe reactie zien van de S- DiaMGTV TM kit met Mycobacterium smegmatis (< 0,0001%; > K/PCR*), Streptococcus salivarius (< 0,0001%; > K/PCR*) en Vibrio parahaemolyticus (< 0,0001%; > K/PCR*). Er zijn geen reacties waargenomen met de overige geteste pathogenen. * Aantal kopieën/pcr van de kruisreactanten dat gevoelig is voor het geven van een Ct van 45 in het target kanaal. Geteste Pathogenen Bacteriën Achromobacter xerosis Mycoplasma pneumoniae Acinetobacter baumannii Mycoplasma salivarium Acinetobacter sp Mycoplasma hominis Aerococcus viridans Mycoplasma genitalium Aeromonas hydrophila Mycoplasma orale Alcaligenes faecalis Neisseria flava Bacillus subtilis Neisseria gonorrhoeae Bacteroides ureolyticus Neisseria meningitidis Bifidobacterium breve Neisseria meningitidis FAM 18 Bordetella pertussis Neisseria meningitidis M1883 Brevibacterium linens Neisseria meningitidis serogroep B Campylobacter jejuni Neisseria perflava Chlamydia trachomatis, stam D (UW-3/Cx) Peptostreptococcus anaerobius Chlamydophila pneumoniae Plesiomonas shigelloides Clostridium difficile Proteus mirabilis Clostridium perfringens Proteus vulgaris Deinococcus radiodurans Providencia stuartii P a g i n a 38

45 P a g i n a 39 Derxia gummosa Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Lactobacillus jensenii Legionella pneumophila Leuconostoc mesenteroides Listeria monocytogenes Micrococcus luteus Morganella morganii Mycobacterium smegmatis Cytomegalovirus (CMV) Herpes Simplex Virus (HSV1) Candida albicans Candida glabrata Bacteriën Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Rahnella aquatilis Rhodospirillum rubrum Salmonella enterica serovar Choleraesuis Salmonella enterica serovar Typhimurium Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Streptococcus agalactiae Streptococcus mitis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Streptococcus sanguinis Streptomyces griseinus Trichomonas vaginalis Vibrio parahaemolyticus Yersinia enterocolitica Virussen Herpes Simplex Virus (HSV2) Gisten Candida parapsilosis Candida tropicalis 9.4 Interferentie Endo/exo substanties Met de S-DiaMGTV TM kit, in combinatie met het Roche MagNa Pure 96 extractie systeem en het Roche LightCycler 480 real-time PCR systeem, is onderzocht of de contaminatie van het E-Swab transport medium met 10% bloed en de contaminatie van urine met 1% bloed of 1mg/mL albumine, de detectiegevoeligheid beïnvloed. Het DNA van de target organismen (Mycoplasma genitalium en Trichomonas vaginalis) is met een LoD 95 vergelijkbare concentratie geplaatst in negatieve mannelijke urine en in E-Swab transport medium. De mogelijk interfererende stof is vervolgens toegevoegd aan de individuele samples. De S- DiaMGTV TM assay is uitgevoerd bij 30 kopieën van elke sample. Het 10% bloed werd beschouwd als interfererend indien de ΔCt tussen de test conditie en de referentie groter was dan twee standaard deviaties van de intra-run variatie of indien het de analytische gevoeligheid aanzienlijk verlaagde (percentage positieve uitslagen). De resultaten van de interferentie test zijn weergegeven in de onderstaande tabel: Matrix Mannelijke urine Interfererende stof Bloed 1% Albumine 1mg/mL Target (K/mL) Effect op gemiddelde ΔCt* Effect op % positieve uitslagen* MG (500) + 1,7 NS TV (250) + 2,1 NS MG (500) + 2,7 NS TV (250) + 3,2 NS Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

46 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING E-Swab Bloed 10% * NS indien niet significant MG (2000) NS NS TV (200) NS NS De gemiddelde Ct waarden van MG en TV namen aanzienlijk toe in urine met 1% bloed of 1 mg/ml albumine. Echter, de analytische gevoeligheid toonde geen noemenswaardige verandering. De detectie van MG en TV in E-Swab veranderde niet door de aanwezigheid van 10% bloed. Competitieve interferentie Competitieve interferentie is onderzocht door het maken van kunstmatige samples die DNA van een target organisme (Mycoplasma genitalium of Trichomonas vaginalis) bevatten met een LoD 95 vergelijkbare concentratie en DNA van het andere target met een hogere concentratie. De extractie van deze samples is uitgevoerd op het Roche MagNa Pure 96 systeem. De S-DiaMGTV TM assay is uitgevoerd bij 30 kopieën van elk sample gebruik makend van het Roche LightCycler 480 real-time PCR systeem. Een pathogeen werd beschouwd als interfererend met de detectie van het andere target indien de ΔCt tussen de test conditie en de referentie groter was dan twee standaard deviaties van de intra-run variatie of indien het de analytische gevoeligheid aanzienlijk verlaagde (percentage positieve uitslagen). De resultaten van de competitieve interferentie test zijn weergegeven in de onderstaande tabel: Matrix Interfererend pathogeen (K/mL) Target pathogeen (K/mL) Effect op Gemiddelde ΔCt* Urine TV (2, ) MG (500) + 1,8 NS MG (2, ) TV (250) + 2,1 NS E-Swab TV (2, ) MG (2 000) NS NS MG (2, ) TV (200) - 2,5 NS * NS indien niet significant Effect op % positieve uitslagen* De gemiddelde Ct waarden van MG en TV namen aanzienlijk toe in urine in de aanwezigheid van 2, kopieën/ml van het andere pathogeen. Echter, de analytische gevoeligheid toonde geen noemenswaardige verandering. De gemiddelde Ct waarde van TV nam aanzienlijk af in E-Swab in aanwezigheid van 2, kopieën/ml van MG, echter de analytische gevoeligheid toonde geen noemenswaardige verandering. De detectie van MG in E-Swab veranderde niet door de aanwezigheid van 2, kopieën/ml van TV. 9.5 Klinische Werking De klinische werking van de S-DiaMGTV TM kit is bepaald in een retrospectief of prospectief onderzoek uitgevoerd door verschillende laboratoria als vergelijk voor de gevalideerde inhuis gemaakte PCR methodes voor MG (6, 7) en TV (8, 9) respectievelijk. Materiaal type, aantal geteste samples, extractie en PCR methoden van S-DiaMGTV TM zijn samengevat in de volgende tabel. Matrix MG TV Extractie methode PCR methode MagNA Pure 96 LightCycler 480 Vrouwelijke en mannelijke urine Abbott m2000 rt Abbott m2000 sp Cobas 480x Cobas 480z Urogenitale uitstrijk in Amplicor TM MagNA Pure 96 LightCycler 480 Urogenitale uitstrijk in Abbott TM Abbott m2000 rt Abbott m2000 sp Urogenitale uitstrijk in Cobas TM Cobas 480x Cobas 480z P a g i n a 40

47 P a g i n a 41 Diagnostische gevoeligheid, diagnostische specificiteit en nauwkeurigheid (algemene overeenkomst) zijn berekend voor MG en TV detectie respectievelijk. De resultaten zijn weergegeven in de volgende tabellen. MYCOPLASMA GENITALIUM Referentie test Sample: Urine Extractie: MagNA Pure 96 PCR: LC480 Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (68,0 100,0) 95 % CI Specificiteit 100,0 % (94,0 100,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 1,0 TRICHOMONAS VAGINALIS Referentie test Sample: Urine Extractie: MagNA Pure 96 PCR: LC480 Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (34,0 100,0) 95 % CI Specificiteit 100,0 % (95,0 100,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 1,0 MYCOPLASMA GENITALIUM Referentie test Sample: Amplicor Transport Medium Extractie: MagNA Pure 96 PCR: LC480 Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (78,5 100,0) 95 % CI Specificiteit 97,6 % (87,7 99,6) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 0,95 Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

48 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING TRICHOMONAS VAGINALIS Referentie test Sample: Amplicor Transport Medium Extractie: MagNA Pure 96 PCR: LC480 Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 92,9% (77,4 98,0) 95 % CI Specificiteit 98,2 % (90,4 99,7) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 0,9 MYCOPLASMA GENITALIUM Referentie test Sample: Urine Extractie: Abbott m2000 rt PCR: Abbott m2000 sp Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (83,9 100,0) 95 % CI Specificiteit 100,0 % (99,1 100,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 1,0 TRICHOMONAS VAGINALIS Referentie test Sample: Urine Extractie: Abbott m2000 rt PCR: Abbott m2000 sp Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (51,0 100,0) 95 % CI Specificiteit 100,0 % (89,6 100,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 1,0 P a g i n a 42

49 P a g i n a 43 MYCOPLASMA GENITALIUM Referentie test Sample: Abbott Transport Medium Extractie: Abbott m2000 rt PCR: Abbott m2000 sp Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (82,4 100,0) 95 % CI Specificiteit 100,0 % (99,0 100,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 1,0 TRICHOMONAS VAGINALIS Referentie test Sample: Abbott Transport Medium Extractie: Abbott m2000 rt PCR: Abbott m2000 sp Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (51,0 100,0) 95 % CI Specificiteit 97,1 % (85,5 99,5) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 0,9 MYCOPLASMA GENITALIUM Referentie test Sample: Urine Extractie: Cobas 480x PCR: Cobas 480z Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (82,0 100,0) 95 % CI Specificiteit 95,9% (86,0 99,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 0,9 Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

50 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING TRICHOMONAS VAGINALIS Referentie test Sample: Urine Extractie: Cobas 480x PCR: Cobas 480z Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (68,0 100,0) 95 % CI Specificiteit 88,9 % (67 100,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 0,8 MYCOPLASMA GENITALIUM Referentie test Sample: Cobas transport medium Extractie: Cobas 480x PCR: Cobas 480z Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 100,0% (86,0 100,0) 95 % CI Specificiteit 100,0 % (92,0 100,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 1,0 TRICHOMONAS VAGINALIS Referentie test Sample: Cobas transport medium Extractie: Cobas 480x PCR: Cobas 480z Positief Negatief TOTAAL S-DiaMGTV TM kit Positief Negatief Gevoeligheid 80,0%* (38,0 96,0) 95 % CI Specificiteit 97,4 % (99,0 100,0) 95 % CI TOTAAL Algemene overeenkomst: k = 0,8 *De prevalentie van Trichomonas vaginalis kan laag zijn in bepaalde populaties of patiënten groepen (zie punt 9.6 Prevalentie) en kan de werking van de test beïnvloeden. De gevoeligheid van 80% is grotendeels ten gevolge van de lage prevalentie van Trichomonas vaginalis in de door ons bekeken populatie. P a g i n a 44

51 P a g i n a Prevalentie De prevalentie in Frankrijk van MG en TV positieve samples per geslacht en per type sample zijn weergegeven in de volgende tabel: MG TV Globaal 3,80% 0,72% Urogenitale uitstrijk 4,53% 1,51% Vrouwelijk 4,44% 1,57% Mannelijk 7,14% 0,00% Urine 4,51% 0,90% Vrouwelijk 4,35% 4,35% Mannelijk 4,52% 0,71% 10. Test Beperkingen Alle reagentia moeten enkel worden gebruikt voor in vitro diagnostiek. Een strikte naleving van de handleiding is nodig voor een optimaal resultaat. Betrouwbare resultaten zijn afhankelijk van voldoende materiaal, transport, opslag en verwerkingsprocedures. Deze test is gevalideerd met het Roche MagNA Pure 96 extractie systeem op de Roche LightCycler 480 voor opsporing in urine en in urogenitale uitstrijken in Amplicor Specimen Transport Medium. Deze test is gevalideerd met het Cobas 4800 systeem voor de detectie in urine en in urogenitale uitstrijken in Cobas PCR Medium. Deze test is gevalideerd met het Abbott m2000 systeem voor de detectie in urine en in urogenitale uitstrijken in Abbott Multi-Collect. Negatieve resultaten sluiten infectie niet uit en enkel op basis van deze resultaten mag niet worden overgegaan tot diagnose, behandeling of andere beslissingen. Er is een kans op vals negatieve waarden door de aanwezigheid van sequentie varianten in het target organisme van de assay, procedurefouten, amplificatie inhibitoren in samples, of een onvoldoende aantal organismen voor amplificatie. Vals negatieve resultaten kunnen ook voorkomen door verlies van nucleïnezuur. De inhibitie controle is toegevoegd aan de test om te helpen bij het identificeren van samples die inhibitoren voor de PCR amplificatie bevatten. De controle geeft niet aan of nucleïnezuur verloren is gegaan door inadequate afname, door transport of door opslag van materiaal. Er is een kans op vals positieve waarden van contaminatie door target organismen, door hun nucleïnezuren of geamplificeerd product, of door een niet-specifiek signaal in de assay. Er is een kans op vals positieve waarden met een hoge Ct waarde en een lage eindpunt fluorescentie ten gevolge van kruisreactie tussen Mycoplasma genitalium en Mycobacterium smegatis, Streptococcus salivarium, Vibrio paraheamolyticus. Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

52 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 11. Kwaliteit Certificering Diagenode is ISO 9001 en ISO gecertificeerd voor het ontwerp, productie en verkoop van IVD assays die gebruik maken van nucleïnezuur-gebaseerde technologie voor infectieziekten. De S-DiaMGTV TM kit is getest volgens vooraf vastgestelde specificaties om de productkwaliteit te waarborgen. 12. Referenties 1. Soper, D (2004). "Trichomoniasis: under control or undercontrolled?". American Journal of Obstetrics and Gynecology 190 (1): Centers for Disease Control and Prevention. Trichomoniasis CDC Fact Sheet. Geraadpleegd op 4 oktober Victoria J. Chalker, Karen Jordan, Tahir Ali en Cathy Ison. Real-time PCR detection of the mg219 gene of unknown function of Mycoplasma genitalium in men with and without nongonococcal urethritis and their female partners in England. Journal of Medical Microbiology (2009), 58, Jørgen Skov Jensen, Eva Björnelius, Birthe Dohn en Peter Lidbrink. Use of TaqMan 5 Nuclease Real-Time PCR for Quantitative Detection of Mycoplasma genitalium DNA in Males with and without Urethritis Who Were Attendees at a Sexually Transmitted Disease Clinic. J. Clin. Microbiol. 2004, 42(2): Jurjen Schirm, Petra A.J. Bos, Irene K. Roozeboom-Roelfsema, Dirk S. Luijt, Lieke V. Möller. Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR. Journal of Microbiological Methods 68 (2007) Palmer HM, Gilroy CB, Claydon EJ, Taylor-Robinson D. Detection of Mycoplasma genitalium in the genitourinary tract of women by the polymerase chain reaction. Int J STD AIDS Jul-Aug;2(4): Jensen J S, Bjornelius E, Dohn B, Lidbrink P Use of Taqman 5 nuclease real-time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who attendees at a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol. 42: Schirm, J et al., Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR. J. Microbiol. Methods 68, Schirm J, Bos PA, Roozeboom-Roelfsema IK, Luijt DS, Möller LV Trichomonas vaginalis detection using real-time TaqMan PCR. J. Microbiol. Methods. 68: P a g i n a 46

53 P a g i n a Verklaring van Symbolen Catalogusnummer Batch code Bevat voldoende voor «n» testen Bovengrens van temperatuur Gebruik voor jjjj-mm In vitro diagnostisch medisch apparaat Raadpleeg gebruiksaanwijzing Biologisch risico Controle Negatieve controle Positieve controle Niet blootstellen aan zonlicht Fabrikant Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

54 MA-G-DiaNota_14_11_13 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING 14. Mededeling aan Koper Dit product is ontwikkeld om gebruikt te worden in de polymerase ketting reactie (PCR) die valt onder de patenten die eigendom zijn van Roche Molecular Systems, Inc., en F. Hoffmann-La Roche ltd. (Roche). Vanwege deze patenten wordt geen licentie voor gebruik van het PCR proces expliciet of impliciet overgedragen aan de koper bij aankoop van dit product. Een licentie voor het gebruik van het PCR proces voor bepaalde onderzoeksactiviteiten wordt meegeleverd bij de aankoop van bepaalde reagentia bij gelicentieerde leveranciers, wanneer gebruikt in combinatie met een Authorized Thermal Cycler, of is verkrijgbaar bij Applied Biosystems. Verdere informatie voor het verkrijgen van licenties voor het gebruik van het PCR proces kunnen worden verkregen door contact op te nemen met de Director of Licensing bij Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California of bij Roche Molecular Systems, Inc, 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California Optima en S-DiaMGTV zijn merken van Diagenode Diagnostics Eswab is een merk van Copan Diagnostics Abbott m2000, m2000rt, en m2000sp zijn merken van Abbott Laboratories. LightCycler, MagNA Pure, Cobas en Taqman zijn merken van Roche FAM is een merk van Applera Corporation Dragonfly orange is een merk van Eurogentec S.A Texas Red is een merk van Molecular Probes Cy5 is een merk van GE Healthcare Bio-Sciences trademark of GE Healthcare Bio- Sciences. P a g i n a 48

55 P a g i n a 49 DDGS-60-V01_NL_01_07_2015 Europe Diagenode sa / LUIK SCIENCE PARK // Rue du Bois Saint-Jean, 3 // 4102 Seraing // België // Telefoon: (+32) // Mail: info@diagenodediagnostics.com

56 DIAGENODE S-DiaMGTV TM GEBRUIKSAANWIJZING Diagenode sa Luik Science Park Rue du Bois Saint-Jean, Seraing BELGIË Tel info@diagenodediagnostics.com P a g i n a 50