Nederlandse norm NEN Melk en melkproducten Bepaling van het gehalte aan sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën

Transcriptie

1 Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. Nederlandse norm NEN 6809 Melk en melkproducten Bepaling van het gehalte aan sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën Milk and milk products Determination of the content of thermophilic aerobic sporeforming bacteria Vervangt NEN 6809:1998 Ontw. ICS e druk, februari 1999

2 Normcommissie Melk en zuivelproducten Auteursrecht voorbehouden. Behoudens uitzondering door de wet gesteld mag zonder schriftelijke toestemming van het Nederlands Normalisatie-instituut niets uit deze uitgave worden verveelvoudigd en/of openbaar gemaakt door middel van fotokopie, microfilm, opslag in computerbestanden of anderszins, hetgeen ook van toepassing is op gehele of gedeeltelijke bewerking. Het Nederlands Normalisatie-instituut is met uitsluiting van ieder ander gerechtigd de door derden verschuldigde vergoedingen voor verveelvoudiging te innen en/of daartoe in en buiten rechte op te treden, voor zover deze bevoegdheid niet is overgedragen c.q. rechtens toekomt aan de Stichting Reprorecht. Hoewel bij deze uitgave de uiterste zorg is nagestreefd, kunnen fouten en onvolledigheden niet geheel worden uitgesloten. Het Nederlands Normalisatie-instituut en/of de leden van de commissies aanvaarden derhalve geen enkele aansprakelijkheid, ook niet voor directe of indirecte schade, ontstaan door of verband houdende met toepassing van door het Nederlands Normalisatie-instituut gepubliceerde uitgaven Nederlands Normalisatie-instituut Kalfjeslaan 2, Postbus 5059, 2600 GB Delft, Telefoon (015) , Fax (015)

3 Blz. 1 NEN 6809: Onderwerp en toepassingsgebied Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van het gehalte aan sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën in melk en melkproducten. Voor algemene aanwijzingen voor microbiologisch onderzoek is een praktijkrichtlijn in voorbereiding. 2 Normatieve verwijzingen De volgende normen bevatten bepalingen die, doordat ernaar wordt verwezen, tevens bepalingen van deze norm zijn. Op het ogenblik van publicatie van de onderhavige norm waren de vermelde drukken van kracht. Alle normen kunnen echter worden herzien; de partijen die overeenkomsten sluiten op basis van deze norm wordt daarom aanbevolen na te gaan of het mogelijk is, de meest recente druk van de onderstaande normen toe te passen. NEN 6872:1985 Melk en melkprodukten Voorbehandeling van het monster en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek NEN-EN-ISO 707:1997 Melk and melk producten Leidraad voor monsterneming 3 Termen en definities 3.1 sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën: Micro-organismen die bij toepassing van de beschreven werkwijze karakteristieke kolonies vormen. 3.2 gehalte aan thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën: Het aantal kolonievormende eenheden van sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën per ml of per g melkproduct. 4Beginsel Een hoeveelheid vloeibaar monster of decimale verdunning ervan wordt gedurende 30 min verhit op 100 C. Aansluitend worden één of meer hoeveelheden van het verhitte monster of van de verhitte verdunning, en/of van verdunningen ervan, in petrischalen gemengd met een algemeen voedingsmedium. De petrischalen worden bij 55 C bebroed. De ontwikkelde kolonies worden herleid tot het aantal sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën per ml of per g melk of melkproduct. 5 Voedingsmedia en verdunningsvloeistoffen 5.1 Algemeen Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd. 5.2 Dextrose Trypton agar Samenstelling trypton 10,0 g glucose (C 6 H 12 O 6 ) 5,0 g boomcresolpurper 0,04 g agar 10 g 15 g water 1000 ml Bereiding Los de ingrediënten of het droge medium onder verwarming op in het water. Stel de ph van de oplossing zo in dat deze na sterilisatie 6,9 0,1 bedraagt bij 25 C. Steriliseer gedurende 15 min bij (121 1) C. Bewaar het medium in het donker bij 0 C tot 5 C ten hoogste 6 maanden. Dextrose Trypton agar is als samengesteld medium in de handel verkrijgbaar. 5.3 Verdunningsvloeistoffen Zie voor de samenstelling en de bereiding van verdunningsvloeistoffen NEN Toestellen glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria en in het bijzonder de onderstaande. Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 6.1 Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm. 6.2 Cultuurbuizen met inwendige afmetingen van ca. 16 mm x 150 mm. 6.3 Broedstoof voor het bebroeden bij (55 1) C. 6.4 Suspendeertoestel, Stomacher. 6.5 Waterbad ingesteld op (45 1) C. 6.6 Stoompan of kokend waterbad, voorzien van deksel. 7 Voorbehandeling van het monster Behandel het monster voor volgens NEN Zie ook 8.1. Zie voor monsterneming NEN-EN-ISO Werkwijze 8.1 Bereiding van verdunningen Maak een eerste decimale verdunning van dikvloeibare of poedervormige monsters, of van monsters met een phkleiner dan 5,5. Zie hiervoor NEN Pasteurisatie Breng met een pipet 5 ml à 10 ml dunvloeibaar monster met een ph groter dan of gelijk aan 5,5, of eerste decimale verdunning van dikvloeibaar of poedervormig monster, of van eerste decimale verdunning van monster met een ph kleiner dan 5,5, in een steriele buis (zie 6.2) Plaats, binnen 10 min nadat het monster uit de koeling is genomen, of de eerste decimale verdunning is gemaakt, de buis in het kokend waterbad of de stoompan. Herplaats het deksel. Indien de buis niet binnen 10 min in het kokend waterbad of stoompan wordt gebracht, moet deze direct volgend op in smeltend ijs worden geplaatst voor maximaal 2 h. De verwarming van het waterbad of de stoompan moet zodanig zijn, dat tijdens de gehele pasteurisatiebehande-

4 Blz. 2 NEN 6809:1999 ling enige stoom van onder het deksel vrijkomt. Dit garandeert dat de temperatuur in de ruimte boven het water 100 C is Pasteuriseer gedurende (30 1) min, gerekend vanaf het plaatsen van de buis in het waterbad of de stoompan Koel de buis in water met een temperatuur kleiner dan of gelijk aan 20 C, bijvoorbeeld in leidingwater. 8.3 Bereiding van verdere verdunningen Maak, indien nodig, verdere decimale verdunningen van de gepasteuriseerde vloeistof volgens NEN een kwart van het oppervlak is overgroeid, het aantal kolonies in een zo groot mogelijk gedeelte van het niet overgroeide oppervlak, en herleid het tellingsresultaat tot het totale oppervlak. 8.6 Blancobepaling Verricht voldoende blancobepalingen ter controle van de steriliteit van het voedingsmedium, de verdunningsvloeistof, het glaswerk en van verdunningsvloeistof die dezelfde handelingen heeft ondergaan als het gepasteuriseerde monster of de gepasteuriseerde verdunning. 9 Berekening van het resultaat 8.4Enting en bebroeding Maak een keuze uit de gepasteuriseerde vloeistof en decimale verdunningen ervan, zodat aan het einde van de bebroedingsperiode ten minste één petrischaal kan worden verwacht met 10 tot 150 kolonies Breng van elk 1 ml over in een petrischaal. Doe dit in tweevoud. Sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën komen vaak in slechts lage aantallen per ml of per g melk of melkproduct voor. Wil men deze lage aantallen kunnen meten, dan zou men zelf daartoe maatregelen moeten nemen. Men kan: meer petrischalen enten met de hoogste hoeveelheid van het gepasteuriseerde vloeibare monster of van de gepasteuriseerde eerste verdunning; gebruik maken van grotere petrischalen, waarin meer dan 1 ml kan worden geënt; hoeveelheden gepasteuriseerd monster of eerste verdunning incuberen bij 55 C, gevolgd door het bebroeden bij 55 C van platen met afstrijken van deze bebroede hoeveelheden; een centrifugatie van het monster of van de eerste verdunning toepassen; zie hiervoor NEN Aanpassing van de werkwijze zou bij de weergave van het resultaat moeten worden vermeld. Zie ook hoofdstuk Breng vervolgens minimaal 12 ml van het vloeibaar gemaakte en tot (45 1) C afgekoelde voedingsmedium (5.2) in elk van deze petrischalen. Meng de inhoud onmiddellijk en zorgvuldig en laat stollen. Tussen het einde van het pasteuriseren en het mengen met het voedingsmedium mag niet meer dan 15 min verstrijken Plaats de petrischalen met de bodem naar boven in een plastic zak in de broedstoof bij (55 1) C en bebroed gedurende (48 2) h. Indien mag worden verwacht dat door overgroeiing de telling onmogelijk zal worden, kan dit worden tegengegaan door: het voedingsmedium in de petrischalen na het stollen te overgieten met ongeveer 5 ml van het nog vloeibare voedingsmedium; een schijfje filtreerpapier voorzien van enkele druppels glycerol in het deksel te brengen. 8.5 Telling van het aantal kolonies Tel het aantal kolonies, bij voorkeur met behulp van een kolonietelapparaat. Verricht geen tellingen in petrischalen waarvan een kwart of meer van het oppervlak van het voedingsmedium is overgroeid. Tel, indien minder dan 9.1 Gebruik uitsluitend tellingen van petrischalen die, eventueel herleid tot het totale oppervlak, ten minste 10 en niet meer dan 150 kolonies bevatten. 9.2 Bereken met behulp van de uitkomsten verkregen volgens 8.5 het gehalte aan sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën met de formule: N c C (n 1 0, 1n 2 )f waarin: N c is het gehalte aan genoemde sporen, in aantal kolonievormende eenheden per ml of per g; C is de som van de kolonies geteld volgens 8.5 en 9.1; n 1 is het aantal petrischalen met de laagste verdunning waarin aantallen kolonies zijn verkregen die kunnen worden geteld volgens 8.5 en 9.1; n 2 is het aantal petrischalen met de hierop volgende verdunning waarin kolonies zijn verkregen die kunnen worden geteld volgens 8.5 en 9.1; f is het volume, in ml, of de massa, in g, van het onverdunde monster, dat eventueel na verdunning volgens 8.1 en/of 8.3, aanwezig is in de petrischaal met de laagste verdunning. EN De getalwaarde van f wordt vanouds aangeduid als de verdunningsfactor. : Bij een verdunningsfactor 10 2 bevat de petrischaal 10 2 g of 10 2 ml van het onverdunde monster. De laagste verdunning is de verdunning met het hoogste gehalte aan monstermateriaal. 9.3 Rond de uitkomst af op twee significante cijfers. 9.4 Indien op alle petrischalen, herleid tot het totale oppervlak, minder dan 10 kolonies zijn geteld, geef dan als resultaat op: kleiner dan 10/f, waarin f de waarde heeft die overeenkomt met de laagste verdunning. 9.5 Indien op alle petrischalen, herleid tot het totale oppervlak, meer dan 150 kolonies zijn geteld, geef dan als resultaat op groter dan 150/f, waarin f de waarde heeft die overeenkomt met de hoogste verdunning. 9.6 Het resultaat kan ook worden uitgedrukt in een getal tussen 1,0 en 9,9 vermenigvuldigd met 10 x ml 1 of 10 x g 1, waarin x de passende macht van 10 is. 9.7 Verdunning 10 0 : 86 en 101 kolonies Verdunning 10 1 : 8 en 12 kolonies N c ( ) 199 (2 0, 1 1)100 2, 1 94, 8 ml 1

5 Bestelformulier Stuur naar: NEN Standards Products & Services t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer WB Delft NEN Standards Products & Services Postbus GB Delft Vlinderweg AX Delft Ja, ik bestel ex. NEN 6809:1999 nl Melk en melkproducten - Bepaling van het gehalte aan sporen van thermofiele aërobe sporenvormende bacteriën T (015) F (015) Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via Gratis nieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze nieuwsbrieven. Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: klantenservice@nen.nl Post: NEN Standards Products & Services, t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2018, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon , dagelijks van 8.30 tot uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: LEREN, WERKEN EN GROEIEN MET NEN preview