PBO-blad. Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie. jaargang 54 8 oktober 2004 num mer 61

Transcriptie

1 PBO-blad Sociaal- Economische Raad M e d e d e l i n g e n b l a d e n V e r o r d e n i n g e n b l a d B e d r i j f s o r g a n i s a t i e I n h o u d s o p g a v e jaargang 54 8 oktober 2004 num mer 61 Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie BEDRIJFSLICHAMEN 2 Productschap Pluimvee en Eieren (PPE 39 tot en met PPE 47) 2

2 Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie BEDRUFSLICHAMEN Productschap Pluimvee en Eieren PPE 39 Verordening tot wijziging van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 (2004-1) Verordening van het Productschap Pluimvee en Eieren van 10 juni 2004 tot wijziging van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op de artikelen 93, eerste lid, 95 en 102 van de Wet op de bedrijfsorganisatie, en de artikelen 6 en 7 van het Instellingsbesluit Productschap Pluimvee en Eieren; Besluit: Artikel l De Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 wordt gewijzigd als volgt: In artikel 2, eerste lid, onder f., wordt tussen 'schone' en 'bedrijfskleding' ingevoegd: voor de pluimveevleessector staleigen. Aan artikel 2, eerste lid, wordt een nieuw onderdeel p. toegevoegd dat luidt: A B p. In de pluimveevleessector dienen de oppervlakken in de stallen glad en dicht te zijn. Bij visuele controle dienen naden en kieren schoon te zijn. Aan artikel 2, tweede lid, wordt een nieuw onderdeel m. toegevoegd dat luidt: m. In de pluimveevleessector dient mest, afkomstig van met Salmonella paratyphi B var. Java besmette koppels, van het bedrijfsperceel afgevoerd te worden. Deze mest mag niet in de directe omgeving van pluimveebedrijven worden uitgereden. C Artikel 3, eerste lid, komt te luiden: 1. ledere ondernemer die een pluimveebedrijf uitoefent is, onverminderd enig ander wettelijk voorschrift, verplicht onmiddellijk na het ontruimen van een stal waarin hij een koppel pluimvee heeft gehouden, de in die stal aanwezige mest en strooisel te verwijderen en na afvoer van de mest en strooisel de betreffende stal grondig te reinigen en te ontsmetten.

3 Het plaatsen van nieuwe leghennen is pas toegestaan na het reinigen en het ontsmetten van de stal. Uitgezonderd zijn de meerleeftijdenstallen en koppels die geruid zijn. Meerleeftijdenstallen worden niet ontsmet maar slechts gereinigd. In artikel 3, vierde lid, vervalt de zin: "Indien bij de ondernemer die een pluimveebedrijf in de pluimveevleessector uitoefent twee maal achtereen bij een koppel één van de in de bijlage onderdeel a. bedoelde schadelijke micro-organismen is geconstateerd moet de ondernemer na het reinigen en ontsmetten door een professioneel ontsmettingsbedrijf naast het hygiëne-onderzoek een tracerings-, monitorings- en bestrijdingsplan opstellen." In artikel 4, eerste lid, wordt de zinsnede "de soorten voeders die bemonsterd dienen' gewijzigd in: het materiaal dat bemonsterd dient. Aan artikel 6 wordt een veertiende lid toegevoegd dat luidt: 14. Indien bij de ondernemer die een pluimveebedrijf in de pluimveevleessector uitoefent bij een koppel één van de in de Bijlage, onderdeel a., bedoelde schadelijke microorganismen is geconstateerd, moet de ondernemer een tracerings-, monitorings- en bestrijdingsplan opstellen. Artikel II Deze verordening treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie waarin zij wordt geplaatst. Zoetermeer, 10 juni 2004 J.J. Ramakers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. Goedgekeurd door de Bestuurskamer van de Sociaal-Economische Raad bij besluit van 9 september 2004 en door de Minister van Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit bij beschikking van 17 augustus 2004, nr. TRCJZ/2004/4601. TOELICHTING BIJ DE VERORDENING TOT WIJZIGING VAN DE VERORDENING HYGIËNEVOORSCHRIFTEN PLUIMVEEHOUDERIJ 1999 (2004-1) In het afgelopen jaar heeft met name Salmonella paratyphi B var. Java (S. Java) zich gemanifesteerd in pluimvee. Begin 2003 was zo'n 50% van de met Salmonella besmette eindproducten met S. Java besmet. S. Java wordt voor de volksgezondheid een steeds groter probleem vanwege de groeiende resistentie van deze Salmonella tegen een aantal antibiotica. Met het oog hierop is reeds een meldplicht voor S. Java van kracht. Dit houdt in dat zodra bij een pluimveehouder of broederij een S. Java besmetting wordt geconstateerd dit binnen 48 uur gemeld moet worden aan het productschap.

4 Deze ontwikkeling is aanleiding om de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij te wijzigen. Om S. Java op effectieve wijze te kunnen bestrijden is een plan opgesteld ter preventie en bestrijding van Salmonella paratyphi B var. Java (onderdeel van het Actieplan Salmonella). Ter preventie van S. Java besmettingen zal de pluimveehouder extra hygiënemaatregelen dienen te nemen. Dit houdt in dat de oppervlakken in de stallen glad zijn en dat de naden en kieren visueel schoon zijn. Ook moet voorkomen worden dat S. Java via de mest, een potentiële besmettingsbron, verspreid kan worden. Om te voorkomen dat besmettingen zich over de stallen verspreiden is de verplichting om bedrijfseigen kleding te dragen aangescherpt tot de verplichting tot het dragen van staleigen kleding. De bestrijdingsmaatregelen die genomen moeten worden wanneer een S. Java besmetting wordt geconstateerd zijn opgenomen in het Hygiënebesluit vermeerderingsbedrijven pluimveevleessector 2003 en het Hygiënebesluit vleeskuikenbedrijven Voorts blijkt het in de praktijk voor te komen dat een deel van het koppel leghennen in de stal wordt geruimd, waarna nieuwe hennen in de stal worden bijgeplaatst zonder dat de stal wordt gereinigd en wordt ontsmet. De gewenste situatie is dat nieuwe leghennen pas geplaatst mogen worden na het reinigen en ontsmetten van de stal, uitgezonderd de meerleeftijdenstallen (die moeten wel gereinigd worden, maar ontsmetten is onmogelijk) en de ruikoppels (bijplaatsen van hennen is toegestaan). Door aanpassing van het eerste lid van artikel 3 wordt het beoogde doel van dit onderdeel van het Actieplan Salmonella, het zoveel mogelijk reduceren van Salmonella, beter bereikt. Tot slot is in de verordening en de nadere regelgeving aangegeven dat onmiddellijk na een Salmonella besmetting een tracerings-, monitorings- en bestrijdingsplan opgesteld moet worden. In het verleden diende dit pas na twee achtereenvolgende Salmonellabesmettingen op het bedrijf uitgevoerd te worden. Ook hoeft niet meer onmiddellijk gebruik te worden gemaakt van een professioneel ontsmettingsbedrijf. Zoetermeer, l O juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. PPE 40 Verordening tot wijziging van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 (2004-1) Verordening van het Productschap Pluimvee en Eieren van 10 juni 2004 tot wijziging van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op de artikelen 93, eerste lid, 95 en 102 van de Wet op de bedrijfsorganisatie, en de artikelen 6 en 7 van het Instellingsbesluit Productschap Pluimvee en Eieren; Besluit:

5 Artikel l De Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 wordt gewijzigd als volgt: Aan artikel 1 worden na de woorden "be- of verwerkt" de volgende definities toegevoegd: partij: onderneming: slachterij: uitsnijderij: een aaneengesloten geleverde hoeveelheid vleeskuikens, welke afkomstig is van één pluimveehouder; tot de onderneming worden gerekend alle inrichtingen waarin pluimvee wordt be- of verwerkt en welke voor tenminste 51 % in eigendom zijn van dezelfde ondernemer; een inrichting waar pluimvee wordt geslacht en die voldoet aan de in de Richtlijn 71/118/EEG gestelde eisen en als zodanig erkend zijn; een inrichting waarin pluimveevlees wordt uitgesneden of uitgebeend, verpakt of opgeslagen en die voldoet aan de in Richtlijn 71/118/EEG gestelde eisen en als zodanig erkend is. Aan artikel 2 wordt een onderdeel d. toegevoegd dat luidt: d. alle gebruikte attributen te reinigen en te ontsmetten. B Artikel 3 wordt als volgt gewijzigd: 1. Aan het eerste en aan het tweede lid wordt de volgende zin toegevoegd: De monsters, waarvan de wijze van monstername en analyse bij bestuursbesluit nader zijn omschreven, moeten geanalyseerd worden op alle typen Salmonella. Bij een besmetting moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. 2. Het zesde lid komt te luiden als volgt: C 6. Dagelijks moet een monster worden genomen van de kratten en containers waarmee het pluimvee is aangevoerd. Wanneer bij één of meerdere koppels de in de Bijlage, onderdeel a., bedoelde schadelijke micro-organismen zijn aangetoond dient het betreffende monster te worden genomen van de kratten en containers van dit besmette koppel. Het bestuur kan regels stellen omtrent de wijze van monstername en analyse en de te nemen maatregelen bij besmettingen met de in de Bijlage, onderdeel a., bedoelde schadelijke micro-organismen.

6 Artikel II Deze verordening treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie waarin zij wordt geplaatst. Zoetermeer, 10 juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. Goedgekeurd door de Bestuurskamer van de Sociaal-Economische Raad bij besluit van 9 september 2004 en door de Minister van Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit bij beschikking van 17 augustus 2004, nr. TRCJZ/2004/4600. TOELICHTING BIJ DE VERORDENING TOT WIJZIGING VAN DE VERORDENING HYGIËNEVOORSCHRIFTEN PLUIMVEEVERWERKENDE INDUSTRIE 1999 (2004-I) In het afgelopen jaar heeft met name Salmonella paratyphi B var. Java (S. Java) zich gemanifesteerd in pluimvee. Begin 2003 was zo'n 50% van de met Salmonella besmette eindproducten met S. Java besmet. S. Java wordt voor de volksgezondheid een steeds groter probleem vanwege de groeiende resistentie tegen een aantal antibiotica. Deze ontwikkeling is aanleiding om de verordening te wijzigen. Er is gebleken dat aan de sector meer duidelijkheid verschaft dient te worden over een aantal definities. Het betreffen definities waarvan in het Besluit eindcontrolenorm 2001 melding wordt gemaakt. Er worden enkele definities benoemd in onderhavige verordening. Om S. Java op effectieve wijze te kunnen bestrijden is een plan opgesteld ter preventie en bestrijding van Salmonella paratyphi B var. Java. Ter preventie van S. Java besmettingen zal ook de slachterij extra hygiënemaatregelen dienen te nemen. Dit houdt in dat alle gebruikte apparatuur goed gereinigd en ontsmet moet worden. Daarnaast wordt een wekelijkse monitoring van de kratten en containers op de aanwezigheid van Salmonella verplicht. Indien meer dan tweemaal per week Salmonella wordt gevonden op de kratten en containers moet het reinigingssysteem waarmee de kratten en containers worden gereinigd worden geïnspecteerd. Het resultaat van deze inspecties moet worden geregistreerd. De bestrijdingsmaatregelen die genomen moeten worden wanneer een S. Java besmetting wordt geconstateerd zijn opgenomen in het Hygiënebesluit vermeerderingsbedrijven pluimveevleessector 2003 en het Hygiënebesluit vleeskuikenbedrijven Tot slot is, ten behoeve van de transparantie van de regelgeving, de verplichting tot het nader serotyperen van alle met Salmonella besmette pluimveemonsters nu ook in de verordening opgenomen. Deze verplichting was reeds in de monstername- en analyseprotocollen bij het Besluit blindedarmmonstername 1999 en het Besluit eindproductencontrole 1999 opgenomen. Zoetermeer, 10 juni 2004 J J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris.

7 PPE 41 Besluit tot wijziging van het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 ( ) Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 9 september 2004 tot wijziging van het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op artikel 4 en 6 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999, Besluit: Artikel Het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 wordt gewijzigd als volgt: In artikel 2 wordt bijlage VI vervangen door de bijlage bij dit besluit. Artikel II Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie waarin het wordt geplaatst. Zoetermeer, 9 september 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. A TOELICHTING BIJ HET BESLUIT TOT WIJZIGING VAN HET BESLUIT PROTOCOLLEN HYGIËNEVOORSCHRIFTEN PLUIMVEEHOUDERIJ 1999 (2004-II) Het besluit voorziet in de wijziging van de voorwaarden voor erkenning van laboratoria zoals deze zijn opgenomen in Bijlage VI. Met deze wijziging wordt een alternatieve branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter s/op.opgenomen. Deze methode betreft de VIDAS CAM in pluimveeproducten. Dit is een snelle detectiemethode voor het aantonen van Campylobacter in pluimveevleesproducten. De methode is gevalideerd ten opzichte van de branchemethode en akkoord bevonden door de Raad voor Accreditatie. Zoetermeer, 9 september 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris.

8 Bijlage VI: Analysemethoden voor het aantonen van Salmonella en Campylobacter in pluimvee(vlees) en eieren Voor het aantonen van Salmonella en/of Campylobacter in pluimvee(vlees) en eieren staat de pluimveesector een aantal analysemethoden ter beschikking, welke goedgekeurd zijn door de Raad voor Accreditatie. Het laboratorium kan deze analysemethoden toepassen voor de analyses in het kader van de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij 1999 en de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie Het laboratorium dient dan wel de betreffende analysemethode onder haar accreditatie van de Raad voor Accreditatie (ISO/IEC 17025) onder te brengen. De analysemethoden zijn: 1. PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. 2. Alternatieve PVE Branchemethode Probelia PCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. 3. Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons afkomstig van pluimvee. 4. PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante Campylobacter spp. in monsters pluimvee, pluimveeproducten en omgevingsmonsters. 5. Alternatieve PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van de VIDAS CAM test in pluimveeproducten.

9 PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee 1. Onderwerp Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces (mest) en vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De Raad voor Accreditatie heeft de methode goedgekeurd voor de matrix mest, dons, vellen en eindproduct. 2. Definities Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmedium, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium. 4. Reagentia en andere materialen Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water BPw bijlage 1.1 Selectief ophopingsmedium modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium MSRV bijlage 1.2 Selectieve agar briljant groen agar BGA bijlage 1.3 Bevestigingsmedia ureumagar UA bijlage 1.4 triple-sugar-ironagar TSI bijlage 1.5 lysine-decarboxylase medium LDC bijlage 1.6 Salmonella polyvalent agglutinatie serum De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn.

10 5. Apparatuur en glaswerk Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast Broedstoof voor het bebroeden bij 37 C ± 1 C 5.2. Broedstoof voor het bebroeden bij 42 C ± 0,5 C 5.3. Waterbad ingesteld op 47 C ± 2 C 5.4. Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm. 6. Werkwijze De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorbehandeling van het monster Verdun het monster 1:10 in BPw. In de volgende tabel 1 is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoeveelheden en het volume BPw weergegeven: aantallen 2x25 3x20 2x x 25 2x swabs swabs swabs paar swabs swabs swabs gram gram gram stukjes (hoeveelheid (circa)) (12,5 gram) (10 gram) (7,5 gram) (10 gram) (12,5 gram) (15 gram) (15 gram) (25 gram) (25 gram) (25 gram) (60 gram) BPw 112, , , ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml type monster swabs broederijen swabs stallen swabs overschoentjes swabs swabs blinde darmmest dons eindproduct vel van de borstkap inlegvellen Incubeer de potten BPw 18 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. De potten mogen tussentijds gedurende 2 dagen in de koelkast bewaard worden, deze 'koudestap' is mogelijk. Beënting en bebroeding Breng 0,1 ml BPw-cultuur op een MSRV plaat (bij 9 cm platen 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,1 ml in een driehoek. Incubeer de platen 1 x 24 ± 2 uur bij 42 C ± 0,5 C. De platen moeten met het deksel van de petrischaal naar boven geïncubeerd worden, aangezien het een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 1 x 24 ± 2 uur bij 42 C ± 0,5 C bebroed te worden. Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een wit/grijze kleur. Verdachte platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een öse Noot: standaard monsters in 225 ml BPw mag ook uitgevoerd worden. Het gaat er om dat er minimaal een 1:10 verdunning gemaakt worden. Een ruimere verdunning dan 1: 10 is toegestaan, een kleinere verdunning dan 1: 10 is niet toegestaan. 10

11 materiaal uit de agar te nemen en daarmee een gedroogde BGA plaat te beënten. Incubeer deze platen gedurende 24 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. Beoorde/ing Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als 'vermoedelijk positief' aangemerkt. Bevestiging Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de BGA plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuingestolde oppervlak en een steekenting tot op de bodem van de buis. Beent tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistof oppervlak af te strijken. De buizen worden 24 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C geïncubeerd. Opmerking; Wanneer geen goed losliggende kolonies op de BGA plaat zijn verkregen of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende stoorflora is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde BGA- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van de Salmonella-kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan om eerst de bevestigingstest met de TSI uit te voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC. Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten: TSI agar onderin de buis - geel - zwart - bellen/scheuren - glucose positief (100%) - vorming van HhS (91,6%) - gasvorming van glucose (91,9%) schuine gedeelte - rood/onveranderd - lactose en/of sucrose negatief (resp. 99,2% en 99,5%) Ureum agar - geen kleuromslag van het medium - negatief (100%) LDC - paarse kleur en groei in medium - positief (94,6%) Het gebruik van biochemische kits (zoals API, Crystal) is ook toegestaan. Biochemisch verdachte kolonies dienen serologisch bevestigd te worden met een polyvalent serum. Dit werkvoorschrift is opgenomen in bijlage

12 De totale beoordeling van biochemische en serologische resultaten is als volgt: Biochemische reacties Auto-agglutinatietabel Agglutinatie met serum pos neg pos pos neg neg pos pos ~ Werkwijze / Resultaat Salmonella RIVM RIVM Indien een stam alleen biochemisch verdacht is, wordt deze opgestuurd naar het RIVM. Een andere mogelijkheid is het inzetten van een zogenaamde 'lange bonte rij' of een biochemische kit. Op het resultaat van het RIVM hoeft niet gewacht te worden, alvorens een uitslag wordt afgegeven. Voor de donsmonsters en faecesmonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella Enteritidis en Salmonella Typhimurium. (indien nog niet bij pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage VIII is het werkvoorschrift opgenomen. 7. Controle Voor de eerstelijnscontrole 2 van de methode dienen te worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle - Blanco controle De eerstelijnscontroles met MSRV platen staan beschreven in bijlage Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal' (zie bijlage VII) als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden om hoeveel gram het ongeveer gaat dat is onderzocht. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage VIII). 9. Bronvermelding - NEN-EN Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - horizontale methode voor het aantonen van Salmonella (ISO 6579:1993, gewijzigd). - Zee, van der H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990, Salmonella isolatie met behulp van MSRV, De Ware (n) chemicus 20: Hartman, dr. E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, september 1999 Indien een ingangscontrole wordt toegepast per batch, kan de negatieve controle komen te vervallen. 12

13 Bijlage 1: Samenstelling en bereiding van media en reagentia 1.1 Gebufferd pepton water (BPw) samenstelling: pepton NaCI N32HP04.12H20 KH 2 P04 water 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1,5 g 1000 ml bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 C. Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen. Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 C). 1.2 Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium (MSRV) 3 oplossing A (basis): tryptose caseine hydrolysaat NaCI KH2P04 MgCI 2 malachietgroen oxalaat agar gedestilleerd water 4,59 g 4,59 g 7,34 g 1,47 g 10,93 g 0,037 g 2,7 g 1000 ml bereiding Los de ingrediënten op in het water. Breng het mengsel onder voortdurend schudden aan de kook (NIET AUTOCLAVEREN). Stel de ph op 5,2 ± 0,2. Koel het mengsel af tot 50 C. oplossing B (novobiocine): Los 10 mg novobiocine op in 2 ml gedestilleerd/demi water. Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter 22 um). bereiding MSRV medium: Voeg oplossing B toe aan 500 ml oplossing A. Meng de oplossing. Giet uit in petrischalen en verwijder de luchtbellen. Even aan de lucht drogen om een nat oppervlak te voorkomen. 3 De MSRV-platen moeten volgens de voorschriften van de leverancier/fabrikant bewaard worden. 13

14 1.3 Briljant groen agar (BGA) oplossing A (basis): vleesextract 5,0 g pepton 10,0 g gistextract 3,0 g N32HP04 1,0 g NaH 2 P04 0,6 g agar 12 g tot 18 g 1 water 900 ml 1 = afhankelijk van de sterkte van de gel bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig via verhitting). Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,0 ± 0,2 is. Schenk het medium in daarvoor geschikte buizen/flessen. Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 C). oplossing B (suiker/fenol rood oplossing): lactose 10,0 g sucrose 10,0 g fenolrood 0,09 g water tot een eindvolume van 100 ml bereiding: Los de componenten op in ± 50 ml water. Vul met water aan tot een eindvolume van 100 ml. Verhit gedurende 20 min. in een waterbad van 70 C. Koel af tot 47 C ± 1 C. Gebruik de oplossing direct. oplossing C (briljant groen oplossing): briljant groen ± 0,5 g water 100 ml bereiding: Voeg het briljant groen (concentratie tussen 4,5 mg/l en 6 mg/l) toe aan het water. Bewaar de oplossing tenminste 1 dag in het donker zodat auto-sterilisatie optreedt. bereiding complete medium: oplossing A oplossing B oplossing C 900 ml 100 ml 1 ml bereiding: Voeg, onder aseptische omstandigheden, oplossing C toe aan de (tot 47 C ± 1 C) afgekoelde oplossing B. Voeg deze oplossing toe aan oplossing A en meng het medium. bereiding van de agar platen: Giet het vers bereide medium in grote (± 40 ml) of in kleine petrischalen (±15 ml). Laat de platen stollen. Droog de platen voor gebruik. 14

15 1.4 Ureumagar (UA) oplossing A (basismedium): pepton 1,0 g glucose 1,0 g NaCI 5,0 g KH 2 P04 2,0 g fenolrood 12,0 mg agar 12,0 tot 18,0 g ' gedestilleerd water 1000 ml ' = afhankelijk van de sterkte van de gel bereiding: Los de ingrediënten op in het water. Stel de ph op 6,8 ± 0,2 bij 25 C en filtreer de oplossing. Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121 C in een autoclaaf. Laat de oplossing afkoelen tot 47 C. oplossing B (ureumoplossing): ureum 400 g gedestilleerd water 1000 ml bereiding: Los de ureum op in het water Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie en controleer de steriliteit. bereiding complete medium: oplossing A oplossing B 950 ml 50 ml bereiding: Voeg oplossing B (ureumoplossing) toe aan oplossing A (basismedium). Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 10 ml medium. Laat de buizen stollen zodat een schuin gedeelte ontstaat. 1.5 Triple-sugar-ironagar (TSI) samenstelling: vleesextract 3,0 g gistextract 3,0 g pepton 20,0 g NaCI 5,0 g lactose 10,0 g sucrose 10,0 g glucose 1,0 g ijzer (III) citraat 0,3 g natriumthiosulfaat 0,3 g fenolrood 0,024 g agar 12,0 tot 18,0 g 1 gedestilleerd water 1000 ml 1 = afhankelijk van de sterkte van de gel 15

16 bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is. Verdeel het medium over buizen, per buis 10 ml medium. Steriliseer de oplossing gedurende 1 5 min bij 120 C in een autoclaaf. Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat. 1.6 Lysine-decarboxylase medium (LDC) samenstelling: 1-lysine monohydrochloride gistextract glucose bromocresol purper water 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,01 5 g 1000 ml bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 is. Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 ml medium. Steriliseer in een autoclaaf (10 min. 121 C). 16

17 Bijlage 2: Eerstelijnscontrole met MSRV platen Onderwerp Deze bijlage beschrijft een methode voor de eerstelijnscontrole op de analyse van Salmonella met MSRV. Werkwijze Om de kwaliteit van de geproduceerde media te bewaken, dient iedere dag een controle volgens onderstaand schema te worden uitgevoerd. Positieve controle Inoculum: Kolonie aanstippen met entoogje en afstrijken langs de wand van een buisje met gebufferd peptonwater (BPW). Ca. 24 ± 2 uur bij 37 C incuberen in BPw (10 8 ) en verdunnen tot 10 3 of commercieel verkrijgbaar bij de IGB Groningen. Controlestam: S. enteritidis 100 ul op de plaat pipetteren incuberen 1 x 24 ± 2 uur 42 ± 0,5 C wit/grijze troebeling plaat positief 17

18 Alternatieve PVE Branchemethode PROBELIA PCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee Versie 14 november Onderwerp Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de PROBELIA test (Bio-Rad Laboratories) in dons, faeces (mest), vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV. 2. Definities Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd. Vervolgens vindt amplificatie plaats van een voor Salmonella specifieke en gepatenteerde DNAsequentie, het laga gen, met behulp van de PCR. Het vermenigvuldigde DNA wordt na hybridisatie op een microtiterplaatstrip aangetoond middels een colorimetrische reactie. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur. 4. Reagentia en andere materialen De PROBELIA Sa//no/7e//a test bestaat uit kant-en-klare reagentia, inclusief voorophopingmedium. Het te gebruiken gedestilleerde water moet van analysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water (BPw) Bio-Rad code (500 g) [bijlage 1.1] of Bio-Rad code (225 ml) PROBELIA Salmonella test Amplificatie kit Bio-Rad code [bijlage 1.2] Detectie kit Bio-Rad code [bijlage 1.2] De samenstelling en bereiding van media en kits is opgenomen in bijlage Apparatuur en verbruiksmaterialen De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de PROBELIA test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 18

19 5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 1 C 5.2 Micropipetten (5-50 en /Y!) 5.3 Microcentrifuge voor 1,5 ml centrifugebuisjes (max rpm) 5.4 Verhittingsblokken of waterbaden ingesteld op 56± 1 C en 100 ± 1 C 5.5 Bio-Rad icycler thermocycler voor PCR 5.6 Bio-Rad microtiterplaat shaker/incubator Model Stat-Fax 5.7 Bio-Rad microtiterplaat washer Model PW-40/ Bio-Rad microtiterplat reader Model 550 met 450 nm en 620 nm filters 5.9 Stomacherzak met filter 5.10 Steriele centrifuge buisjes 1,5 ml 5.11 Steriele micropipetpunten met filter 5.12 Steriele PCR-tubes 200 u\ 6. Specifieke eisen betreffende de laboratorium ruimtes PCR technologie is zeer gevoelig: amplificatie van een enkel molecuul genereert miljoenen identieke kopieën van de gewenste sequentie. Deze kopieën kunnen via aërosolen in de laboratorium ruimte circuleren. Om besmetting van nieuwe monsters met DNA sequenties vanuit amplificaties van voorgaande monsters te voorkómen, is het essentieel om de ruimtes waar de monster behandeling en het mixen van de reagentia plaatsvindt (pre-pcr ruimte) te scheiden van de ruimte waar de amplicon analyse plaatsvindt en de centrifugebuisjes worden geopend (post- PCR ruimte). Het gebruik van de PROBELIA PCR test vereist een minimum van 2 afgescheiden ruimtes. Elke ruimte is voorzien van eigen gebruiksmaterialen zoals pipetten, handschoenen, laboratorium jassen, etc., die niet mogen circuleren van de ene werkplek naar de andere. 7. Werkwijze Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage IX. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorbehandeling van het monster Verdun het monster 1:10 in BPw in een Stomacherzak met filter. Stomacher, en incubeer de BPw gedurende 18 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. Bij verwerking van borstvel (of nekvel) ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling. Amplificatie en detectie van DNA met PROBELIA Salmonella Na voorophoping wordt de inhoud van de Stomacherzak lichtjes gehomogeniseerd middels voorzichtig zwenken. Vervolgens wordt met een steriele pipet (bij voorkeur met filter) 1 ml homogenaat uit de Stomacherzak gepipetteerd in een 1,5 ml centrifuge buisje. Hierbij moeten geen vet, donsresten of andere vaste substanties worden meegepipetteerd. Overige stappen worden uitgevoerd conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIA Salmonella testkit (instructie van de fabrikant). Beoordeling Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIA Salmonella testkit (instructie van de fabrikant). Deze zijn gebaseerd op bepaling van de optische densiteit (OD) verkregen op de Salmonella detectiestrip <H1), vergeleken met de OD van hetzelfde monster op de detectiestrip van de interne controle (HO). 19

20 Zie ook onderstaande tabel: Salmonellae (H1) Interne controle (HO) Resultaat 1 OD > niet van belang positief 2 OD < OD > negatief 3 OD < OD < inhibitie In het geval van inhibitie van de amplificatiereactie (de OD's voor monster en corresponderende interne controle zijn lager dan de gestelde cut-off value van 0.070) dient een nieuwe test te worden uitgevoerd. Hiertoe wordt het supernatant van het betreffende monster, verkregen na isolatie van DNA, 1:10 verdund met steriel water (instructie van de fabrikant). Vervolgens wordt de PCR opnieuw ingezet. Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aanwezig. Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella afwezig. Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de PROBELIA Sa//T7one//a is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist. Echter in die gevallen waarin volgens de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 of de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelfde BPw-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en BGA uitgevoerd te worden, zie hiervoor de PVE branchemethode MSRV. In bijlage VIII is het werkvoorschrift voor serotypering van isolaten opgenomen. 8. Controle De PROBELIA Salmonella test kit bevat één positieve en twee negatieve controles. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen. Validatie van de test: De OD van de beide negatieve controles dient kleiner te zijn dan 0.050; deze waarde bevindt zich meestal tussen de en De OD van de positieve controle dient groter te zijn dan De test is alleen geldig indien de optische densiteit van de controles voldoet aan bovengenoemde condities. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen) - Blanco controle 9. Opgave van het resultaat Het resultaat wordt opgegeven als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal' als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage IX). 20

21 10. Bronvermelding Fach P., Dilasser F., Grout J., and Tache J., Evaluation of a polymerase chain reactionbased test for detecting Salmonella spp. in food samples: PROBELIA Salmonella spp. Journal of Food Protection, Vol. 62 (12): (1999). Hartman E.G. Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr , september Miras l., Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of laga and lagb genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 (1): (1995). PROBELIA Salmonella spp.: AFNOR certification, attest SDP-07/2-06/96. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector Van der Zee, H., et al. Vergelijking van de Salmonella bepaling met behulp van de conventionele branchemethode (MSRV) en een snelle alternatieve detectiemethode (PROBELIA PCR) in de pluimveesector. PVE, september

22 11. Bijlagen Bijlage 1: Samenstelling van voorophopingsmedium en PROBELIA testkits 1.1 Voorophopingsmedium: Gebufferd peption water (BPw) Samenstelling: Pepton NaCI N32HP04 KH2PO4 Water 10,0 g 5,0 g 3, 5 g 1,5g ml Bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting) Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 C Verdeel het medium over de daartoe geschikte flessen Steriliseer in een autoclaaf (15 min., 121 C) 1.2 PROBELIA Salmonella test Samenstelling amplificatie kit A1 Lysis reagens 1 fles 22 ml A2 Salmonella spp. amplificatie mix 2 buizen 2 x 2,5 ml A3 PCR Positieve controle 1 buis 0,25 ml A4 PCR Negatieve controle 1 buis 0,5 ml A5 Denaturatie reagens 1 fles 6 ml Samenstelling detectie kit: HO 96 wells plaat (12x8) gecoat met een probe 1 microtiterplaat specifiek voor de interne controle H1 96 wells plaat (12x8) gecoat met een probe 1 microtiterplaat specifiek voor Salmonella spp. H2 Hybridisatie buffer 1 fles 100 ml H3 Peroxidase-gelabelde probes specifiek voor 1 buis 100 ml Salmonella spp. en de interne controle H4 Was buffer (10x geconcentreerd) 1 fles 100 ml H5 Substraat buffer 1 fles 60 ml H6 Chromogeen: tetramethulbenzidine (TMB) 1 buis 1 ml H7 Stop oplossing (1,5 N zwavelzuur) 1 fles 28 ml Afdekfolie voor de microtiterplaat 20 stuks 22

23 Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons, afkomstig van pluimvee Versie 14 november Onderwerp Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de VIDAS SLM test (biomérieux) in dons afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV. 2. Definities Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe VIDAS SLM is een enzym immunoassay voor detectie van Salmonella antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat. De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 18 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 1 8 uur in een 3 e ophopingsmedium. Van dit laatste ophopingsmedium wordt een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar. 4. Reagentia en andere materialen Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water BPw bijvoorbeeld biomérieux ref of Branchemethode MSRV [bijlage 1 ] Selectief ophopingsmedium Rappaport-Vassiliadis bouillon seleniet cysteine bouillon M bouillon Selectieve agar briljant groen agar Bevestigingsmedia ureumagar triple-sugar-ironagar lysine-decarboxylase medium RV bijvoorbeeld biomérieux ref SC bijvoorbeeld biomérieux ref Mb bijvoorbeeld biomérieux ref BGA PVE Branchemethode MSRV UA PVE Branchemethode MSRV TSI PVE Branchemethode MSRV LDC PVE Branchemethode MSRV 23

24 Salmonella polyvalent agglutinatie serum PVE Branchemethode MSRV De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 van de PVE Branchemethode MSRV. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn. De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant. 5. Apparatuur en verbruiksmaterialen De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. * Broedstoof voor het bebroeden bij 37 C ± 1 C * Broedstoof voor het bebroeden bij 42 C ± 0,5 C * Micropipet (500//l) * Steriele micropipetpunten * Waterbad (100 C) of equivalent * Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm. * Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml. * Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm. * Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm. * Stomacherzakken (met filter) * VIDAS analyse apparaat 6. Werkwijze Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage IX. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorophoping Verdun het monster 1:10 in BPw (25 gram dons in 225 ml BPw). Stomacher, en incubeer de BPw 18 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. Selectieve ophoping Breng na incubatie van de BPw 1 ml van deze suspensie over in 10 ml SC bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 37 C ± 1 C. Breng tegelijkertijd ook 0,1 ml van deze BPw suspensie over in 10 ml RV bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 42 C ± 0,5 C Na-ophoping Breng na incubatie van de SC bouillon 1 ml hiervan over in 10 ml M bouillon. Breng na incubatie van de RV bouillon 1 ml hiervan over in een 2 e buis met 10 ml M bouillon. Herincubeer de SC bouillon en de RV bouillon voor nog eens 18 uur, om bevestiging achteraf mogelijk te maken. Incubeer de M bouillon buizen gedurende 18 uur bij 42 C ± 0,5 C. Meng de M bouillon buizen na incubatie en breng uit elke buis 1 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 15 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS SLM test uit volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Bewaar de overgebleven bouillons bij 2-8 C voor bevestiging. 24

25 Beoordeling Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar de zgn. Test Value. Resultaten met een Test Value onder de 0,23 betreffen monsters waarin Salmonella antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een test Value = 0,23 worden als Sa/mo/?e//a-positief gerapporteerd. Positieve resultaten moeten worden bevestigd met behulp van de bewaarde ophopings- en na-ophopingsmedia. Bevestiging van positieve resultaten Ent met een öse vanuit de ophopingsbouillons (RV en SC) vanuit de broedstoven en vanuit de M bouillons vanuit de koeling af op gedroogde BGA platen. Incubeer deze platen gedurende 24 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. Beoordeling BGA platen Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als 'vermoedelijk positief' aangemerkt. Bevestiging van deze specifieke kolonies, zowel biochemisch als serologisch, vindt vervolgens plaats zoals omschreven in de PVE Branchemethode MSRV. Voor donsmonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium (indien bij de pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage VIII is hiervoor het werkvoorschrift opgenomen. 7. Controle De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen) - Blanco controle 8. Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in dons', als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage IX). 25

26 9. Bronvermelding Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr , september ISO 6579:1 993(E). Microbiology. Genera! guidance on methods for the detection of Salmonella. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van de VIDAS SLM methode. PVE, september

27 PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante Campylobacter spp. in monsters pluimvee, pluimveeproducten en omgevingsmonsters 1 Onderwerp en toepassingsgebied Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in pluimvee, verse pluimveeproducten en omgevingsmonsters zoals mestmonsters en blindedarm mestmonsters. 2 Normatieve verwijzingen NEN-EN-ISO :1999, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1: Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen. NEN-EN-ISO :2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten. NEN-ISO 7218:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken. NVN-ENV-ISO :2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1: Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium 3 Termen en definities Campylobacter: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. 4 Beginsel Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mccda). Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5 C. Vervolgens wordt afgeënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mccda). Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5 C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies. Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle wordt een deel van de isolaten biochemisch en/of serologisch bevestigd. 27

28 5 Voedingsmedia en verdunningsvloeistoffen 5.1 Algemeen Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd. Gebruik voor de meting van de ph een ph-meter; referentietemperatuur 25 C. Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1 C en 5 C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven. Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. 5.2 Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed) Preston basismedium Samenstelling Vleesextractpoeder 3 10,0 g Pepton 3 10,0 g Natrium chloride 8 5,0 g Natrium pyruvaat" 0,25 g Natrium metabisulfiet b 0,25 g Ijzer (II) sulfaat" (FeS04.7H 2 0) 0,25 g Water 1000 ml OPMERKING a ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2 b ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FBP supplement) Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25 C. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1) C. 28

29 5.2.2 Preston antibiotica oplossing Samenstelling Polymyxine-B 5000 IU Rifampicine 0,01 g Trimethoprim lactaat 0,01 g Amphotericine-B 0,01 g Water 4 ml Bereiding OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het "vroeger" gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-b, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-b. Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 um filter) Compleet Preston ophopingsmedium Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium Basismedium 1000 ml Antibiotica oplossing 4 ml Bereiding compleet Preston ophopingsmedium Koel het basismedium af tot onder de 45 C. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. OPMERKING In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium (en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al., 2003). 5.3 Selectieve voedingsbodem: modified Charcoal Cef operazone Deoxycholate Agar (mccda) 29

30 5.3.1 mccda Basismedium Samenstelling Vleesextractpoeder 3 10,0 g Pepton 3 10,0 g Natrium chloride 3 5,0 g Bacteriologische charcoal 4,0 g Caseïne hydrolysaat 3,0 g Natrium deoxycholaat 1,0 g Ijzer (II) sulfaat (FeS04.7H 2 0) 0,25 g Natriumpyruvaat 0,25 g Agar 12,0 g Water 1000 ml OPMERKING 3 ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 bedraagt bij 25 C. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1) C mccda antibiotica supplement Samenstelling Cefoperazone 32 mg Amphotericine-B 10 mg Water 4 ml Bereiding OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mccda supplement. Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 urn filter) Complete mccda voedingsbodem Samenstelling Basismedium 1000 ml Antibiotica oplossing 4 ml Bereiding Koel het basismedium af tot ongeveer 45 C. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. Giet de agar uit in petrischalen met nok en laat stollen. 30

31 5.4 Bevestigingsmedia Oxidase reagens Samenstelling N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdihloride 0,1 gram Water 10 ml Bereiding Los het N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdihloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest. Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campylobacter Latexagglutinatietesten voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn commercieel verkrijgbaar. Enkele leveranciers staan vermeld in Bijlage A Triple Sugar/lron agar (TSI) Samenstelling Vleesextract 3,0 g Gistextract 3,0 g Pepton 20,0 g Natriumchloride 5,0 g Lactose 10,0 g Sucrose 10,0 g Glucose 1,0 g Ijzer (III) citraat 0,3 g Natriumthiosulfaat 0,3 g Fenolrood 0,024 g Agar 12,0 g Water 1000 ml Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is. Verdeel het medium over geschikte reageerbuizen, 10 ml medium per buis. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1) C. Laat de agar stollen, zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, nog een schuin gedeelte ontstaat. 31

32 6 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN- ISO 7218) en in het bijzonder de onderstaande: 6.1 Broedstoof voor het bebroeden bij (41,5 ± 1) C. 6.2 Suspendeertoestel, Stomacher 6.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van microaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen ('gas-zakjes'). 6.4 Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1000x. OPMERKING Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 7 Monstername Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE heeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd. Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4 ) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage IX. Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever. Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan. Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet. 8 Werkwijze 8.1 Algemeen In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Campylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft. 8.2 Direct uitplaten Monstervoorbehandeling Monsters waarin hoge aantallen Campylobacter worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op het isolatiemedium afgestreken. Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open te knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over te brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele swab of entoog). 32

33 8.2.2 Isolatie Beent vanuit het mengmonster met behulp van de swab of entoog een halve mccda-plaat. Beent de rest van de plaat middels verdunningsstrepen met behulp van een steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan. Incubeer mccda platen micro-aëroob gedurende 48 (± 4) uur bij 41,5 (± 1) C. 8.3 Ophoping Monstervoorbehandeling Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een Stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de Stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door óverschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje) Ophoping Incubeer de ophopingsbouillon (24 ± 2) uur bij (41,5 ± 1) C in micro-aëroob milieu. Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden Isolatie Ent met behulp van een entoog (10 u\) de Preston-cultuur na incubatie uit op een mccdaplaat. Incubeer mccda platen micro-aëroob gedurende (48 ± 4) uur bij (41,5 ± 1) C. 8.4 Beoordeling kolonies op mccda Beoordeel bebroede mccda-platen op de aanwezigheid van kolonies met de volgende morfologische eigenschappen: grijs, metalig, laag convex, amorf en de neiging om met de entstreep mee te groeien. Deze kolonies worden als 'verdacht positief' aangemerkt. 9 Bevestiging 9.1 Algemeen Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 verdachte kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 verdachte kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur, totdat een positief resultaat wordt verkregen. Ter bevestiging wordt een oxidase reactie uitgevoerd en worden de verdachte kolonies microscopisch beoordeeld. 9.2 Oxidase reactie Ent met een entoog (anders dan van nikkel/chroom) vanaf de mccda plaat een verdachte kolonie op een filtreerpapiertje bevochtigd met oxidasereagens. Lees na maximaal 10 seconden de reactie af. De reactie is positief bij paarskleuring en negatief indien er geen verkleuring optreedt. 33

34 9.3 Microscopie Maak van de verdachte kolonie een hangende-druppel-preparaat of nat-preparaat en beoordeel met een fasecontrast of donkerveld microscoop (100x objectief) op de karakteristieke kurketrekker-vormige morfologie en grote beweeglijkheid van Campylobacter. Bij kleuring volgens Gram tonen Campylobacter bacteriën zich als kurketrekker-vormig gebogen Gram-negatieve staafjes. De karakteristieke vorm is ook goed te zien bij kleuring met Oost-Indische inkt. Bij oude culturen (> 2 dagen op plaat) kan Campylobacter coccoïde en minder beweeglijke vormen aannemen. 9.4 Aanvullende bevestiging Bij twijfel of als extra controle op de juiste identificatie wordt aanbevolen om regelmatig een aanvullende bevestiging uit te voeren met een latexagglutinatietest of een TSl-buis, bijvoorbeeld met 1 op 50 bevestigde kolonies. Voer eerst een re i n strijk uit op bijvoorbeeld een bloedplaat of een mccda-basis agar plaat (zonder antibiotica supplement) Latexagglutinatietest Latexagglutinatietesten zijn bij diverse firma's commercieel verkrijgbaar (zie Bijlage A) en moeten volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant worden ingezet en afgelezen TSI buis Beent een TSI buis middels ladderen van het schuin gestolde deel en middels steek-enten in de agar. Incubeer deze buis (24 ± 2) uur bij (41,5 ± 1) C in micro-aëroob milieu. Beoordeel de reacties als weergegeven in tabel Interpretatie bevestigingsreacties Campylobacter bacteriën vertonen de karakteristieken zoals omschreven in tabel 1. Tabel 1 - Karakteristieken van Campylobacter Microscopie Oxidase TSI Test -Glucose (zuurvorming) -Glucose (gasvorming) -Lactose -Sucrose -H2S-vorming Latexagglutinatie Omschrijving Karakteristieke kurketrekkervormige morfologie en grote beweeglijkheid Paarsvorming rood/onveranderd geen zwartkleuring Negatief: gehele buis rood Positief: voet geel, schuine deel rood; Neg.: geen bellen/scheuren Pos.: belletjes en/of scheuren in agar Pos.: gehele buis geel Pos.: gehele buis geel Pos.: zwarte kleur in voet Volgens voorschrift fabrikant Campy/obacter-speclflek resultaat * Indien het een Campylobacter coli betreft kan de buis toch enige zwarting te zien geven (dit species is namelijk beperkt in staat tot H2S-vorming). 34

35 10 Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Campylobacter in het betreffende monstermateriaal' als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze). 11 Precisie Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden. 12 Verslag Vermeld in het verslag: de gevolgde methode; de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster; de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend; het resultaat volgens hoofdstuk 8; eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed. 13 Bronvermelding NEN-EN ISO : 1995 Microbiology of food and anima! feeding stuff s - Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technical corrigenda (ISO10272:1995/Cor.1:1996(E) and ISO 10272:1995/Cor:1 997(E). Jacobs-Reitsma, W.F. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands. Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation at the 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark. PVE Branchemethode (MSRV) voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee (inclusief 5 bijlagen), d.d Vb. Bo. nr

36 Bijlage A Beschikbare latex agglutinatie testen voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn onder andere: Dryspot Campylobacter Test, Oxoid DR 1 50M Oxoid Itd., Basingstoke Hampshire, England In NL via : Oxoid Pieter Goedkoopweg 38 Postbus 490, 2000 AL Haarlem Tel: Fax: INDX - Campy (jcl) 50 test kit Catalog # (voorheen Meritec -Campy (jcl), #203050, Meridian Diagnostics) Integrated Diagnostics, Inc. Baltimore, MD USA in NL via: Biotrading Postbus AG Mijdrecht Tel: Fax: Microscreen Campylobacter, M 46 Microgen Bioproducts Ltd. (voorheen Mercia Diagnostics) 1, Admiralty Way, Camberley, Surrey GU15 3DT, UK In NL via: Lucron bioproducts BV. Postbus AB Gennep Tel: Fax:

37 Bijlage B Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: - Blanco controle Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle buis wordt afgeënt op een mccda-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op de mccda-plaat. Indien een hoeveelheid (blindedarm)mest direct met behulp van een swab wordt geënt op een mccda-plaat, dan wordt een onbeënte mccda-plaat gebruikt als blanco controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op deze mccda-plaat. Positieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni. (bijvoorbeeld ATCC 29428). Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Prestonbuis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle buis wordt afgeënt op een mccda-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mccda-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken. Indien op het laboratorium monsters (blindedarm)mest worden ingezet, dan wordt een mccda-plaat aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mccda-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken. Tevens kan deze referentiestam gebruikt worden als positieve controle bij de uitvoering van de oxidase test, de microscopie en eventueel de agglutinatie test en/of TSI-buis. Voor de ingangscontrole van een batch dienen te worden meegenomen: Positieve controle zie boven Negatieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E coli (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze controlestam mag op een mccda-plaat geen 'verdachte' kolonies te zien geven. Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden. Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden. 37

38 Alternatieve PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van de VIDAS CAM test in pluimveeproducten Versie mei Onderwerp en toepassingsgebied Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in verse pluimveeproducten. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode. 2 Normatieve verwijzingen NEN-EN-ISO :1999, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1: Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen. NEN-EN-ISO :2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten. NEN-ISO 7218:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken. NVN-ENV-ISO :2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1: Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium 3 Termen en definities Campylobacter: Campylobacter spp., dat wil zeggen alle typen Campylobacter waarvan de specifieke antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. Door de selectieve ophoping te incuberen bij 41,5 ± 1 C wordt geselecteerd op alleen de thermotolerante Campylobacter species. Detectie van Campylobacter: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze microorganismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 4 Beginsel VIDAS CAM is een enzym immunoassay voor de detectie van Campylobacter antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en die geautomatiseerd wordt uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat. Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het 38

39 ophopingsmedium gedurende 48 uur bebroed bij 41,5 C. Vervolgens wordt de VIDAS CAM assay uitgevoerd. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 70 minuten beschikbaar. Verdere bevestiging van positieve uitslagen is niet noodzakelijk. 5 Voedingsmedia 5.1 Algemeen Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd. Gebruik voor de meting van de ph een ph-meter; referentietemperatuur 25 C. Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1 C en 5 C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven. Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. 5.2 Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed) Preston basismedium Samenstelling Vleesextractpoeder 3 10,0 g Pepton 8 10,0 g Natrium chloride 3 5,0 g Natrium pyruvaat 6 0,25 g Natrium metabisulfiet b 0,25 g Ijzer (II) sulfaat" (FeSO 4.7H 2 O) 0,25 g Water 1000 ml OPMERKING 3 ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2 b ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FBP supplement) Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25 C. Steriliseer gedurende,15 minuten bij (121 ± 1) C Preston antibiotica oplossing Samenstelling 39

40 Polymyxine-B 5000 IU Rifampicine 0,01 g Trimethoprim lactaat 0,01 g Amphotericine-B 0,01 g Water 4 ml Bereiding OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het "vroeger" gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-b, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-b. Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 um filter) Compleet Preston ophopingsmedium Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium Basismedium 1000 ml Antibiotica oplossing 4 ml Bereiding compleet Preston ophopingsmedium Koel het basismedium af tot onder de 45 C. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. OPMERKING In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium (en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al:, 2003). 6 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN-ISO 7218) en in het bijzonder de onderstaande: 6.1 Broedstoof voor het bebroeden bij (41,5 ± 1) C. 6.4 Suspendeertoestel, Stomacher 6.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van micro-aëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen ('gas-zakjes'), bijvoorbeeld: GenBox micro-aërofiel (10 zakjes, ref , biomérieux). 6.4 VIDAS of mini VIDAS analyser (biomérieux). 6.5 VIDAS CAM assay (30 testen, ref , biomérieux) 40

41 OPMERKING Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 7 Monstername Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE heeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd. Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4 C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage IX van het gewijzigde Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij (PVE, 2004-I). Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever. Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan. Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet. 8 Werkwijze 8.1 Monstervoorbehandeling Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een Stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de Stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door óverschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje). 8.2 Ophoping Incubeer de ophopingsbouillon (48 ± 2) uur bij (41,5 ± 1) C in micro-aëroob milieu. Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden. 8.3 Detectie OPMERKING In tegenstelling tot de branchemethode is de incubatietijd in dit voorschrift 48 uur. Meng het ophopingsmedium na incubatie en breng 2 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 15 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS CAM test uit volgens de gebruiksaanwijzing. Runtime VIDAS CAM test bedraagt ongeveer 70 minuten. OPMERKING Indien de VIDAS CAM test niet direct kan worden uitgevoerd is het mogelijk de ophoping (of een deel ervan) in te vriezen voor maximaal 48 41

42 uur. Na ontdooien moet de ophoping opgekookt worden en kan bovenstaande werkwijze worden gevolgd. 8.4 Beoordeling van VIDAS CAM resultaten Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar een zogenaamde Test Value (TV). Resultaten met een TV onder de 0,1 betreffen monsters waarin Campylobacter antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een TV = 0,1 worden als Campylobacter-posliiei gerapporteerd. 9 Bevestiging De in dit voorschrift beschreven VIDAS CAM methode is een detectie methode. Verdere confirmaties zijn niet nodig. 10 Controle De VIDAS CAM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen (bijlage): - Blanco controle - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen) 11 Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Campylobacter in het betreffende monstermateriaal' als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze). 12 Precisie Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden. 13 Verslag Vermeld in het verslag: de gevolgde methode; de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster; de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend; het resultaat volgens hoofdstuk 8; eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed. 42

43 14 Bronvermelding PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter. Bijlage VI van het Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 (2004-I) (Verordeningenblad Bedrijfsorganisaties). PVE Acceptatie criteria, Opmerkingen opdrachtgever bij aanleveren afwijkende monsters, Bijlage IX van het Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 (2004-I) (Verordeningenblad Bedrijfsorganisaties). Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, E. Samuëls and J. Wagenaar. Evaluation of the VIDAS Campylobacter Assay for detection of Campylobacter in fresh poultry products after various enrichment methods. Posterpresentation A-18 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark. International Journal of Medical Microbiology, Vol. 293 Suppl. 35, p. 6. Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, R. Achterberg, J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-21 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark, international Journal of Medical Microbiology, Vol. 293 Suppl. 35, p Samuëls, E.L.A.M. en W. Jacobs-Reitsma, Validatierapport van de Campylobacter bepaling in de matrix pluimveevlees met behulp van de VIDAS CAM methode. (Onderzoek in het kader van het PVE Plan van Aanpak/Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveesector), april Bijlagen 1. Eerstelijnscontrole van de methode 43

44 Bijlage 1: Eerstelijnscontrole van de methode Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: Blanco controle Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle wordt getest met de VIDAS CAM test en dient negatief te zijn Positieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni (bijvoorbeeld ATCC 29428). Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Preston-buis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle wordt getest met de VIDAS CAM test en dient positief te zijn Voor de ingangscontrole van een batch dienen te worden meegenomen: Positieve controle zie boven Negatieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E. coli (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze negatieve controlestam wordt getest met de VIDAS CAM test en dient negatief te zijn. Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden. Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden. 44

45 PPE 42 Besluit tot wijziging van het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 ( ) Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 9 september 2004 tot wijziging van het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op artikel 3 en 8 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1 999, Besluit: Artikel Het Besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 wordt gewijzigd als volgt: In artikel 2 wordt bijlage II vervangen door de bijlage bij dit besluit. A Artikel II Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie waarin het wordt geplaatst. Zoetermeer, 9 september 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. TOELICHTING BJJ HET BESLUIT TOT WIJZIGING VAN HET BESLUIT PROTOCOLLEN HYGIËNEVOORSCHRIFTEN PLUIMVEEVERWERKENDE INDUSTRIE 1999 ( ) Het besluit voorziet in de wijziging van de voorwaarden voor erkenning van laboratoria zoals deze zijn opgenomen in Bijlage VI. Met deze wijziging wordt een alternatieve branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp.opger\omer\. Deze methode betreft de VIDAS CAM in pluimveeproducten. Dit is een snelle detectiemethode voor het aantonen van Campylobacter in pluimveevleesproducten. De methode is gevalideerd ten opzichte van de branchemethode en akkoord bevonden door de Raad voor Accreditatie. Zoetermeer, 9 september 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. 45

46 Bijlage II: Analysemethoden voor het aantonen van Salmonella en Campylobacter in pluimvee(vlees) en eieren Voor het aantonen van Salmonella en/of Campylobacter in pluimvee(vlees) en eieren staat de pluimveesector een aantal analysemethoden ter beschikking, welke goedgekeurd zijn door de Raad voor Accreditatie. Het laboratorium kan deze analysemethoden toepassen voor de analyses in het kader van de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij 1999 en de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie Het laboratorium dient dan wel de betreffende analysemethode onder haar accreditatie van de Raad voor Accreditatie (ISO/IEC 17025) onder te brengen. De analysemethoden zijn: 1. PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. 2. Alternatieve PVE Branchemethode Probelia PCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. 3. Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons afkomstig van pluimvee. 4. PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante Campylobacter spp. in monsters pluimvee, pluimveeproducten en omgevingsmonsters. 5. PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van de VIDAS CAM test in pluimveeproducten. PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee 1. Onderwerp Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces (mest) en vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De Raad voor Accreditatie heeft de methode goedgekeurd voor de matrix mest, dons, vellen en eindproduct. 2. Definities Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmedium, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium. 46

47 4. Reagentia en andere materialen Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water BPw bijlage 1.1 Selectief ophopingsmedium modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium MSRV bijlage 1.2 Selectieve agar briljant groen agar BGA bijlage 1.3 Bevestigingsmedia ureumagar UA bijlage 1.4 triple-sugar-ironagar TSI bijlage 1.5 lysine-decarboxylase medium LDC bijlage 1.6 Salmonella polyvalent agglutinatie serum De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn. 47

48 5. Apparatuur en glaswerk Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast Broedstoof voor het bebroeden bij 37 C ± 1 C 5.2. Broedstoof voor het bebroeden bij 42 C ± 0,5 C 5.3. Waterbad ingesteld op 47 C ± 2 C 5.4. Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm Cultuurbuizen van 17/18 x 1 50 mm en van 8 x 160 mm. 6. Werkwijze De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorbehandeling van het monster Verdun het monster 1:10 in BPw. In de volgende tabel 1 is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoeveelheden en het volume BPw weergegeven: aantallen 2x25 swabs 3x20 swabs 2x 15 swabs 2 paar 6x 25 swabs 2x 30 swabs 30 swabs 25 gram 25 gram 25 gram 40 stukjes (hoeveelheid (circa)) (12,5 gram) (10 gram) (7,5 gram) (10 gram) (12,5 gram) (15 gram) (15 gram) (25 gram) (25 gram) (25 gram) (60 gram) BPw 112, , , ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml type monster swabs broederijen swabs stallen swabs overschoentjes swabs swabs blinde darmmest dons eindproduct vel van de borstkap inlegvellen Incubeer de potten BPw 18 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. De potten mogen tussentijds gedurende 2 dagen in de koelkast bewaard worden, deze 'koudestap' is mogelijk. Beënting en bebroeding Breng 0,1 ml BPw-cultuur op een MSRV plaat (bij 9 cm platen 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,1 ml in een driehoek. Incubeer de platen 1 x 24 ± 2 uur bij 42 C ± 0,5 C. De platen moeten met het deksel van de petrischaal naar boven geïncubeerd worden, aangezien het een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 1 x 24 ± 2 uur bij 42 C ± 0,5 C bebroed te worden. Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een wit/grijze kleur. Verdachte platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een öse Noot: standaard monsters in 225 ml BPw mag ook uitgevoerd worden. Het gaat er om dat er minimaal een 1:10 verdunning gemaakt worden. Een ruimere verdunning dan 1: 10 is toegestaan, een kleinere verdunning dan 1: 10 is niet toegestaan. 48

49 materiaal uit de agar te nemen en daarmee een gedroogde BGA plaat te beënten. Incubeer deze platen gedurende 24 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. Beoordeling Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als 'vermoedelijk positief' aangemerkt. Bevestiging Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de BGA plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuingestolde oppervlak en een steekenting tot op de bodem van de buis. Beent tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistof oppervlak af te strijken. De buizen worden 24 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C geïncubeerd. Opmerking.' Wanneer geen goed losliggende kolonies op de BGA plaat zijn verkregen of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende stoorflora is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde BGA- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van de Salmonella-kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan om eerst de bevestigingstest met de TSI uit te voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC. Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten: TSI agar onderin de buis - geel - zwart - bellen/scheuren - glucose positief (100%l - vorming van HzS (91,6%) - gasvorming van glucose (91,9%) schuine gedeelte - rood/onveranderd - lactose en/of sucrose negatief (resp. 99,2% en 99,5%) Ureum agar - geen kleuromslag van het medium - negatief (100%) LDC - paarse kleur en groei in medium - positief (94.6%) Het gebruik van biochemische kits (zoals API, Crystal) is ook toegestaan. Biochemisch verdachte kolonies dienen serologisch bevestigd te worden met een polyvalent serum. Dit werkvoorschrift is opgenomen in bijlage

50 De totale beoordeling van biochemische en serologische resultaten is als volgt: Biochemische reacties Auto-agglutinatietabel Agglutinatie met serum pos neg pos pos neg neg pos pos ~ Werkwijze / Resultaat Salmonella RIVM RIVM Indien een stam alleen biochemisch verdacht is, wordt deze opgestuurd naar het RIVM. Een andere mogelijkheid is het inzetten van een zogenaamde 'lange bonte rij' of een biochemische kit. Op het resultaat van het RIVM hoeft niet gewacht te worden, alvorens een uitslag wordt afgegeven. Voor de donsmonsters en faecesmonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella Enteritidis en Salmonella Typhimurium. (indien nog niet bij pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage IV is het werkvoorschrift opgenomen. 7. Controle Voor de eerstelijnscontrole 2 van de methode dienen te worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle - Blanco controle De eerstelijnscontroles met MSRV platen staan beschreven in bijlage Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal' (zie bijlage III) als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden om hoeveel gram het ongeveer gaat dat is onderzocht. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V). 9. Bronvermelding - NEN-EN Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - horizontale methode voor het aantonen van Salmonella (ISO 6579:1993, gewijzigd). - Zee, van der H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990, Salmonella isolatie met behulp van MSRV, De Ware (n) chemicus 20: Hartman, dr. E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, september Indien een ingangscontrole wordt toegepast per batch, kan de negatieve controle komen te vervallen. 50

51 Bijlage 1: Samenstelling en bereiding van media en reagentia 1.1 Gebufferd pepton water (BPw) samenstelling: pepton NaCI N32HP04.12H20 KH 2 P04 water 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1,5 g 1000 ml bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 C. Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen. Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 C). 1.2 Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium (MSRV) 3 oplossing A (basis): tryptose caseïne hydrolysaat NaCI KH2P04 MgCIa malachietgroen oxalaat agar gedestilleerd water 4,59 g 4,59 g 7,34 g 1,47 g 10,93 g 0,037 g 2,7 g 1000 ml bereiding Los de ingrediënten op in het water. Breng het mengsel onder voortdurend schudden aan de kook (NIET AUTOCLAVEREN). Stel de ph op 5,2 ± 0,2. Koel het mengsel af tot 50 C. oplossing B (novobiocine): Los 10 mg novobiocine op in 2 ml gedestilleerd/demi water. Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter 22 urn). bereiding MSRV medium: Voeg oplossing B toe aan 500 ml oplossing A. Meng de oplossing. Giet uit in petrischalen en verwijder de luchtbellen. Even aan de lucht drogen om een nat oppervlak te voorkomen. De MSRV-platen moeten volgens de voorschriften van de leverancier/fabrikant bewaard worden. 51

52 1.3 Briljant groen agar (BGA) oplossing A (basis): vleesextract 5,0 g pepton 10,0 g gistextract 3,0 g Na 2 HP04 1,0 g NaH2P04 0,6 g agar 12 g tot 18 g 1 water 900 ml 1 = afhankelijk van de sterkte van de gel bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig via verhitting). Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,0 ± 0,2 is. Schenk het medium in daarvoor geschikte buizen/flessen. Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 C). oplossing B (suiker/fenol rood oplossing): lactose 10,0 g sucrose 10,0 g fenolrood 0,09 g water tot een eindvolume van 100 ml bereiding: Los de componenten op in ± 50 ml water. Vul met water aan tot een eindvolume van 100 ml. Verhit gedurende 20 min. in een waterbad van 70 C. Koel af tot 47 C ± 1 C. Gebruik de oplossing direct. oplossing C (briljant groen oplossing): briljant groen ± 0,5 g water 100 ml bereiding: Voeg het briljant groen (concentratie tussen 4,5 mg/l en 6 mg/l) toe aan het water. Bewaar de oplossing tenminste 1 dag in het donker zodat auto-sterilisatie optreedt. bereiding complete medium: oplossing A oplossing B oplossing C 900 ml 100 ml 1 ml bereiding: Voeg, onder aseptische omstandigheden, oplossing C toe aan de (tot 47 C ± 1 C) afgekoelde oplossing B. Voeg deze oplossing toe aan oplossing A en meng het medium. bereiding van de agar platen: Giet het vers bereide medium in grote (± 40 ml) of in kleine petrischalen (±15 ml). Laat de platen stollen. Droog de platen voor gebruik. 52

53 1.4 Ureumagar (UA) oplossing A (basismedium): pepton 1,0 g glucose 1,0 g NaCI 5,0 g KH2P04 2,0 g fenolrood 12,0 mg agar 12,0 tot 18,0 g 1 gedestilleerd water 1000 ml 1 = afhankelijk van de sterkte van de gel bereiding: Los de ingrediënten op in het water. Stel de ph op 6,8 ± 0,2 bij 25 C en filtreer de oplossing. Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121 C in een autoclaaf. Laat de oplossing afkoelen tot 47 C. oplossing B (ureumoplossing): ureum 400 g gedestilleerd water 1000 ml bereiding: Los de ureum op in het water Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie en controleer de steriliteit. bereiding complete medium: oplossing A oplossing B 950 ml 50 ml bereiding: Voeg oplossing B (ureumoplossing) toe aan oplossing A (basismedium). Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 10 ml medium. Laat de buizen stollen zodat een schuin gedeelte ontstaat. 1.5 Triple-sugar-ironagar (TSI) samenstelling: vleesextract 3,0 g gistextract 3,0 g pepton 20,0 g NaCI 5,0 g lactose 10,0 g sucrose 10,0 g glucose 1,0 g ijzer (III) citraat 0,3 g natriumthiosulfaat 0,3 g fenolrood 0,024 g agar 12,0 tot 18,0 g 1 gedestilleerd water 1000 ml 1 = afhankelijk van de sterkte van de gel 53

54 bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is. Verdeel het medium over buizen, per buis 10 ml medium. Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 120 C in een autoclaaf. Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat. 1.6 Lysine-decarboxylase medium (LDC) samenstelling: 1 -lysine monohydrochloride 5,0 g gistextract 3,0 g glucose 1,0 g bromocresol purper 0,01 5 g water 1000 ml bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 is. Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 ml medium. Steriliseer in een autoclaaf (10 min. 121 C). 54

55 Bijlage 4: Eerstelijnscontrole met MSRV platen Onderwerp Deze bijlage beschrijft een methode voor de eerstelijnscontrole op de analyse van Salmonella met MSRV. Werkwijze Om de kwaliteit van de geproduceerde media te bewaken, dient iedere dag een controle volgens onderstaand schema te worden uitgevoerd. Positieve controle Inoculum: Kolonie aanstippen met entoogje en afstrijken langs de wand van een buisje met gebufferd peptonwater (BPW). Ca. 24 ± 2 uur bij 37 C incuberen in BPw (10 8 ) en verdunnen tot 10 3 of commercieel verkrijgbaar bij de IGB Groningen. Controlestam: S. enteritidis 100 ul op de plaat pipetteren incuberen 1 x 24 ± 2 uur 42 ± 0,5 C wit/grijze troebeling plaat positief 55

56 Alternatieve PVE Branchemethode PROBELIA PCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee Versie 14 november Onderwerp Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de PROBELIA test (Bio-Rad Laboratories) in dons, faeces (mest), vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV. 2. Definities Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd. Vervolgens vindt amplificatie plaats van een voor Salmonella specifieke en gepatenteerde DNAsequentie, het laga gen, met behulp van de PCR. Het vermenigvuldigde DNA wordt na hybridisatie op een microtiterplaatstrip aangetoond middels een colorimetrische reactie. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur. 4. Reagentia en andere materialen De PROBELIA Salmonella test bestaat uit kant-en-klare reagentia, inclusief voorophopingmedium. Het te gebruiken gedestilleerde water moet van analysekwaliteit Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water (BPw) Bio-Rad code (500 g) [bijlage 1.1] of Bio-Rad code (225 ml) PROBELIA Salmonella test Amplificatie kit Bio-Rad code [bijlage 1.2] Detectie kit Bio-Rad code [bijlage 1.2] De samenstelling en bereiding van media en kits is opgenomen in bijlage 1. zijn. 56

57 5. Apparatuur en verbruiksmaterialen De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de PROBELIA test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 5.1 Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 1 C 5.2 Micropipetten (5-50 en u\) 5.3 Microcentrifuge voor 1,5 ml centrifugebuisjes (max rpm) 5.4 Verhittingsblokken of waterbaden ingesteld op 56 ± 1 C en 100 ± 1 C 5.5 Bio-Rad icycler thermocycler voor PCR 5.6 Bio-Rad microtiterplaat shaker/incubator Model Stat-Fax 5.7 Bio-Rad microtiterplaat washer Model PW-40/ Bio-Rad microtiterplat reader Model 550 met 450 nm en 620 nm filters 5.9 Stomacherzak met filter 5.10 Steriele centrifuge buisjes 1,5 ml 5.11 Steriele micropipetpunten met filter 5.12 Steriele PCR-tubes 200 u\ 6. Specifieke eisen betreffende de laboratorium ruimtes PCR technologie is zeer gevoelig: amplificatie van een enkel molecuul genereert miljoenen identieke kopieën van de gewenste sequentie. Deze kopieën kunnen via aërosolen in de laboratorium ruimte circuleren. Om besmetting van nieuwe monsters met DNA sequenties vanuit amplificaties van voorgaande monsters te voorkómen, is het essentieel om de ruimtes waar de monster behandeling en het mixen van de reagentia plaatsvindt (pre-pcr ruimte) te scheiden van de ruimte waar de amplicon analyse plaatsvindt en de centrifugebuisjes worden geopend (post- PCR ruimte). Het gebruik van de PROBELIA PCR test vereist een minimum van 2 afgescheiden ruimtes. Elke ruimte is voorzien van eigen gebruiksmaterialen zoals pipetten, handschoenen, laboratorium jassen, etc., die niet mogen circuleren van de ene werkplek naar de andere. 7. Werkwijze Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorbehandeling van het monster Verdun het monster 1:10 in BPw in een Stomacherzak met filter. Stomacher, en incubeer de BPw gedurende 18± 2 uur bij 37 C ± 1 C. Bij verwerking van nekvel ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling. 57

58 Amplificatie en detectie van DNA met PROBELIA Salmonella Na voorophoping wordt de inhoud van de Stomacherzak lichtjes gehomogeniseerd middels voorzichtig zwenken. Vervolgens wordt met een steriele pipet (bij voorkeur met filter) 1 ml homogenaat uit de Stomacherzak gepipetteerd in een 1,5 ml centrifuge buisje. Hierbij moeten geen vet, donsresten of andere vaste substanties worden meegepipetteerd. Overige stappen worden uitgevoerd conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIA Salmonella testkit (instructie van de fabrikant). Beoordeling Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIA Salmonella testkit (instructie van de fabrikant). Deze zijn gebaseerd op bepaling van de optische densiteit (OD) verkregen op de Salmonella detectiestrip (H1), vergeleken met de OD van hetzelfde monster op de detectiestrip van de interne controle (HO). Zie ook onderstaande tabel: Salmonellae (H1) Interne controle (HO) Resultaat 1 OD > niet van belang positief 2 OD < OD > negatief 3 OD < OD < inhibitie In het geval van inhibitie van de amplificatiereactie (de OD's voor monster en corresponderende interne controle zijn lager dan de gestelde cut-off value van 0.070) dient een nieuwe test te worden uitgevoerd. Hiertoe wordt het supernatant van het betreffende monster, verkregen na isolatie van DNA, 1:10 verdund met steriel water (instructie van de fabrikant). Vervolgens wordt de PCR opnieuw ingezet. Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aanwezig. Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella afwezig. Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de PROBELIA Sa/mone//a is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist. Echter in die gevallen waarin volgens de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 of de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelfde BPw-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en BGA uitgevoerd te worden, zie hiervoor de PVE branchemethode MSRV. In bijlage IV is het werkvoorschrift voor serotypering van isolaten opgenomen. 8. Controle De PROBELIA Salmonella test kit bevat één positieve en twee negatieve controles. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen. Validatie van de test: De OD van de beide negatieve controles dient kleiner te zijn dan 0.050; deze waarde bevindt zich meestal tussen de en De OD van de positieve controle dient groter te zijn dan De test is alleen geldig indien de optische densiteit van de controles voldoet aan bovengenoemde condities. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen) - Blanco controle 58

59 9. Opgave van het resultaat Het resultaat wordt opgegeven als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal' als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V). 10. Bronvermelding Fach P., Dilasser F., Grout J., and Tache J., Evaluation of a polymerase chain reactionbased test for detecting Salmonella spp. in food samples: PROBELIA Salmonella spp. Journal of Food Protection, Vol. 62 (12): (1999). Hartman E.G. Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr , september Miras l., Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of laga and lagb genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy. Research in Microbiology, Vol. 146 (1): (1995). PROBELIA Salmonella spp.: AFNOR certification, attest SDP-07/2-06/96. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector 2000*. Van der Zee, H., et al. Vergelijking van de Salmonella bepaling met behulp van de conventionele branchemethode (MSRV) en een snelle alternatieve detectiemethode (PROBELIA PCR) in de pluimveesector. PVE, september

60 11. Bijlagen Bijlage 1: Samenstelling van voorophopingsmedium en PROBELIA testkits 1.1 Voorophopingsmedium: Gebufferd peption water (BPw) Samenstelling: Pepton NaCI N32HP04 KH 2 PO4 Water 10,0 g 5,0 g 3,5 g 1,5 g 1000 ml Bereiding: Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting) - Stel de ph, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 C Verdeel het medium over de daartoe geschikte flessen Steriliseer in een autoclaaf (15 min., 121 C) 1.2 PROBELIA Salmonella test Samenstelling amplificatie kit A1 Lysis reagens 1 fles 22 ml A2 Salmonella spp. amplificatie mix 2 buizen 2 x 2,5 ml A3 PCR Positieve controle 1 buis 0,25 ml A4 PCR Negatieve controle 1 buis 0,5 ml A5 Denaturatie reagens 1 fles 6 ml Samenstelling detectie kit: HO 96 wells plaat (12x8) gecoat met een probe 1 microtiterplaat specifiek voor de interne controle H1 96 wells plaat (12x8) gecoat met een probe 1 microtiterplaat specifiek voor Salmonella spp. H2 Hybridisatie buffer 1 fles 100 ml H3 Peroxidase-gelabelde probes specifiek voor 1 buis 100 ml Salmonella spp. en de interne controle H4 Was buffer (10x geconcentreerd) 1 fles 100 ml H5 Substraat buffer 1 fles 60 ml H6 Chromogeen: tetramethulbenzidine (TMB) 1 buis 1 ml H7 Stop oplossing (1,5 N zwavelzuur) 1 fles 28 ml Afdekfolie voor de microtiterplaat 20 stuks 60

61 Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons, afkomstig van pluimvee Versie 14 november Onderwerp Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de VIDAS SLM test (biomérieux) in dons afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV. 2. Definities Salmonella: Salmonella spp., d.w.z. alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 3. Principe VIDAS SLM is een enzym immunoassay voor detectie van Salmonella antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat. De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 18 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 18 uur in een 3 e ophopingsmedium. Van dit laatste ophopingsmedium wordt een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar. 4. Reagentia en andere materialen Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn. Niet-selectief voorophopingsmedium gebufferd pepton water BPw bijvoorbeeld biomérieux ref of Branchemethode MSRV [bijlage 1] Selectief ophopingsmedium Rappaport-Vassiliadis bouillon RV bijvoorbeeld biomérieux ref seleniet cysteine bouillon SC bijvoorbeeld biomérieux ref M bouillon Mb bijvoorbeeld biomérieux ref Selectieve agar briljant groen agar BGA PVE Branchemethode MSRV 61

62 Bevestigingsmedia ureumagar UA PVE Branchemethode MSRV triple-sugar-ironagar TSI PVE Branchemethode MSRV lysine-decarboxylase medium LDC PVE Branchemethode MSRV Salmonella polyvalent agglutinatie serum PVE Branchemethode MSRV De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 van de PVE Branchemethode MSRV. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn. De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant. 5. Apparatuur en verbruiksmaterialen De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld: Opmerking: Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. * Broedstoof voor het bebroeden bij 37 C ± 1 C * Broedstoof voor het bebroeden bij 42 C ± 0,5 C * Micropipet (500 u\) * Steriele micropipetpunten * Waterbad (100 C) of equivalent * Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm. * Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml. * Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm. * Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm. * Stomacherzakken (met filter) * VIDAS analyse apparaat 6. Werkwijze Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken. Voorophoping Verdun het monster 1:10 in BPw (25 gram dons in 225 ml BPw). Stomacher, en incubeer de BPw 18 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. Selectieve ophoping Breng na incubatie van de BPw 1 ml van deze suspensie over in 10 ml SC bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 37 C ± 1 C. Breng tegelijkertijd ook 0,1 ml van deze BPw suspentie over in 10 ml RV bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 42 C ± 0,5 C Na-ophoping Breng na incubatie van de SC bouillon 1 ml hiervan over in 10 ml M bouillon. Breng na incubatie van de RV bouillon 1 ml hiervan over in een 2 e buis met 10 ml M bouillon. Herincubeer de SC bouillon en de RV bouillon voor nog eens 18 uur, om bevestiging achteraf mogelijk te maken. 62

63 Incubeer de M bouillon buizen gedurende 18 uur bij 42 C ± 0,5 C. Meng de M bouillon buizen na incubatie en breng uit elke buis 1 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 1 5 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS SLM test uit volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Bewaar de overgebleven bouillons bij 2-8 C voor bevestiging. Beoordeling Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar de zgn. Test Value. Resultaten met een Test Value onder de 0,23 betreffen monsters waarin Salmonella antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een test Value = 0,23 worden als Sa/mo/7e//a-positief gerapporteerd. Positieve resultaten moeten worden bevestigd met behulp van de bewaarde ophopings- en na-ophopingsmedia. Bevestiging van positieve resultaten Ent met een öse vanuit de ophopingsbouillons (RV en SC) vanuit de broedstoven en vanuit de M bouillons vanuit de koeling af op gedroogde BGA platen. Incubeer deze platen gedurende 24 ± 2 uur bij 37 C ± 1 C. Beoordeling BGA platen Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als 'vermoedelijk positief' aangemerkt. Bevestiging van deze specifieke kolonies, zowel biochemisch als serologisch, vindt vervolgens plaats zoals omschreven in de PVE Branchemethode MSRV. Voor donsmonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium (indien bij de pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage IV is hiervoor het werkvoorschrift opgenomen. 7. Controle De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen) - Blanco controle 8. Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Salmonella in dons', als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V). 63

64 9. Bronvermelding Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr , september ISO 6579:1993(E). Microbiology. General guidance on methods for the detection of Salmonella. Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van de VIDAS SLM methode. PVE, september

65 PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante Campylobacter spp. in monsters pluimvee, pluimveeproducten en omgevingsmonsters 1 Onderwerp en toepassingsgebied Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in pluimvee, verse pluimveeproducten en omgevingsmonsters zoals mestmonsters en blindedarm mestmonsters. 2 Normatieve verwijzingen NEN-EN-ISO :1999, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1: Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen. NEN-EN-ISO :2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten. NEN-ISO 7218:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken. NVN-ENV-ISO :2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1: Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium 3 Termen en definities Campylobacter: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze. 4 Beginsel Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mccda). Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5 C. Vervolgens wordt afgeënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mccda). Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5 C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies. Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle wordt een deel van de isolaten biochemisch en/of serologisch bevestigd. 65

66 5 Voedingsmedia en verdunningsvloeistoffen 5.1 Algemeen Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd. Gebruik voor de meting van de ph een ph-meter; referentietemperatuur 25 C. Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1 C en 5 C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven. Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. 5.2 Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed) Preston basismedium Samenstelling Vleesextractpoeder 3 10,0 g Pepton 3 10,0 g Natrium chloride 3 5,0 g Natrium pyruvaat b 0,25 g Natrium metabisulfiet" 0,25 g Ijzer (II) sulfaat" (FeS04.7H2O) 0,25 g Water 1000 ml OPMERKING 3 ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2 b ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FBP supplement) Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25 C. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1) C. 66

67 5.2.2 Preston antibiotica oplossing Samenstelling Polymyxine-B 5000 IU Rifampicine 0,01 g Trimethoprim lactaat 0,01 g Amphotericine-B 0,01 g Water 4 ml Bereiding OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het "vroeger" gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-b, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-b. Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 fjm filter) Compleet Preston ophopingsmedium Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium Basismedium 1000 ml Antibiotica oplossing 4 ml Bereiding compleet Preston ophopingsmedium Koel het basismedium af tot onder de 45 C. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. OPMERKING In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium (en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al., 2003). 5.3 Selectieve voedingsbodem: modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar (mccda) mccda Basismedium Samenstelling Vleesextractpoeder 3 10,0 g Pepton 3 10,0 g Natrium chloride 3 5,0 g Bacteriologische charcoal 4,0 g Caseïne hydrolysaat 3,0 g Natrium deoxycholaat 1,0 g Ijzer (II) sulfaat (FeS04.7H2O) 0,25 g Natriumpyruvaat 0,25 g 67

68 Agar 12,0 g Water 1000 ml OPMERKING 3 ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 bedraagt bij 25 C. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1) C mccda antibiotica supplement Samenstelling Cefoperazone 32 mg Amphotericine-B 10 mg Water 4 ml Bereiding OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mccda supplement. Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 urn filter) Complete mccda voedingsbodem Samenstelling Basismedium 1000 ml Antibiotica oplossing 4 ml Bereiding Koel het basismedium af tot ongeveer 45 C. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. Giet de agar uit in petrischalen met nok en laat stollen. 68

69 5.4 Bevestigingsmedia Oxidase reagens Samenstelling N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdihloride 0,1 gram Water 10 ml Bereiding Los het N,N,N',N'-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdihloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest. Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campylobacter Llatexagglutinatietesten voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn commercieel verkrijgbaar. Enkele leveranciers staan vermeld in Bijlage A Triple Sugar/lron agar (TSI) Samenstelling Vleesextract 3,0 g Gistextract 3,0 g Pepton 20,0 g Natriumchloride 5,0 g Lactose 10,0 g Sucrose 10,0 g Glucose 1,0 g Uzer (III) citraat 0,3 g Natriumthiosulfaat 0,3 g Fenolrood 0,024 g Agar 12,0 g Water 1000 ml Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is. Verdeel het medium over geschikte reageerbuizen, 10 ml medium per buis. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1) C. Laat de agar stollen, zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, nog een schuin gedeelte ontstaat. 69

70 6 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN- ISO 7218) en in het bijzonder de onderstaande: 6.1 Broedstoof voor het bebroeden bij (41,5 ± 1) C. 6.2 Suspendeertoestel, Stomacher 6.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van microaëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen ('gas-zakjes'). 6.4 Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1000x. OPMERKING Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 7 Monstername Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE heeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd. Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4 ) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever. Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan. Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet. 8 Werkwijze 8.1 Algemeen In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Campylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft. 8.2 Direct uitplaten Monstervoorbehandeling Monsters waarin hoge aantallen Campylobacter worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op het isolatiemedium afgestreken. Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open te knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over te brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele swab of entoog) Isolatie Beent vanuit het mengmonster met behulp van de swab of entoog een halve mccda-plaat. Beent de rest van de plaat middels verdunningsstrepen met behulp van een steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan. Incubeer mccda platen micro-aëroob gedurende 48 (± 4) uur bij 41,5 (± 1) C. 70

71 8.3 Ophoping Monstervoorbehandeling Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een Stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de Stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door óverschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje) Ophoping Incubeer de ophopingsbouillon (24 ± 2) uur bij (41,5 ± 1) C in micro-aëroob milieu. Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden Isolatie Ent met behulp van een entoog (10 u\) de Preston-cultuur na incubatie uit op een mccdaplaat. Incubeer mccda platen micro-aëroob gedurende (48 ± 4) uur bij (41,5 ± 1) C. 8.4 Beoordeling kolonies op mccda Beoordeel bebroede mccda-platen op de aanwezigheid van kolonies met de volgende morfologische eigenschappen: grijs, metalig, laag convex, amorf en de neiging om met de entstreep mee te groeien. Deze kolonies worden als 'verdacht positief' aangemerkt. 9 Bevestiging 9.1 Algemeen Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 verdachte kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 verdachte kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur, totdat een positief resultaat wordt verkregen. Ter bevestiging wordt een oxidase reactie uitgevoerd en worden de verdachte kolonies microscopisch beoordeeld. 9.2 Oxidase reactie Ent met een entoog (anders dan van nikkel/chroom) vanaf de mccda plaat een verdachte kolonie op een filtreerpapiertje bevochtigd met oxidasereagens. Lees na maximaal 10 seconden de reactie af. De reactie is positief bij paarskleuring en negatief indien er geen verkleuring optreedt. 9.3 Microscopie Maak van de verdachte kolonie een hangende-druppel-preparaat of nat-preparaat en beoordeel met een fasecontrast of donkerveld microscoop (100x objectief) op de karakteristieke kurketrekker-vormige morfologie en grote beweeglijkheid van Campylobacter. Bij kleuring volgens Gram tonen Campylobacter bacteriën zich als kurketrekker-vormig gebogen Gram-negatieve staafjes. De karakteristieke vorm is ook goed te zien bij kleuring met Oost-Indische inkt. Bij oude culturen (> 2 dagen op plaat) kan Campylobacter coccoïde en minder beweeglijke vormen aannemen. 71

72 9.4 Aanvullende bevestiging Bij twijfel of als extra controle op de juiste identificatie wordt aanbevolen om regelmatig een aanvullende bevestiging uit te voeren met een latexagglutinatietest of een TSI-buis, bijvoorbeeld met 1 op 50 bevestigde kolonies. Voer eerst een reinstrijk uit op bijvoorbeeld een bloedplaat of een mccda-basis agar plaat (zonder antibiotica supplement) Latexagglutinatietest Latexagglutinatietesten zijn bij diverse firma's commercieel verkrijgbaar (zie Bijlage A) en moeten volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant worden ingezet en afgelezen TSI buis Beent een TSI buis middels ladderen van het schuin gestolde deel en middels steek-enten in de agar. Incubeer deze buis (24 ± 2) uur bij (41,5 ± 1) C in micro-aëroob milieu. Beoordeel de reacties als weergegeven in tabel Interpretatie bevestigingsreacties Campylobacter bacteriën vertonen de karakteristieken zoals omschreven in tabel 1. Tabel 1 - Karakteristieken van Campylobacter Microscopie Oxidase TSI Test -Glucose (zuurvorming) -Glucose (gasvorming) -Lactose -Sucrose -H2S-vorming Latexagglutinatie Omschrijving Karakteristieke kurketrekkervormige morfologie en grote beweeglijkheid Paarsvorming rood/onveranderd geen zwartkleuringnegatief: gehele buis rood Positief: voet geel, schuine deel rood; Neg.:geen bellen/scheuren Pos.: belletjes en/of scheuren in agar Positief: gehele buis geel Positief: gehele buis geel Positief: zwarte kleur in voet Volgens voorschrift fabrikant Campylobacter-speciiïek resultaat 'Indien het een Campylobacter coli betreft kan de buis toch enige zwarting te zien geven (dit species is namelijk beperkt in staat tot H2S-vorming). 72

73 10 Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Campylobacter in het betreffende monstermateriaal' als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze). 11 Precisie Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden. 12 Verslag Vermeld in het verslag: de gevolgde methode; de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster; de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend; het resultaat volgens hoofdstuk 8; eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed. 13 Bronvermelding NEN-EN ISO : 1995 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technical corrigenda (IS010272:1995/Cor.1:1996(E) and ISO 10272:1995/Cor:1997(E). Jacobs-Reitsma, W.F. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands. Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation at the 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark. PVE Branchemethode (MSRV) voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee (inclusief 5 bijlagen), d.d Vb. Bo. nr

74 Bijlage A Beschikbare latex agglutinatie testen voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn onder andere: Dryspot Campylobacter Test, Oxoid DR 150M Oxoid Itd., Basingstoke Hampshire, England In NL via : Oxoid Pieter Goedkoopweg 38 Postbus 490, 2000 AL Haarlem Tel: Fax: INDX - Campy (jcl) 1 " 50 test kit Catalog # (voorheen Meritec -Campy (jcl), #203050, Meridian Diagnostics) Integrated Diagnostics, Inc. Baltimore, MD USA in NL via: Biotrading Postbus AG Mijdrecht Tel: Fax: Microscreen Campylobacter, M46 Microgen Bioproducts Ltd. (voorheen Mercia Diagnostics) 1, Admiralty Way, Camberley, Surrey GU15 3DT, UK In NL via: Lucron bioproducts BV. Postbus AB Gennep Tel: Fax:

75 Bijlage B Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: : Blanco controle Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle buis wordt afgeënt op een mccda-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op de mccda-plaat. Indien een hoeveelheid (blindedarm)mest direct met behulp van een swab wordt geënt op een mccda-plaat, dan wordt een onbeënte mccda-plaat gebruikt als blanco controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op deze mccda-plaat. Positieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni. (bijvoorbeeld ATCC 29428). Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Prestonbuis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle buis wordt afgeënt op een mccda-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mccda-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken. Indien op het laboratorium monsters (blindedarm)mest worden ingezet, dan wordt een mccda-plaat aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mccda-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken. Tevens kan deze referentiestam gebruikt worden als positieve controle bij de uitvoering van de oxidase test, de microscopie en eventueel de agglutinatie test en/of TSI-buis. Voor de ingangscontrole van een batch dienen te worden meegenomen: Positieve controle zie boven Negatieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E. coli (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze controlestam mag op een mccda-plaat geen 'verdachte' kolonies te zien geven. Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden. Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden. 75

76 Alternatieve PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van de VIDAS CAM test in pluimveeproducten Versie mei Onderwerp en toepassingsgebied Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in verse pluimveeproducten. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode. 2 Normatieve verwijzingen NEN-EN-ISO :1999, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1: Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen. NEN-EN-ISO :2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten. NEN-ISO 7218:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken. NVN-ENV-ISO :2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1: Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium 3 Termen en definities Campylobacter: Campylobacter spp., dat wil zeggen alle typen Campylobacter waarvan de specifieke antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze. Door de selectieve ophoping te incuberen bij 41,5 ± 1 C wordt geselecteerd op alleen de thermotolerante Campylobacter species. Detectie van Campylobacter: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze microorganismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze. 4 Beginsel VIDAS CAM is een enzym immunoassay voor de detectie van Campylobacter antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en die geautomatiseerd wordt uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat. Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 48 uur bebroed bij 41,5 C. Vervolgens wordt de VIDAS 76

77 CAM assay uitgevoerd. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 70 minuten beschikbaar. Verdere bevestiging van positieve uitslagen is niet noodzakelijk. 5 Voedingsmedia 5.1 Algemeen Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn. Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten. Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd. Gebruik voor de meting van de ph een ph-meter; referentietemperatuur 25 C. Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1 C en 5 C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven. Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn. 5.2 Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed) Preston basismedium Samenstelling Vleesextractpoeder 3 10,0 g Pepton 3 10,0 g Natrium chloride 3 5,0 g Natrium pyruvaat" 0,25 g Natrium metabisulfiet" 0,25 g Ijzer (II) sulfaat" (FeSO4.7H 2 O) 0,25 g Water 1000 ml OPMERKING 3 ook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No.2 b ook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FBP supplement) Bereiding Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de ph zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25 C. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1) C Preston antibiotica oplossing Samenstelling 77

78 Polymyxine-B 5000 IU Rifampicine 0,01 g Trimethoprim lactaat 0,01 g Amphotericine-B 0,01 g Water 4 ml Bereiding OPMERKING Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het "vroeger" gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-b, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-b. Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 um filter) Compleet Preston ophopingsmedium Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium Basismedium 1000 ml Antibiotica oplossing 4 ml Bereiding compleet Preston ophopingsmedium Koel het basismedium af tot onder de 45 C. Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. OPMERKING In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium (en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al., 2003). 6 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN-ISO 7218) en in het bijzonder de onderstaande: 6.1 Broedstoof voor het bebroeden bij (41,5 ± 1) C. 6.4 Suspendeertoestel, Stomacher 6.3 Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van micro-aëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen ('gas-zakjes'), bijvoorbeeld: GenBox micro-aërofiel (10 zakjes, ref , biomérieux). 6.4 VIDAS of mini VIDAS analyser (biomérieux). 6.5 VIDAS CAM assay (30 testen, ref , biomérieux) OPMERKING Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast. 78

79 7 Monstername Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE heeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd. Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4 C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage IX van het gewijzigde Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij (PVE, 2004-I). Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever. Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan. Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet. 8 Werkwijze 8.1 Monstervoorbehandeling Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een Stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de Stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door óverschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje). 8.2 Ophoping Incubeer de ophopingsbouillon (48 ± 2) uur bij (41,5 ± 1) C in micro-aëroob milieu. Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden. 8.3 Detectie OPMERKING In tegenstelling tot de branchemethode is de incubatietijd in dit voorschrift 48 uur. Meng het ophopingsmedium na incubatie en breng 2 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 1 5 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS CAM test uit volgens de gebruiksaanwijzing. Runtime VIDAS CAM test bedraagt ongeveer 70 minuten. OPMERKING Indien de VIDAS CAM test niet direct kan worden uitgevoerd is het mogelijk de ophoping (of een deel ervan) in te vriezen voor maximaal 48 uur. Na ontdooien moet de ophoping opgekookt worden en kan bovenstaande werkwijze worden gevolgd. 79

80 8.4 Beoordeling van VIDAS CAM resultaten Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar een zogenaamde Test Value (TV). Resultaten met een TV onder de 0,1 betreffen monsters waarin Campylobacter antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een TV = 0,1 worden als Ca/npy/o6acte/--positief gerapporteerd. 9 Bevestiging De in dit voorschrift beschreven VIDAS CAM methode is een detectie methode. Verdere confirmaties zijn niet nodig. 10 Controle De VIDAS CAM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test. Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen [bijlage ]: - Blanco controle - Positieve controle - Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen) 11 Opgave van het resultaat Geef het resultaat op als 'aan- of afwezigheid van Campylobacter in het betreffende monstermateriaal' als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze). 12 Precisie Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden. 13 Verslag Vermeld in het verslag: de gevolgde methode; de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster; de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend; het resultaat volgens hoofdstuk 8; eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed. 80

81 14 Bronvermelding PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter. Bijlage VI van het Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 (2004-I) (Verordeningenblad Bedrijfsorganisaties). PVE Acceptatie criteria, Opmerkingen opdrachtgever bij aanleveren afwijkende monsters, Bijlage IX van het Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij (2004-I) (Verordeningenblad Bedrijfsorganisaties). Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, E. Samuëls and J. Wagenaar. Evaluation of the VIDAS Campylobacter Assay for detection of Campylobacter in fresh poultry products after various enrichment methods. Posterpresentation A-18 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark. International Journal of Medical Microbiology, Vol. 293 Suppl. 35, p. 6. Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, R. Achterberg, J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-21 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark, international Journal of Medical Microbiology, Vol. 293 Suppl. 35, p Samuëls, E.L.A.M. en W. Jacobs-Reitsma, Validatierapport van de Campylobacter bepaling in de matrix pluimveevlees met behulp van de VIDAS CAM methode. (Onderzoek in het kader van het PVE Plan van Aanpak/Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveesector), april Bijlagen 1. Eerstelijnscontrole van de methode 81

82 Bijlage 1: Eerstelijnscontrole van de methode Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen: Blanco controle Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle wordt getest met de VIDAS CAM test en dient negatief te zijn Positieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni (bijvoorbeeld ATCC 29428). Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Preston-buis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle wordt getest met de VIDAS CAM test en dient positief te zijn Voor de ingangscontrole van een batch dienen te worden meegenomen: Positieve controle zie boven Negatieve controle Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E. colt' (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze negatieve controlestam wordt getest met de VIDAS CAM test en dient negatief te zijn. Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden. Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden. 82

83 PPE 43 Besluit tot wijziging van het Hygiënebesluit fokbedrijven pluimveevleessector 2003 (2004-1) Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 10 juni 2004 tot wijziging van het Hygiënebesluit fokbedrijven pluimveevleessector 2003 Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op de artikelen 4, eerste lid, 5, eerste lid, 6 en 9 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999; Besluit: Artikel l Het Hygiënebesluit fokbedrijven pluimveevleessector 2003 wordt gewijzigd als volgt: Aan artikel 3 wordt een derde lid toegevoegd, luidende: A 3. De monsters, waarvan de wijze van monstername en analyse in bijlage l is omschreven, worden geanalyseerd op alle typen Salmonella. (Bij een besmetting moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat.) Bijlage l van het besluit wordt vervangen door de bijlage bij dit besluit. B Artikftl II Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie, waarin het wordt geplaatst. Zoetermeer, 10 juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. TOFI ICHTIMn RU HFT RFRI UIT TOT WI.I7iniNn VAN HFT HYfilFNFpFSI UIT Pflk-RFnm I\/PN PI UIMVFFVI EFSSFCrrOR 7003 <?no4-ll Ten behoeve van meer transparante regelgeving is de verplichting tot het nader serotyperen van alle met Salmonella besmette pluimveemonsters nu ook in artikel 3 van het hygiënebesluit opgenomen. Deze verplichting was reeds in het monstername- en analyseprotocol in bijlage l opgenomen. Daarnaast was tot nu toe in de regelgeving opgenomen dat de Gezondheidsdienst voor Dieren een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting mag melden aan het Productschap Pluimvee en Eieren. Deze bevoegdheid wordt uitgebreid naar alle erkende laboratoria. 83

84 Tot slot is in bijlage l van dit besluit opgenomen dat in het geval van een Salmonellabesmetting (niet zijnde S.e./S.t.) binnen zeven dagen na vaststelling van de besmetting een effectieve antibacteriële behandeling gestart moet worden. Dit om te voorkomen dat pluimveehouders te laat en onvolledig hun besmette koppel laten behandelen. Zoetermeer, 10 juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. Bijlage I: Onderzoeksprogramma opfokbedrijven waarvan het pluimvee bestemd is voor fokbedrijven A. Opfokbedrijven waarvan het pluimvee bestemd is voor fokbedrijven A 1 Mnnstfirnamft en analyse Monsters op opfokbedrijven waarvan het pluimvee bestemd is voor fokbedrijven dienen genomen en onderzocht te worden op alle types Salmonella volgens onderstaande tabel: Leeftyd Onderzoek eendagskuikens; en Inlegvellen indien de voorgaande uitslag van het dode kuikens, bij aankomst onderzoek op donsmonsters, meconiummonsters of op liggenblijvers (elitekoppel), Salmonella positief is: 4 weken cloacamest: analyse door de GD maximaal 21 daoen voor overplaatsing mest: analvse door de G D De eendagskuikens worden onderzocht door middel van het bemonsteren van inlegvellen. Deze monsters worden genomen onder verantwoordelijkheid van de ondernemer die het opfokbedrijf uitoefent volgens het protocol uit onderdeel C. De monsters worden geanalyseerd door een door de voorzitter van het productschap erkend laboratorium. Wanneer Salmonella aanwezig is, moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. Wanneer de donsmonsters, meconiummonsters of liggenblijvers van het betreffende koppel elitedieren (d.w.z. ouders van fokdieren) Salmonella positief blijken, dienen van de volgende uitkomst op het opfokbedrijf kuikens te worden bemonsterd die bij aankomst dood zijn (maximaal 60). Deze monsters worden genomen onder verantwoordelijkheid van de ondernemer die het opfokbedrijf uitoefent, volgens het protocol uit onderdeel D. De monsters dienen te worden geanalyseerd door een door de voorzitter van het productschap erkend laboratorium. Op een leeftijd van vier weken worden per stal 60 cloacamestmonsters genomen die tot twee monsters van ieder 30 worden gepoold. Op maximaal 21 dagen voor overplaatsing worden per stal 1 50 cloacamestmonsters genomen die gepoold worden tot 6 monsters van ieder 25 swabs. De ondernemer is zelf verantwoordelijk voor het tijdig laten nemen van monsters. Het nemen van de monsters wordt verder aangestuurd door de Gezondheidsdienst voor Dieren (hierna te noemen GD) en wordt uitgevoerd door het Controle Bureau Dierlijke Sector (hierna te noemen CBD) of een andere door het productschap aangewezen instantie/persoon of door een bevoegd dierenarts. Terzake moet(en) deze(n) een overeenkomst zijn aangegaan met de GD. 84

85 Alle monsters worden geanalyseerd door de GD op de aan- of afwezigheid van Salmonella. Wanneer Salmonella aanwezig is, moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. A 7 Artifl hij pnsitiavp hftvinriingpn Bij verdenking van Salmonella wordt verificatieonderzoek uitgevoerd door de GD. Het verificatieonderzoek vindt zo spoedig mogelijk na het vaststellen van de verdenking plaats. In principe is dat binnen 24 uur na het vaststellen van de verdenking. Het verificatieonderzoek bestaat uit het nemen van 300 mestmonsters die tot 12 monsters van ieder 25 worden gepoold. Indien de dieren verdacht worden van Salmonella paratyphi B var. java en daartegen geënt zijn, moeten 450 mestmonsters genomen worden die tot 18 monsters van ieder 25 worden gepoold. Bij een verdenking naar S.e. moeten 60 bloedmonsters worden genomen die gepoold worden tot 10 monsters van ieder 6 en 1 50 mestmonsters die gepoold worden tot 6 monsters van 25, tenzij de dieren tegen S.e. geënt zijn. Dan worden 300 mestmonsters genomen die gepoold worden tot 12 monsters van ieder 25. Bij besmetting met S.e., S.t. moet het betrokken koppel dieren door de ondernemer onverwijld worden geruimd. Indien een koppel besmet is met Salmonella moet een traceringsonderzoek uitgevoerd worden door een volgens de GVP-code erkende dierenarts, de GD of een andere deskundige. Het resultaat van dit onderzoek moet schriftelijk worden vastgelegd en inzicht kunnen geven in mogelijke oorzaken van de besmetting. Naast inzicht in mogelijke oorzaken van de besmetting moeten ook de ondernomen/te ondernemen acties worden vastgelegd. Getracht wordt om een volgende besmetting te voorkomen. Het tracerings-, monitorings- en bestrijdingsplan kan daarbij als handleiding worden gebruikt. Pluimvee dat vanwege een S.e., S.t. besmetting is geruimd mag niet worden vermarkt als vers pluimveevlees. Een met S.e., S.t. besmet en geruimd koppel mag worden afgezet naar kanalen waar het een behandeling ondergaat die voldoende effectief is om alle aanwezige Salmonella's af te doden. Een pluimveehouder kan er te allen tijde voor kiezen een geruimd koppel pluimvee te laten vernietigen. Indien een koppel pluimvee besmet is met een Salmonella niet zijnde S.e./S.t. (op basis van het mestonderzoek dan wel inlegvellen onderzoek) dan dient het koppel binnen zeven dagen na vaststelling van de besmetting met een daarop gerichte effectieve antibacteriële behandeling behandeld te worden. Om vast te stellen of het koppel weer vrij is neemt het CBD of een andere door het productschap aangewezen instantie/persoon 1 50 mestmonsters die gepoold worden tot 6 monsters van ieder 25, tenzij binnen 2 weken na de behandeling reeds een mestonderzoek volgens onder A1 genoemd onderzoeksprogramma wordt uitgevoerd. A 3 Dnnrgifts resultaten nnrlermftk Indien uit de analyse van de inlegvellen blijkt dat het koppel pluimvee verdacht wordt van een Salmonella, dan dient de ondernemer de GD hierover onmiddellijk te informeren, waarna het verificatieonderzoek uitgevoerd zal worden. De GD geeft de resultaten van het door haar uitgevoerde onderzoek binnen 1 maand door aan het productschap en geeft de uitslag van het verificatieonderzoek binnen 5 dagen na ontvangst van de monsters bij de GD. De monstername geschiedt binnen 24 uur na melding van de verdenking door de pluimveehouder bij de GD. Als uit de resultaten van het verificatieonderzoek blijkt dat het koppel pluimvee met S.e./S.t. of Salmonella paratyphi B var. Java is besmet dan geeft het erkende laboratorium de besmetting, waarbij een identificatienummer van de pluimveehouder is vermeld (KIPnummer), binnen 48 uur aan het productschap door. De melding moet gedaan worden vanaf de eerste constatering t/m de verificatiestap. De pluimveehouder is ervoor verantwoordelijk dat de uitslag wordt doorgegeven aan het productschap. Hij kan dit laten uitvoeren door het erkende laboratorium. 85

86 Als uit de resultaten van het verificatie-onderzoek blijkt dat het koppel pluimvee met S.e., S.t. is besmet dan stelt de voorzitter van het productschap de betreffende ondernemer op de hoogte van de geconstateerde besmetting. De uitslag van het onderzoek op Salmonella dat maximaal 21 dagen voor overplaatsing plaatsvindt, dient door de ondernemer schriftelijk te worden doorgegeven aan de volgende schakel. B. Fokbedrijven R 1 Mnngtfirnamfi Rn analysp Monsters op fokbedrijven dienen genomen en onderzocht te worden op alle types Salmonella volgens onderstaande tabel: J-eeftjjd Vanaf 24 weken om de twee weken onderzoek Mest De ondernemer kan kiezen uit drie verschillende monsternamemethoden. Ten eerste kunnen per stal 150 cloacaswabs genomen worden, die worden gepoold tot 6 monsters van ieder 25 swabs. De ondernemer kan er ook voor kiezen het onderzoek uit te voeren middels het nemen van twee paar overschoentjes of twee dragswabs, zie E. De monsters worden door een door het productschap erkend laboratorium onderzocht op de aanwezigheid van Salmonella. Eenmaal per vier weken moet de bemonstering over de overschoentjes of dragswabs door het CBD of een andere door het productschap aangewezen persoon/instantie of door een bevoegd dierenarts geschieden. Terzake moet(en) deze(n) een overeenkomst zijn aangegaan met de GD. Deze monsters worden geanalyseerd door de GD op de aan- of afwezigheid van Salmonella. Wanneer Salmonella aanwezig is, moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. R? Artif» hij pnsitjrvr havindingfin Bij een op grond van het mestonderzoek geconstateerde verdenking van Salmonella wordt verificatieonderzoek uitgevoerd door de GD. Het verificatieonderzoek vindt zo spoedig mogelijk na het vaststellen van de verdenking plaats. In principe is dat binnen 24 uur na het vaststellen van de verdenking. Het verificatieonderzoek bestaat uit het nemen van 300 mestmonsters die tot 12 monsters van ieder 25 worden gepoold. Indien de dieren verdacht worden van S. Java en daartegen geënt zijn moeten 450 mestmonsters genomen worden die tot 18 monsters van ieder 25 worden gepoold. Bij een verdenking van S.e. moeten 60 bloedmonsters worden genomen die gepoold worden tot 10 monsters van ieder 6 en 150 mestmonsters die gepoold worden tot 6 monsters van 25, tenzij de dieren tegen S.e. geënt zijn. Dan worden 300 mestmonsters genomen die gepoold worden tot 12 monsters van ieder 25. Bij besmetting met S.e., S.t. moet het betrokken koppel dieren onverwijld door de ondernemer worden geruimd en mogen geen broedeieren meer worden afgeleverd. Pluimvee dat vanwege een S.e., S.t. besmetting is geruimd mag niet worden vermarkt als vers pluimveevlees. Een met S.e., S.t. besmet en geruimd koppel mag worden afgezet naar kanalen waar het een behandeling ondergaat die voldoende effectief is om alle aanwezige Salmonella's af te doden. Een pluimveehouder kan er te allen tijde voor kiezen een geruimd koppel pluimvee te laten vernietigen. Reeds in de broederij ingelegde broedeieren geproduceerd door S.e., S.t. besmette fokdieren, dienen te worden behandeld als categorie- 2 risicomateriaal, conform EU-verordening 1774/2002. De nog niet ingelegde broedeieren, die zijn geproduceerd door het besmette koppel, mogen worden afgezet naar de eiproductenindustrie of moeten een andere effectieve behandeling ondergaan. Een pluimveehouder kan er te allen tijde voor kiezen de met S.e., S.t. besmette broedeieren te laten vernietigen. 86

87 Indien een koppel pluimvee besmet is met een Salmonella niet zijnde S.e./S.t. (op basis van het mestonderzoek) dan dient het koppel binnen zeven dagen na vaststelling van de besmetting met een daarop gerichte effectieve antibacteriële behandeling behandeld te worden. Om vast te stellen of het koppel weer vrij van Salmonella is. neemt het CBD of een andere door het productschap aangewezen instantie/persoon 1 50 mestmonsters die gepoold worden tot 6 monsters van ieder 25, tenzij binnen 2 weken na de behandeling reeds een mestonderzoek volgens onder BI genoemd onderzoeksprogramma wordt uitgevoerd. Indien een koppel besmet is met Salmonella moet een traceringsonderzoek uitgevoerd worden door een volgens de GVP-code erkende dierenarts, de GD of een andere deskundige. Het resultaat van dit onderzoek moet schriftelijk worden vastgelegd en inzicht kunnen geven in mogelijke oorzaken van de besmetting. Naast inzicht in mogelijke oorzaken van de besmetting moeten ook de ondernomen/te ondernemen acties worden vastgelegd. Getracht wordt om een volgende besmetting te voorkomen. Het tracerings-, monitorings- en bestrijdingsplan kan daarbij als handleiding worden gebruikt. R 3 Hrtnrgiftp resultaten nnrif»r7f>ek De GD of het door de voorzitter van het productschap erkende laboratorium geeft de resultaten van het door haar uitgevoerde onderzoek binnen 1 maand door aan het productschap en geeft de uitslag van het verificatieonderzoek binnen 5 dagen na ontvangst van de monsters bij de GD. De monstername geschiedt binnen 24 uur na melding van de verdenking door de pluimveehouder bij de GD. Als uit de resultaten van het verificatieonderzoek blijkt dat het koppel pluimvee met S.e./S.t. of Salmonella paratyphi B var. Java is besmet dan geeft het erkende laboratorium de besmetting, waarbij een identificatienummer van de pluimveehouder is vermeld (KIPnummer), binnen 48 uur aan het productschap door. De melding moet gedaan worden vanaf de eerste constatering t/m de verificatiestap. De pluimveehouder is ervoor verantwoordelijk dat de uitslag wordt doorgegeven aan het productschap. Hij kan dit laten uitvoeren door het erkende laboratorium. Als uit de resultaten van het verificatieonderzoek blijkt dat het koppel pluimvee met S.e., S.t. is besmet dan stelt de voorzitter van het productschap de betreffende ondernemer op de hoogte van de geconstateerde besmetting. De uitslagen van het onderzoek op Salmonella dienen door de ondernemer schriftelijk te worden doorgegeven aan de volgende schakel. C. Werkvoorschrift voor het nemen van monsters inlegvellen Doel Dit werkvoorschrift beschrijft de monstername van inlegvellen zoals voorgeschreven is in het kader van het onderzoek naar Salmonella van opfokgrootouderdieren bij aankomst. De monsters worden genomen op het opfokgrootouderbedrijf door of namens de eigenaar. Benodigdheden Steriele plastic zakken of potten. Etiketten. Steriele plastic handschoenen. Inzendformulier. 87

88 Werkwijze Aantal fin Innatifi tfi nemftn mnnstfirs Er dient bij elke levering een monster van 40 inlegvellen per vrachtauto en per aanhangwagen genomen te worden. Indien er minder dan 40 inlegvellen voorhanden zijn dienen 40 stukjes van de aanwezige inlegvellen genomen te worden. Indien er minder dan 10 inlegvellen aanwezig zijn dienen er minimaal 4 hele inlegvellen voor onderzoek ingestuurd te worden of wat er voorhanden is. De monsters moeten duidelijk met mest besmeurde (delen van) inlegvellen zijn en zoveel mogelijk (van) de inlegvellen uit de onderste kratten, containers dan wel dozen zijn. De monsters dienen evenredig verspreid over de geleverde kuikens verzameld te worden. llitvngring mnnstfirnamfi Scheur, indien er voldoende inlegvellen voorhanden zijn, met behulp van steriele plastic handschoenen een duidelijk zichtbaar besmeurd deel (ca. 5 bij 5 cm) van een inlegvel af. Indien er onvoldoende inlegvellen voorhanden zijn dient een heel inlegvel genomen te worden. Doe dit in een plastic pot of zak. Doe dit zo dat de monsters niet met iets anders in aanraking komen, om evt. besmetting van/vanuit de omgeving te voorkomen. Verzamel op deze wijze per vrachtauto en per aanhangwagen 1 pot met alle stukjes inlegvellen. Sluit iedere pot direct na het vullen zorgvuldig. Voorzie elke pot van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, KIP nummer en stalnummer(s). Inzendformulier Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KIP-nummer). Verzending monsters De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij een door de voorzitter van het productschap erkend laboratorium. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. D. Werkvoorschrift voor het nemen van dode kuikenmonsters Doel: Dit werkvoorschrift beschrijft de monstername van dode kuikens zoals is voorgeschreven in het kader van het onderzoek naar Salmonella bij opfokdieren bij aankomst op het opfokbedrijf. De monsters dienen te worden genomen wanneer de donsmonsters, meconiummonsters of liggenblijvers van het betreffende elitekoppel (d.w.z. ouders van fokdieren) Salmonella positief zijn. De monsters worden genomen op het opfokbedrijf door of namens de ondernemer. Benodigdheden Steriele plastic zakken of potten. Etiketten. Steriele plastic handschoenen. Inzendformulier. 88

89 Werkwijze Aantal p.n Inratip tp npmpn mnnatprs Alle dode kuikens dienen bij aankomst op het opfokbedrijf te worden bemonsterd (met een maximum van 60). Uitvoprinn mnngtprnamp Verzamel de dode kuikens met behulp van steriele plastic handschoenen. Doe dit in een plastic pot of zak. Doe dit zo dat de monsters niet met iets anders in aanraking komen, om eventuele besmetting van/vanuit de omgeving te voorkomen. Sluit iedere pot of plastic zak direct na het vullen zorgvuldig af. Voorzie elke pot of plastic zak van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, KIP-nummer, naam pluimveehouder en stalnummer(s). Inzendformulier Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KIP-nummer en naam pluimveehouder). Verzending monsters De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij een door de voorzitter van het productschap erkend laboratorium. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. Voorbewerking monstermateriaal dode kuikens. Op het laboratorium worden de dode kuikens opengeknipt met steriele schaar en pincet. Lever, dooierrest en darmpakket worden verwijderd. Na uitwendige desinfectie met alcohol worden de delen, dan wel de inhoud ervan in een 10-voudige hoeveelheid BPW gehomogeniseerd. De analyse geschiedt conform de Branchemethode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. Het is toegestaan een mengmonster te maken van de organen van meerdere kuikens, tot een maximum van 15, waarbij de 1:10 verdunning in acht wordt genomen. Indien er meerdere kuikens moeten worden onderzocht zullen er dus meerdere mengmonsters worden gemaakt. D. Werkvoorschrift voor het nemen van mestmonsters voor Salmonella Mnnstprnamp mpt nvprsrhnpntjrs Benodigdheden Werkwijze 2 paar overschoentjes (steriel). Steriele plastic zakken. Etiketten. Inzendformulier. Aantal snnrt pn Inratifi tp npmftn mftstmnnstftrs Er dient per stal tweemaal bemonsterd te worden met een apart paar overschoentjes. Het monster moet evenredig verspreid over de stal verzameld te worden. 89

90 llitvnpring mnngtprnamft Was voor de monstername altijd uw handen. Trek in de stal over het staleigen schoeisel een paar overschoentjes aan. Loop een volledige ronde door de stal. Doe de overschoentjes bij het verlaten van de stal in een steriele plastic zak. Per stal dienen twee paar overschoentjes te worden ingestuurd. De werkwijze moet dus worden herhaald. Sluit iedere zak direct na het vullen zorgvuldig. Voorzie de zak van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, stalnummer en KIP nummer. JnypnHfnrmi iliflr Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KIP-nummer). Verzending monsters De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij het erkende laboratorium. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. jyiopgtprngma mat riragswahs Benodigdheden Werkwijze 2 dragswabs (steriel). Steriele plastic zakken. Etiketten. Inzendformulier. Aantal^ snnrt en tnratip tf> npmpn mpstmnnstprs Er dient per stal tweemaal bemonsterd te worden met een aparte dragswab. Het monster moet evenredig verspreid over de stal verzameld te worden. Ilitvnering mnnstftrnamfi Was voor de monstername altijd uw handen. Sleep de dragswab door de stal. Loop een volledige ronde door de stal. Doe de dragswab bij het verlaten van de stal in een steriele plastic zak. Per stal dienen twee dragswabs te worden ingestuurd. De werkwijze moet dus worden herhaald. Sluit iedere zak direct na het vullen zorgvuldig. Voorzie de zak van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, stalnummer en KIP nummer. Ipypnrifnrmulipr Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KIP-nummer). Vfti"7ftnHing mnnstftrs De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij het erkende laboratorium. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. 90

91 PPE 44 Besluit tot wijziging van het Hygiënebesluit vermeerderingsbedrijven pluimveevleessector 2003 (2004-1) Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 10 juni 2004 tot wijziging van het Hygiënebesluit vermeerderingsbedrijven pluimveevleessector 2003 Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op de artikelen 4, eerste lid, 6 en 9 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999; Besluit: Artikel l Het Hygiënebesluit vermeerderingsbedrijven pluimveevleessector 2003 wordt gewijzigd als volgt: In artikel 2a komt het zinsdeel "bij twee koppels achtereen" te vervallen. Aan artikel 3 wordt een derde lid toegevoegd dat luidt: 3. De monsters, waarvan de wijze van monstername en analyse in de bijlage l is omschreven, moeten geanalyseerd worden op alle typen Salmonella. Bij een besmetting moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. A B Aan artikel 5 wordt een tweede lid toegevoegd dat luidt: 2. Zodra op het (opfok)-vermeerderingsbedrijf bij een koppel een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting is geconstateerd via het onderzoek dat conform bijlage l is uitgevoerd, moet de pluimveehouder iedere bezoeker hierover informeren zodra de afspraak voor het maken van een bezoek wordt gemaakt. De bezoeker zal na het betreffende bedrijf te hebben bezocht op die dag geen andere bedrijven meer bezoeken. Aan artikel 6 wordt een derde, een vierde, een vijfde en een zesde lid toegevoegd luidende: 3. Nadat op het (opfok-)vermeerderingsbedrijf bij een koppel een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting is geconstateerd via het onderzoek dat conform bijlage l is uitgevoerd, moet de stal worden gereinigd en ontsmet op de wijze zoals in bijlage III is omschreven. 4. Na de constatering van een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting, moet de stal tijdens de leegstandperiode door een erkende instantie worden onderzocht op de aanwezigheid van Salmonella spp. op de wijze zoals in bijlage IV is omschreven. Indien na de leegstandperiode de stal nog altijd besmet is met 91

92 Salmonella spp. moet de pluimveehouder in overleg met externe deskundigen de verdere aanpak bepalen. 5. Nadat op een (opfok-)vermeerderingsbedrijf in een stal een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting is geconstateerd dient het voersysteem gereinigd en ontsmet te worden en dient tijdens de volgende ronde gedurende twee weken aan het drinkwater voor de (opfok)-vermeerderingsdieren een middel met bacteriedodende werking te worden toegediend. Deze middelen zijn in de handel vrij verkrijgbaar. De wijze en de toe te dienen hoeveelheid geschiedt volgens de aanwijzingen van de fabrikant. 6. Nadat op basis van de onderzoeken, omschreven in bijlage l, geen Salmonella paratyphi B var. Java meer wordt aangetroffen, moeten enkele maatregelen gedurende de volgende ronde worden uitgevoerd. Na de volgende ronde dient door een erkende instantie het hygiëne-onderzoek te worden uitgevoerd en dient de stal door een erkende instantie te worden onderzocht op de aanwezigheid van Salmonella spp. Artikel II De bijlagen III en IV bij dit besluit worden toegevoegd. Artikel Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie, waarin het wordt geplaatst. Zoetermeer, l O juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. TOELICHTING BIJ BESLUIT TOT WIJZIGING VAN HET HYGIËNEBESLUIT VERMEERDERINGSBEDRIJVEN PLUIMVEEVLEESSECTOR 2003 (2004-1) In het afgelopen jaar heeft met name Salmonella paratyphi B var. Java (S. Java) zich gemanifesteerd in pluimvee. Begin 2003 was zo'n 50% van de met Salmonella besmette eindproducten besmet met S. Java. S. Java wordt voor de volksgezondheid een steeds groter probleem vanwege de groeiende resistentie tegen een aantal antibiotica. Met het oog hierop is reeds een meldplicht voor S. Java van kracht. Dit houdt in dat zodra bij een pluimveehouder of broederij een S. Java besmetting wordt geconstateerd dit binnen 48 uur gemeld moet worden bij het productschap. Zodra bijgaand wijzigingsbesluit van kracht is zal de pluimhouder die een S. Java besmetting heeft gemeld door het productschap geïnformeerd worden over de te nemen maatregelen. 92

93 Om S. Java op effectieve wijze te kunnen bestrijden is een plan opgesteld ter preventie en bestrijding van Salmonella paratyphi B var. Java. In dit wijzigingsbesluit is een aantal maatregelen opgenomen dat de pluimveehouder moet uitvoeren nadat S. Java op zijn bedrijf is geconstateerd. Nadat een (opfok)vermeerderingsbedrijf besmet is met S. Java (na verificatie) volgt de set van maatregelen, waarbij het uitvoeren van een intensief reinigingsen ontsmettingsprogramma volgens een in de bijlage bij dit besluit opgenomen protocol een essentieel onderdeel is, en het swabonderzoek in de stal om na te gaan of de stal nog besmet is met S. Java. Aanvullend op het reinigings- en ontsmettingsprogramma moet ook het voersysteem gereinigd worden en dient in de navolgende ronde het drinkwater voor het pluimvee behandeld te worden met een bacteriedodend middel. Tenslotte moet de pluimveehouder nadat de stal vrij is van S. Java en geen S. Java meer bij het zittende koppel wordt gevonden, nog gedurende de volgende ronde extra controles uitvoeren op de aanwezigheid van S. Java via het hygiëneonderzoek en swabonderzoek in de stal. Voorts is ten behoeve van meer transparante regelgeving de verplichting tot het nader serotyperen van alle met Salmonella besmette pluimveemonsters nu ook in artikel 3 van het hygiënebesluit opgenomen. Deze verplichting was reeds in het monstername- en analyseprotocol in bijlage l opgenomen. Tot slot is in bijlage l van dit besluit opgenomen dat in het geval van een Salmonella-besmetting (niet zijnde S.e./S.t.) binnen zeven dagen na vaststelling van de besmetting een effectieve antibacteriële behandeling gestart moet worden. Dit om te voorkomen dat pluimveehouders te laat en onvolledig hun besmette koppel laten behandelen. Zoetermeer, 10 juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. Bijlage I: Onderzoeksprogramma (opfok-)vermeerderingsbedrijven A. Opfokbedrijven waarvan het pluimvee bestemd is voor vermeerderingsbedrijven A.1. Monstername en analyse Monsters van opfokdieren dienen te worden geanalyseerd op alle types Salmonella en genomen volgens onderstaande tabel: Leeftijd Onderzoek eendagskuikens, en inlegvellen indien de voorgaande uitslag van het onderzoek op donsmonsters, meconiummonsters of op liggenblijvers (fokkoppel), Salmonella positief is: dode kuikens, bij aankomst 4 weken cloacamest: analyse door de GD maximaal 21 dagen voor overplaatsing mest: analyse door de GD 93

94 De eendagskuikens worden onderzocht door middel van het bemonsteren van inlegvellen. Deze monsters worden genomen onder verantwoordelijkheid van de ondernemer, die een opfokvermeerderingsbedrijf uitoefent, volgens het protocol uit onderdeel D. De monsters worden geanalyseerd door een door de voorzitter van het productschap erkend laboratorium. Wanneer Salmonella aanwezig is, moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. Wanneer de donsmonsters, meconiummonsters of liggenblijvers van het betreffende koppel fokdieren Salmonella positief bleken dienen van de volgende uitkomst op het opfokbedrijf kuikens te worden bemonsterd die bij aankomst dood zijn (maximaal 60). Deze monsters worden genomen onder verantwoordelijkheid van de ondernemer die het opfokvermeerderingsbedrijf uitoefent, volgens het protocol uit onderdeel E. De monsters dienen te worden geanalyseerd door een door de voorzitter van het productschap erkend laboratorium. Op een leeftijd van vier weken worden per stal 60 cloacamestmonsters genomen die tot twee monsters van ieder 30 worden gepoold. Maximaal 21 dagen voor overplaatsing worden per stal 150 cloacamestmonsters genomen die gepoold worden tot 6 monsters van ieder 25 swabs. De ondernemer is zelf verantwoordelijk voor het tijdig laten nemen van monsters. Het nemen van de monsters wordt verder aangestuurd door de Gezondheidsdienst voor Dieren (hierna te noemen GD) en wordt uitgevoerd door het Controle Bureau Dierlijke Sector (hierna te noemen CBD) of een andere door het PPE aangewezen instantie/persoon of door een bevoegd dierenarts. Terzake moet(en) deze(n) een overeenkomst zijn aangegaan met de GD. Alle monsters worden geanalyseerd door de GD op de aan- of afwezigheid van Salmonella. Wanneer Salmonella aanwezig is, moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. A.2. Actie bij positieve bevindingen Bij verdenking van Salmonella vindt verificatieonderzoek plaats door de GD. Het verificatieonderzoek vindt zo spoedig mogelijk na het vaststellen van de verdenking plaats. In principe is dat binnen 24 uur na het vaststellen van de verdenking. Het verificatie onderzoek bestaat uit het nemen van 60 bloedmonsters die tot 10 monsters van ieder 6 worden gepoold en uit het nemen van 150 mestmonsters die tot 6 monsters van ieder 25 worden gepoold. Bij besmetting met S.e., S.t. wordt het betrokken koppel opfokvermeerderingsdieren onverwijld door de ondernemer geruimd. Pluimvee dat vanwege een S.e., S.t. of besmetting is geruimd mag niet worden vermarkt als vers pluimveevlees. Een met S.e., S.t. of besmet en geruimd koppel mag worden afgezet naar kanalen waar het een behandeling ondergaat die voldoende effectief is om alle aanwezige Salmonella's af te doden. Een pluimveehouder kan er te allen tijde voor kiezen een geruimd koppel pluimvee te laten vernietigen. Indien een koppel pluimvee besmet is met een Salmonella niet zijnde S.e./S.t. (op basis van het mestonderzoek) dan dient het koppel binnen zeven dagen na vaststelling van de besmetting met een daarop gerichte effectieve antibacteriële behandeling behandeld te worden. Om vast te stellen of het koppel weer vrij is neemt het CBD of een andere door het PPE aangewezen instantie/persoon 1 50 mestmonsters die gepoold worden tot 6 monsters van ieder 25, tenzij binnen 2 weken na de behandeling reeds een mestonderzoek volgens onder A1 genoemd onderzoeksprogramma wordt uitgevoerd. 94

95 Indien een koppel besmet is met Salmonella moet een traceringsonderzoek uitgevoerd worden door een volgens de GVP-code erkende dierenarts, de Gezondheidsdienst voor Dieren of een andere deskundige. Het resultaat van dit onderzoek moet schriftelijk worden vastgelegd en inzicht kunnen geven in mogelijke oorzaken van de besmetting. Naast inzicht in mogelijke oorzaken van de besmetting moeten ook de ondernomen/te ondernemen acties worden vastgelegd. Getracht wordt om een volgende besmetting te voorkomen. Het tracerings-, monitorings- en bestrijdingsplan kan daarbij als handleiding worden gebruikt. A.3. Resultaten onderzoek Indien uit de analyse van de inlegvellen blijkt dat het koppel pluimvee verdacht wordt van een Salmonellabesmetting, dan dient de ondernemer de GD (S.e./S.t.) of het door de voorzitter van het productschap erkende laboratorium (overige Salmoneliae) hierover te informeren, waarna het verificatie-onderzoek uitgevoerd zal worden. De GD (S.e./S.t.) of het door de voorzitter van het productschap erkende laboratorium (overige Salmoneliae) geeft de resultaten van het door haar uitgevoerde onderzoek binnen één maand door aan het productschap en geeft de uitslag van het verificatie onderzoek binnen 5 dagen na ontvangst van de monsters bij de GD of het door de voorzitter van het productschap erkende laboratorium. De monstername geschiedt binnen 1 dag na melding van de verdenking door de pluimveehouder bij de GD of het door de voorzitter van het productschap erkende laboratorium. Als uit de resultaten van het verificatie-onderzoek blijkt dat het koppel pluimvee met S.e.,S.t. is besmet dan stelt de voorzitter van het productschap de betreffende ondernemer op de hoogte van de geconstateerde besmetting. De uitslag van het onderzoek op Salmonella dat plaatsvindt op maximaal 21 dagen voor aflevering dient door de ondernemer schriftelijk te worden doorgegeven aan de volgende schakel. B. Vermeerderingsbedrijven B.1. Monstername en analyse Vermeerderingsdieren dienen bemonsterd te worden op alle types Salmonella volgens tabel 1. Wanneer voldaan wordt aan de voorwaarden onder C, moeten de vermeerderingsdieren bemonsterd worden volgens tabel 1 of volgens tabel 2. N.B. De onderzoekschema's zijn verschillend voor koppels pluimvee die al dan niet geënt zijn tegen S.e. Tabel: Leeftijd Onderzoek in de 22-24ste week en daarna om de mestonderzoek: analyse door het twee weken erkende laboratorium Er dient volgens de in de tabel genoemde frequentie een mestonderzoek te worden uitgevoerd. Daarvoor worden per stal 150 monsters genomen die gepoold worden tot 6 monsters van ieder 25 swabs. De ondernemer kan er ook voor kiezen het onderzoek uit te voeren middels het nemen van twee paar overschoentjes of twee dragswabs zie D. De monsters worden door een door het productschap erkend laboratorium onderzocht op aanwezigheid van Salmonella. 95

96 Eenmaal per acht weken moet de bemonstering over de overschoentjes of (drag)swabs door het CBD of een andere door het PPE aangewezen persoon/instantie of door een bevoegd dierenarts te geschieden. Terzake moet(en) deze(n) een overeenkomst zijn aangegaan met de GD. Alle monsters worden geanalyseerd door het erkende laboratorium op de aan- of afwezigheid van Salmonella. Wanneer Salmonella aanwezig is, moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. Wanneer de vermeerderingsdieren zijn gehuisvest in kooien kan de monstername op de navolgende wijze plaatsvinden. Van minimaal 150 dieren moet een mestmonster worden verkregen. Dit kan worden verzameld via de mestband. De mest moet verzameld worden in twee potten. Verdere analyse vindt plaats conform bijlage D. B.2. Actie bij positieve bevindingen Bij verdenking van Salmonella vindt verificatieonderzoek plaats door de GD. Het verificatieonderzoek vindt zo spoedig mogelijk na het vaststellen van de verdenking plaats. In principe is dat binnen 24 uur na het vaststellen van de verdenking. Het verificatieonderzoek bestaat uit het nemen uit het nemen van 300 mestmonsters die tot 12 monsters van ieder 25 worden gepoold. Indien de dieren verdacht worden van S. java en daartegen geënt zijn, moeten 450 mestmonsters genomen worden die tot 18 monsters van ieder 25 worden gepoold. Bij een verdenking naar S.e. moeten 60 bloedmonsters worden genomen die gepoold worden tot 10 monsters van ieder 6 en 150 mestmonsters die gepoold worden tot 6 monsters van 25, tenzij de dieren tegen S.e. geënt zijn. Dan worden 300 mestmonsters genomen die gepoold worden tot 12 monsters van ieder 25. Bij besmetting met S.e., S.t. moet het betrokken koppel dieren onverwijld door de ondernemer worden geruimd en mogen geen broedeieren meer worden afgeleverd. Indien door middel van verificatieonderzoek geconstateerd is dat een koppel pluimvee met Salmonella is besmet en er wordt niet geruimd, dan dient het koppel binnen zeven dagen na vaststelling van de besmetting met een daarop gerichte effectieve antibacteriële behandeling behandeld te worden. Om vast te stellen of het koppel weer vrij is neemt het CBD of een andere door het PPE aangewezen instantie/persoon 1 50 mestmonsters die gepoold worden tot 6 monsters van ieder 25, tenzij binnen 2 weken na de behandeling reeds een mestonderzoek volgens onder B.1. genoemd onderzoeksprogramma wordt uitgevoerd. De pluimveehouder kan bij een salmonellabesmetting te allen tijde er voor kiezen het koppel te ruimen. Pluimvee dat vanwege een S.e. of S.t. besmetting is geruimd mag niet worden vermarkt als vers pluimveevlees. Een met S.e., S.t. besmet en geruimd koppel mag worden afgezet naar kanalen waar het een behandeling ondergaat die voldoende effectief is om alle aanwezige Salmonella's af te doden. Een pluimveehouder kan er te allen tijde voor kiezen een geruimd koppel pluimvee te laten vernietigen. Reeds in de broederij ingelegde broedeieren geproduceerd door S.e., S.t. besmette vermeerderingsdieren dienen te worden behandeld als categorie 2-materiaal conform Verordening (EG) nr. 1774/2002. De nog niet ingelegde broedeieren, die zijn geproduceerd door het besmette koppel, mogen worden afgezet naar de eiproductenindustrie of moeten een andere effectieve behandeling ondergaan. Een pluimveehouder kan er te allen tijde voor kiezen de met S.e., S.t. besmette broedeieren te laten vernietigen. 96

97 Indien een koppel besmet is met Salmonella moet een traceringsonderzoek uitgevoerd worden door een volgens de GVP-code erkende dierenarts, de Gezondheidsdienst voor Dieren of een andere deskundige. Het resultaat van dit onderzoek moet schriftelijk worden vastgelegd en inzicht kunnen geven in mogelijke oorzaken. Naast inzicht in mogelijke oorzaken van de besmetting moeten ook de ondernomen/te ondernemen acties worden vastgelegd. Getracht wordt om een volgende besmetting te voorkomen. Het tracerings-, monitorings- en bestrijdingsplan kan daarbij als handleiding worden gebruikt. B.3. Doorgifte resultaten onderzoek De GD (S.e./S.t.) of het door de voorzitter van het productschap erkende laboratorium (overige Salmoneliae) geeft de resultaten van het door haar uitgevoerde onderzoek binnen één maand door aan het productschap en geeft de uitslag van het verificatie onderzoek binnen 5 dagen na ontvangst van de monsters bij de GD of het door de voorzitter van het productschap erkende laboratorium. De monstername geschiedt binnen 1 dag na melding van de verdenking door de pluimveehouder bij de GD of het door de voorzitter van het productschap erkende laboratorium. Als uit de resultaten van het verificatieonderzoek blijkt dat het koppel pluimvee met S.e./S.t. of Salmonella paratyphi B var Java is besmet dan geeft het erkende laboratorium de besmetting, waarbij een identificatienummer van de pluimveehouder is vermeld (KIP-nummer), binnen 48 uur aan het productschap door. De melding moet gedaan worden vanaf de eerste constatering t/m de verificatiestap. De pluimveehouder is ervoor verantwoordelijk dat de uitslag wordt doorgegeven aan het productschap. Hij kan dit laten uitvoeren door het erkende laboratorium. Als uit de resultaten van het verificatieonderzoek blijkt dat het koppel pluimvee met S.e., S.t. is besmet dan stelt de voorzitter van het productschap de betreffende ondernemer op de hoogte van de geconstateerde besmetting. De uitslagen van het onderzoek op Salmonella dienen door de ondernemer schriftelijk te worden doorgegeven aan de volgende schakel. C. Werkvoorschrift voor het nemen van monsters inlegvellen Doel Dit werkvoorschrift beschrijft de monstername van inlegvellen zoals voorgeschreven is in het kader van het onderzoek naar Salmonella van opfokvermeerderingsdieren bij aankomst. De monsters worden genomen op het opfokvermeerderingsbedrijf door of namens de eigenaar. Benodigdheden Steriele goed afsluitbare plastic zakken of potten. Etiketten. Steriele plastic handschoenen. Inzendformulier. 97

98 Werkwijze Aantal en locatie te nemen monsters Er dient bij elke levering een monster van 40 inlegvellen per vrachtauto en per aanhangwagen genomen te worden. Indien er minder dan 40 inlegvellen voorhanden zijn dienen 40 stukjes van de aanwezige inlegvellen genomen te worden. Indien er minder dan 10 inlegvellen aanwezig zijn dienen er minimaal 4 hele inlegvellen voor onderzoek ingestuurd te worden of wat er voorhanden is. De monsters moeten duidelijk met mest besmeurde (delen van) inlegvellen zijn en zoveel mogelijk (van) de inlegvellen uit de onderste kratten, containers dan wel dozen zijn. De monsters dienen evenredig verspreid over de geleverde kuikens verzameld te worden. Uitvoering monstername Scheur, indien er voldoende inlegvellen voorhanden zijn, met behulp van steriele plastic handschoenen een duidelijk zichtbaar besmeurd deel (ca. 5 bij 5 cm) van een inlegvel af. Indien er onvoldoende inlegvellen voorhanden zijn dient een heel inlegvel genomen te worden. Doe dit in een plastic pot of zak. Doe dit zo dat de monsters niet met iets anders in aanraking komen, om evt. besmetting van/vanuit de omgeving te voorkomen. Verzamel op deze wijze per vrachtauto en per aanhangwagen 1 pot met alle stukjes inlegvellen. Sluit iedere pot direct na het vullen zorgvuldig. Voorzie elke pot van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, KIP nummer en stalnummer(s). Inzendformulier Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KIP-nummer). Verzending monsters De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij een door de voorzitter van het productschap erkend laboratorium. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. D. Werkvoorschrift voor het nemen van dode kuikenmonsters Doel Dit werkvoorschrift beschrijft de monstername van dode kuikens zoals is voorgeschreven in het kader van het onderzoek naar Salmonella bij vermeerderingsdieren bij aankomst op het opfokvermeerderingsbedrijf. De monsters dienen te worden genomen wanneer de donsmonsters, meconiummonsters of liggenblijvers van het betreffende fokkoppel Salmonella positief zijn. De monsters worden genomen op het opfokvermeerderingsbedrijf door of namens de eigenaar. 98

99 Benodigdheden Werkwijze Steriele plastic zakken of potten. Etiketten. Steriele plastic handschoenen. Inzendformulier. Aantal en locatie te nemen monsters Alle dode kuikens dienen bij aankomst op het opfokvermeerderingsbedrijf te worden bemonsterd (met een maximum van 60). Uitvoering monstername Verzamel de dode kuikens met behulp van steriele plastic handschoenen. Doe dit in een plastic pot of zak. Doe dit zo dat de monsters niet met iets anders in aanraking komen, om een eventuele besmetting van/vanuit de omgeving te voorkomen. Sluit iedere pot of plastic zak direct na het vullen zorgvuldig. Voorzie elke pot of plastic zak van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, KIP-nummer, naam pluimveehouder en stalnummer(s). Inzendformulier Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KIP-nummer, naam pluimveehouder). Verzending monsters De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij een door de voorzitter van het productschap erkend laboratorium. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. Voorbewerking monstermateriaal dode kuikens. Op het laboratorium worden de dode kuikens opengeknipt met steriele schaar en pincet. Lever, dooierrest en darmpakket worden verwijderd. Na uitwendige desinfectie met alcohol worden de delen, dan wel de inhoud ervan in een 10-voudige hoeveelheid BPW gehomogeniseerd. De analyse geschiedt conform de Branchemethode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. Het is toegestaan een mengmonster te maken van de organen van meerdere kuikens, tot een maximum van 15, waarbij de 1:10 verdunning in acht wordt genomen. Indien er meerdere kuikens moeten worden onderzocht zullen er dus meerdere mengmonsters worden gemaakt. 99

100 E. Werkvoorschrift voor het nemen van mestmonsters voor Salmonella Monstername met wattenstaafjes (swabs) Benodigdheden Werkwijze Wattenstaafjes/swabs (steriel). Steriele plastic potten zonder binnendeksel of plastic zakken. Etiketten. Inzendformulier. Aantal, soort en locatie te nemen mestmonsters Er dienen 1 50 monsters per stal genomen te worden met behulp van wattenstaafjes. Bij voorkeur moeten dit verse blindedarm-mestmonsters zijn (dat is bruine, glimmende mest). Indien deze niet of onvoldoende aanwezig zijn moet dit vervangen/aangevuld worden door cloacamonsters. De monsters dienen evenredig verspreid over de stal verzameld te worden. Op deze wijze kan een Salmonella besmetting bij tenminste 2% van de dieren met 95% zekerheid worden aangetoond. Uitvoering monstername Was voor de monstername altijd uw handen. Neem met behulp van een wattenstaafje het blindedarm-mestmonster (ca. 1 gram mest) of cloaca monster (daarbij dient het wattenstaafje duidelijk zichtbaar besmeurd te worden). Zet het wattenstaafje in een plastic pot (per pot 1 5 wattendragers bij elkaar). Breek het met de handen aangeraakte eind van het staafje af zonder het deel in de pot aan te raken. Verzamel op deze wijze 6 potten a 25 monsters. Wanneer gebruik wordt gemaakt van individueel in buisjes verpakte swabs, worden deze gewoon teruggeplaatst in de buisjes. Deze dienen in het laboratorium tot twee monsters worden verwerkt. Sluit iedere pot direct na het vullen zorgvuldig. Voorzie de pot van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, stalnummer en KIP nummer. Inzendformulier Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KlP-nummer). Verzending monsters De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij de Gezondheidsdienst voor Dieren. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. 100

101 Monstername met overschoentjes Benodigdheden Werkwijze 2 paar overschoentjes (steriel). Steriele plastic zakken. Etiketten. Inzendformulier. Aantal, soort en locatie te nemen mestmonsters Er dient per stal tweemaal bemonsterd te worden met een apart paar overschoentjes. Het monster moet evenredig verspreid over de stal verzameld te worden. Uitvoering monstername Was voor de monstername altijd uw handen. Trek in de stal over het staleigen schoeisel een paar overschoentjes aan. Loop een volledige ronde door de stal. Doe de overschoentjes bij het verlaten van de stal in een steriele plastic zak. Per stal dienen twee paar overschoentjes te worden ingestuurd. De werkwijze moet dus worden herhaald. Sluit iedere zak direct na het vullen zorgvuldig. Voorzie de zak van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, stalnummer en KIP nummer. Inzendformulier Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KIP-nummer). Verzending monsters De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij de Gezondheidsdienst voor Dieren. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. Monstername met draqswabs Benodigdheden Werkwijze 2 dragswabs (steriel). Steriele plastic zakken. Etiketten. Inzendformulier. Aantal, soort en locatie te nemen mestmonsters Er dient per stal tweemaal bemonsterd te worden met een aparte dragswab. Het monster moet evenredig verspreid over de stal verzameld te worden. 101

102 Uitvoering monstername Was voor de monstername altijd uw handen. Sleep de dragswab door de stal. Loop een volledige ronde door de stal. Doe de dragswab bij het verlaten van de stal in een steriele plastic zak. Per stal dienen twee dragswabs te worden ingestuurd. De werkwijze moet dus worden herhaald. Sluit iedere zak direct na het vullen zorgvuldig. Voorzie de zak van een etiket met de volgende gegevens: monsterdatum, stalnummer en KIP nummer. Inzendformulier Elke inzending moet vergezeld gaan van minimaal de volgende gegevens: de monsterdatum, het stalnummer en de afzender (KIP-nummer). Verzending monsters De monsters moeten binnen 48 uur aanwezig zijn bij de Gezondheidsdienst voor Dieren. De monsters moeten zo zijn verpakt dat onderweg geen lekkage kan optreden en zo zijn geadresseerd dat voor de transporteur en de ontvanger geen verwarring ontstaat. BIJLAGE III Protocol voor reinigen en ontsmetten van pluimveestallen en inventaris Woord vooraf In dit artikel wordt een protocol beschreven dat algemeen toepasbaar is en dient te worden ingevuld op basis van de specifieke bedrijfssituatie. Hiermee wordt onder meer bedoeld dat de te kiezen middelen en doseringen door de pluimveehouder zelf moeten worden ingevuld. Uiteraard is het raadzaam om deskundig advies in te winnen over de keuze van het materiaal, zodat de verschillende middelen goed op elkaar zijn afgestemd en niet contraproductief werken. Daarnaast hangt de werkwijze af van het type pluimvee en de daarbij horende staltypen. Inleiding Over reinigen en ontsmetten bestaan veel verschillende meningen bij mensen die in de pluimveehouderij werkzaam zijn. De meningen lopen uiteen van 'a//es moet steriel zijn als in een operatiekamer' tot 'alleen met water reinigen is genoeg'. De verordeningen van de Productschappen Pluimvee en Eieren schrijven echter bepaalde werkwijzen voor die kunnen bijdragen tot de vermindering van de Salmonella- en Campylobacterbesmettingen van het eindproduct: pluimveevlees of eieren. In de bestrijding van deze bacteriën speelt de reiniging en ontsmetting van stallen terecht, een belangrijke rol. Toch is dit niet de enige reden om goed te ontsmetten. Allerlei ongewenste ziektekiemen voor de dieren zelf dienen ook te worden gedood. Bij elke nieuwe koppel dient er met een schone lei te worden begonnen, waarbij ook de insleep vanuit de omgeving van de stallen moet worden voorkomen. Er bestaat geen algemeen geldende "beste" methode waarop een stal dient te worden gereinigd en ontsmet. Wel zijn er tal van specifieke zaken waarmee rekening moet worden gehouden en die in de loop van de jaren verwateren of worden vergeten. In dit artikel staan vele zaken die uiteraard bekend en voor de hand liggend zijn, maar er wordt getracht uw geheugen op te frissen en uzelf scherp te houden. 102

103 De werkzaamheden rondom het schoonmaken en ontsmetten van pluimveestallen komt in grote lijnen hierop neer:» Afvoer van losse inventaris uit de stal * Mest verwijderen» Droog reinigen van stal en vaste inventaris (bezemschoon) * Inweken onder toevoeging van inweekmiddel * Reinigen van "vaste" drinknippelsystemen «Schoonmaken stal en vaste inventaris» Droogtrekken vloer * (gedeeltelijk) Herinrichten * Nat ontsmetten * Droog na-ontsmetten Reinigen en ontsmetten zijn twee afzonderlijke handelingen. De aanwezigheid van organisch vuil, maar vooral van vet staat een goede ontsmetting in de weg. Organisch materiaal inactiveert ontsmettingsmiddelen en vet is een prima beschermer van micro-organismen. Alleen als er loog wordt gebruikt, weliswaar met in achtneming van voldoende inweektijd, zouden ze in één procesgang kunnen worden uitgevoerd. Algemeen geldt echter, als zowel een reinigings- als een desinfectiemiddel wordt gebruikt, moeten de beide middelen op elkaar zijn afgestemd. Deze informatie is te verkrijgen bij de leverancier van de middelen. Reinigen Voor een goede reiniging van de stal en directe omgeving is het van belang dat de werkzaamheden in de juiste volgorde worden uitgevoerd. Het water dat voor de reiniging wordt gebruikt dient minimaal geschikt te zijn als drinkwater voor vee, om te voorkomen dat er stoffen in zitten die de reiniging negatief beïnvloeden. Werkwijze reiniging stal: 1. Direct na het afleveren van de dieren beginnen met bestrijden van piepschuimkevers en larven door het spuiten van een bestrijdingsmiddel op de wand en op de kieren en naden tussen vloer en wand. Hiertoe moeten naden eerst worden vrijgemaakt van mest en strooisel. Ook de kieren tussen staanders en spanten moeten worden behandeld, kevers en larven verdwijnen niet alleen naar boven, maar ook naar beneden!! 2. Voerruimten, hygiënesluis en andere ruimten die met de stal in verbinding staan moeten worden ontruimd en goed schoongemaakt. 3. Voersysteem volledig leeg draaien, voerresten verwijderen en het voersysteem goed handmatig schoonmaken. De silo en opvoervijzel naar en van de weeginstallatie niet vergeten. Silo's moeten leeggedraaid worden en voerresten onder in de silo en weegapparatuur handmatig worden verwijderd. 4. Demonteerbare en niet ter plaatse te reinigen apparatuur uit de stal verwijderen en opslaan op een verharde ondergrond met een goede waterafvoer. 5. Mest verwijderen en direct afvoeren van het bedrijf. Bij opslag op het eigen bedrijf zo ver mogelijk van de stal en goed afdekken. 6. Uitneembare ventilatoren uit de kokers halen en opslaan op verharde ondergrond. Ventilatieopeningen droog schoonmaken. Bij lengteventilatie de ventilatoren en de kasten goed schoonmaken. Zorg hierbij voor een goede afvoer van vuil water. 103

104 7 - Luchtinlaatkleppen en kasten schoonborstelen zowel aan de binnen- als buitenkant. De moeilijke bereikbaarheid van buitenaf werkt hier vaak belemmerend. Het schoonmaken van de beschermkappen buiten is belangrijk in verband met naar binnen trekken van stof dat daar is opgehoopt. Bovendien zijn ze vaak van hout en afgeschermd met gaas en daardoor lastig schoon te maken. Perslucht kan hier een hulpmiddel zijn. 8. Apparatuur die niet met water is te reinigen schoonborstelen en schoonblazen met een luchtcompressor en daarna afdekken met plastic of op een stofvrije plaats opslaan. 9- Stal schoonvegen en zo nodig mestresten wegkrabben. 10. Drinkwatersysteem leeg laten lopen, doorspelen en volzetten met een specifiek reinigingsmiddel. Na voldoende inwerktijd spoelen. 11. Sterk bevuilde vloeren en vloeren van een slechte kwaliteit eerst gedurende minimaal 3 uur tot overnacht laten inweken met water waaraan een inweekmiddel is toegevoegd en daarna onder hoge druk schoonspuiten. Hierbij extra aandacht besteden aan de kieren en naden. Deze dienen goed te worden schoongespoten zodat later het desinfectiemiddel diep in de naden kan doordringen. Soms is het nodig de stal iets langer te laten afkoelen om de naden ver genoeg open te krijgen. 12. Plafond, ventilatorkokers en wanden in delen inschuimen met een reinigingsmiddel. Schuimmiddelen zijn te verkiezen boven vloeibare middelen want ze werken langduriger. Vervolgens 30 minuten later deze onderdelen afspuiten met water: - ventilatorkokers en plafond met een rondstraler; - wanden met een vlakstraler. Hierbij van boven naar beneden werken. 13. Vloer, voer- en drinkwatersysteem inschuimen met een reinigingsmiddel. Vervolgens 30 minuten later afspuiten met water. Er op letten dat niet het vuil van de vloer weer op de wanden wordt gespoten door (te) hoge druk. Zorg voor een voldoende afvoer van water. 14. Kachels dienen van binnen en van buiten te worden gereinigd. Als de stal wordt drooggestookt, droogt de vuillaag aan de binnenkant uit, laat los en wordt in de schone stal geblazen Leidingen en buizen die in een stal lopen worden vaak vergeten, vooral die zich hoog in de stal bevinden. Hetzelfde geldt voor lampen en TL armaturen die soms schuin zijn gemonteerd zodat er een laag stof op ligt. 16. Stalvloer droogtrekken. 17. Alle in relatie tot de stal staande lokalen en gebouwen droog schoonmaken en daarna nat met een reinigingsmiddel. Ook de ruimte waar kadavers worden bewaard moet goed worden gereinigd. 18. Inspecteer de stalruimte en apparatuur op achtergebleven visuele verontreinigingen. 19. Opgeslagen inventaris reinigen met een reinigingsmiddel, daarna afspoelen met water. 20. Gedemonteerde ventilatoren reinigen met een compressor of een aangepaste borstel. 21. Stal inrichten maar geen inventaris op de Stalvloer plaatsen. Ventilatoren plaatsen en nadat de stal is opgedroogd, kokers afsluiten. 22. Stal zo goed mogelijk afsluiten. Zorg echter voor goede bereikbaarheid van de te behandelen oppervlakken, bijvoorbeeld de luchtinlaatkleppen. 23. Kleding wassen. Schoeisel of laarzen schoonmaken. Reinigen en ontsmetten drinkwatersysteem: Probeer allereerst vast te stellen wat de aard is van de inwendige vervuiling van het systeem. Dit kan gedaan worden door het systeem op enkele plaatsen te ontkoppelen. 104

105 Ruwweg kan dit bestaan uit organisch vuil (bacteriën, algen en schimmels) of anorganisch (kalksteen). Organische aanslag kan worden verwijderd met een alkalisch reinigingsmiddel of waterstofperoxide; anorganische aanslag moet worden bestreden met een zuur reinigingsmiddel (pas op voor corrosie). Tijdens de reiniging dient de stal c.q. de watertemperatuur minimaal 10 C te bedragen. Werkwijze reiniging drinkwatersysteem Nippel- en cupsystemen en centrale leidingen: Systeem voorspoelen met hoge druk. Via doseerapparaat of voorraadvat slangen en systeem vullen met een oplossing van het reinigingsmiddel. Elk tappunt controleren of de vloeistof is doorgedrongen (ruiken of ph papiertjes). Gedurende minimaal 24 uur in laten werken. Systeem leeg laten lopen en goed spoelen met schoon water. Drinktorens en losse cups: Onderdompelen in de reinigingsvloeistof (kalkoplossend) en 2 tot 6 uur in laten werken. Daarna onder druk afspuiten met een koude waterstraal. Bij ernstige vervuiling met een harde borstel reinigen. Daarna de nippelleidingen volzetten met een ontsmettingsmiddel, de benodigde tijd laten staan en met schoon drinkwater naspoelen. Controleer hierbij desgewenst of alle ontsmettingsmiddel weg is. De drinktorens dompelen of afsproeien met een ontsmettingsmiddel, waarna ze worden nagespoeld met schoon drinkwater. Ontsmetten Ontsmetting kan gedaan worden met verschillende ontsmettingsmiddelen, die elk één of meerdere werkzame stoffen bevatten. Om een goede werkzaamheid tegen Salmonella paratyphi B var. Java te verkrijgen wordt ontsmetting met formalinehoudende middelen geadviseerd. Voor de meeste middelen geldt dat de stal zeer goed gereinigd moet zijn, omdat de werkzame stof door vuilresten onwerkzaam wordt gemaakt. Ontsmetting kan uitgevoerd worden met de aanwezige reinigingsapparatuur. Er moet echter geen hoge druk gebruikt worden. De beste resultaten worden behaald door een combinatie van een ontsmetting van de vloer, de opgaande wand en de inlaatkleppen met de hogedrukreiniger gevolgd door een ruimteontsmetting met een hoge druk vernevelaar. Werkwijze ontsmetting: 1. Breng de stal tijdig van tevoren op de gewenste temperatuur. Wanneer deze niet bereikt kan worden, kies dan een ander ontsmettingsmiddel dat wel bij de behaalde temperatuur past of laat het middel langer inwerken. 2. Neem maatregelen om insleep tijdens en na de ontsmetting te voorkómen. Deuren in verband met de eigen veiligheid nog niet op slot. 3. Neem de beschermende maatregelen, zoals die op het etiket van het desinfectiemiddel vermeld zijn. Gasmasker met goede filterbus, handschoenen en goed sluitend regenpak. Werk, vanwege de veiligheid, altijd met 2 personen. Neem geen enkel risico!! 4. Maak een voorraad van het ontsmettingsmiddel klaar in de juiste voorgeschreven concentratie. Zuig met de hogedrukreiniger vanuit dit bassin de vloeistof aan. 5. Spuit onder lage druk het desinfectiemiddel over de vloer, de opgaande wand en de openstaande inlaatkleppen of -ventielen. Werk altijd in de richting van de grote deuren. 6. Sluit daarna alle ventilatie inlaatopeningen. 7. Plaats alle inventaris en gereedschappen in de stal. 105

106 8. Maak de oplossing aan voor de ruimteontsmetting. 9. Vernevel de desinfectievloeistof in de stal. De hogedruk vernevelaar laten vernevelen via aparte openingen in de zijmuur of in de deuren. Indien de vernevelaar in de stal geplaatst moet worden voorkom dan het aanzuigen van de nevel, door het apparaat op tijd terug te trekken. De laatste hoeveelheid vloeistof via een openstaande deur naar binnen blazen. 10. Ook alle in relatie tot de stal staande lokalen en gebouwen ontsmetten, bij voorkeur met behulp van de hogedruk vernevelaar. 11. Doe alle deuren op slot en laat formaline minimaal 24 uur inwerken, de overige middelen dienen een minimale inwerkingstijd van 8 uur te hebben. 12. Ventileer de restdamp na de inwerkingstijd uit de stal, de stal tevens opwarmen tot 15 C. Eerst de ventilatiekokers openen daarna de inlaatopeningen. Eventuele restdampen van formaldehyde kunnen geneutraliseerd worden door het versproeien van een 25% ammoniumverbinding (ammoniakwater). Dus niet de stal opengooien, zodat alles en iedereen erin kan. 13. Het inwendige van het voersysteem in de stal is niet bereikbaar voor schoonmaken of ontsmetten. Indien er aanleiding voor is, dient het voersysteem in de stal vooral de vijzels, zo nodig te worden ontmanteld of vol gezet met een ontsmettingsmiddel dat is gemengd in een hoeveelheid voer. Bijvoorbeeld 5% formaline of een organisch zuur in wat restvoer gedurende tenminste 24 uur in het systeem laten staan. Het is raadzaam om de silo zelf en de weeginstallatie plus aanvoervijzels buiten de stal van tijd tot tijd ook op een dergelijke manier te behandelen. 14. Resten opgedroogd ontsmettingsmiddel, met name formaline, met water verwijderen. Erfverharding, in het bijzonder de laadplaats van de kuikens en de uitblaasruimte bij lengteventilatiestallen, desinfecteren met de hogedrukreiniger met een oplossing van natronloog of chloor (bijvoorbeeld Halamid (3%)). BIJLAGE IV Protocol voor het nemen van swabmonsters in stallen waar bij het koppel een Salmonella paratyphi B var. Java is geconstateerd. Het doel van de monstername is Salmonella paratyphi B var. Java te vinden, het is derhalve van belang om gericht te zoeken naar zichtbaar vuile oppervlakken. Deze worden bemonsterd, aangezien het niet zinvol is om schone oppervlakken te swabben. Soms is het zinvol om meer swabs te nemen van andere dan de hier genoemde plaatsen; hierbij geldt steeds weer dat er gericht gezocht dient te worden. Dergelijke plaatsen kunnen in de directe omgeving van de stallen liggen, bijvoorbeeld de voerdistributie/ weegplaats. Het is uiteraard van belang om een visuele beoordeling van de stallen en inventaris uit te voeren. Hierbij moet ook de aanwezigheid van ongedierte, zoals kevers en larven worden meegenomen. Bij het nemen van swabmonsters in de stallen die met Salmonella paratyphi B var. Java besmet waren, dienen tenminste 50 swabs genomen te worden bijvoorbeeld op de volgende plaatsen (dit laatste is enigszins afhankelijk van de betreffende praktijksituatie). 106

107 1. De vloeren, in het bijzonder de scheuren en de aansluitnaden met de wanden: 25 stuks; 2. Voerlijnen: voerpannen en de binnenzijde van de vijzelbuizen: 10 stuks; 3. Voerhoppers en de valpijpen aan de binnenzijde: 2 stuks 4. Ventilatoren plus de behuizing ervan: 5 stuks; 5. De vloer van het voerhok: 1 stuk; 6. Kachels aan binnen en buitenzijde: 2 stuks; 7. Inlaatopeningen van luchtinlaatkleppen (met name buitenzijde): 5 stuks. Voorts monstername van losliggend vuil en schraapsel van risicoplaatsen, zoals de binnenzijde van de voervijzel, bedrijfsschoeisel en kieren van afvoerputten. Het te nemen aantal swabs is afhankelijk van de hoeveelheid aangetroffen materiaal. Voor de analyse mogen 25 swabs worden gepoold. PPE 45 Besluit tot wijziging van het Hygiënebesluit kuikenbroederijen pluimveevleessector 2003 (2004-1) Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 10 juni 2004 tot wijziging van het Hygiënebesluit kuikenbroederijen pluimveevleessector 2003 Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op de artikelen 4, eerste lid, 5, eerste lid en 9 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999; Besluit: Artikel l Het Hygiënebesluit kuikenbroederijen pluimveevleessector 2003 wordt gewijzigd als volgt: Artikel 4, eerste lid, komt te luiden als volgt: A 1. De uitslag van het laatst uitgevoerde mestonderzoek bij het fok-/vermeerderingskoppel, waarvan een partij eendagskuikens afkomstig is, dient schriftelijk te worden doorgegeven aan het opfokvermeerderingsbedrijf of aan de vleeskuikenhouder. Deze informatie dient ingevuld te worden op het koppelpaspoort of het meldingsformulier. Dit formulier gaat met het koppel mee tot en met de slachterij. Aan artikel 4 wordt een derde lid toegevoegd dat luidt: B 3. Het herkomstbedrijf van de eendagskuikens moet schriftelijk worden doorgegeven via het koppelpaspoort of meldingsformulier (middels het VB-nummer). 107

108 Aan artikel 4 wordt een vierde lid toegevoegd dat luidt: 4. De monsters, waarvan de wijze van monstername en analyse in de bijlage III is omschreven, moeten geanalyseerd worden op alle typen Salmonella. Bij een besmetting moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. c Bijlage IV komt te vervallen. De nummering van bijlagen V en VI wordt gewijzigd in bijlagen IV en V. Arrikpl II Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie, waarin het wordt geplaatst. Zoetermeer, 10 juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. TDFI IfMTmin «l.l HFT RFSI HIT TOT WI.I7lfilNPi VAN HFT HYrilFNIFRFRI l UT Klllk-FMRpnFDFRI.IFM PI HIMVFFWI FFSSFrTOR 7003 (7004-1) Ten behoeve van het doorgeven van verplichte en gevraagde informatie door de keten heen is al jaren geleden het zogenoemde koppelpaspoort geïntroduceerd. Het koppelpaspoort is een doorslag van het standaard afleverings- en meldingsformulier pluimvee, dat door broederijen gebruikt kan worden voor het melden van aflevering van kuikens aan de vleeskuikenhouder en aan de PVE ten behoeve van I&R Pluimvee (KIP). Op het koppelpaspoort is ruimte voor de broederij om gegevens over de Salmonella-status en de herkomst van de vermeerderingsdieren behorend bij het vleeskuikenkoppel op te nemen. De vleeskuikenhouder vult deze Salmonella-gegevens rond het koppel verder aan en stuurt het koppelpaspoort door naar de slachterij. Zo kunnen verplichte en gevraagde monitoringsgegevens gemakkelijker worden doorgegeven door de keten heen. De eindschakel, de slachterijen, bundelt de informatie en stuurt de totale gegevensbestanden rond de monitoring door naar de PVE. Nu ook de resultaten van de mestonderzoeken bij de vermeerderingsbedrijven via het koppelpaspoort/meldingsformulier doorgegeven worden, kan beter naar verbanden tussen besmettingen bij vleeskuikenbedrijven en vermeerderingsbedrijven gezocht worden. Tot slot is ten behoeve van meer transparante regelgeving de verplichting tot het nader serotyperen van alle met Salmonella besmette pluimveernonsters nu ook in artikel 4 van het hygiënebesluit opgenomen. Deze verplichting was reeds in het monstername- en analyseprotocol in bijlage III opgenomen. Zoetermeer, l O juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. 108

109 PPE 46 Besluit tot wijziging van het Hygiënebesluit vleeskuikenbedrijven 1999 (2004-1) Besluit van het Productschap Pluimvee en Eieren van 10 juni 2004 tot wijziging van het Hygiënebesluit vleeskuikenbedrijven 1999 Het bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren; Gelet op de artikelen 4, eerste lid, 6 en 9 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999; Besluit: Artikel l Het Hygiënebesluit vleeskuikenbedrijven 1999 wordt gewijzigd als volgt: In artikel 2a komt het zinsdeel "bij twee koppels achtereen" te vervallen. Aan artikel 4 wordt een vijfde lid toegevoegd dat luidt: A B 5. Nadat bij een koppel vleeskuikens een Salmonella paratyhi B var. Java is geconstateerd moet, als de vleeskuikens een leeftijd van twee weken hebben bereikt, het onderzoek als omschreven in Bijlage II plaatsvinden. De uitslag moet bekend zijn voordat broedeieren voor een volgend koppel worden ingelegd op de broederij. Aan artikel 4 wordt een zesde lid toegevoegd dat luidt: 6. De monsters, waarvan de wijze van monstername en analyse in de bijlagen l, II en III zijn omschreven, moeten geanalyseerd worden op alle typen Salmonella. Bij een besmetting moet geanalyseerd worden om welk serotype het gaat. Aan artikel 5 wordt een derde lid toegevoegd dat luidt: 3. Zodra op het pluimveebedrijf bij een koppel een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting is geconstateerd via het onderzoek dat conform bijlage l en/of bijlage II is uitgevoerd, moet de pluimveehouder iedere bezoeker hierover informeren zodra de afspraak voor het maken van een bezoek wordt gemaakt. De bezoeker bezoekt het betreffende bedrijf na alle andere bezoeken op die dag. C D Aan artikel 6 wordt een zevende, een achtste, een negende, een tiende, een elfde lid en twaalfde lid toegevoegd luidende: 7. Nadat in een stal voor de tweede achtereenvolgende keer een Salmonella paratyphi B var. Java is geconstateerd via het onderzoek dat conform bijlage l en/of II is 109

110 uitgevoerd, moet in de betreffende stal een leegstandperiode van minimaal 10 dagen in acht worden genomen. Tijdens deze periode kunnen bestrijdingsmaatregelen worden genomen. 8. Na de constatering van een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting moet de stal tijdens de in lid 7 genoemde leegstandperiode worden gereinigd en ontsmet op de wijze zoals in bijlage VI is omschreven. 9. Tijdens de in lid 7 genoemde leegstandperiode na de constatering van een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting moet de stal door een erkende instantie worden onderzocht op de aanwezigheid van Salmonella spp. op de wijze zoals in bijlage VII is omschreven. Indien na de leegstandperiode de stal nog altijd besmet is met Salmonella spp. moet de pluimveehouder in overleg met externe deskundigen de verdere aanpak bepalen. 10. Nadat voor de derde achtereenvolgende keer in een stal een Salmonella paratyphi B var. Java besmetting is geconstateerd, dient in de betreffende stal het voersysteem gereinigd en ontsmet te worden en dient tijdens de volgende ronde gedurende twee weken aan het drinkwater voor de vleeskuikens een middel met bacteriedodende werking te worden toegediend. Deze middelen zijn in de handel vrij verkrijgbaar. De wijze en de toe te dienen hoeveelheid moet gedaan worden volgens de aanwijzingen van de fabrikant. 11. Nadat, met uitzondering van een eerste Salmonella paratyphi B var. Java constatering in de stal, op basis van de onderzoeken, omschreven in lid 7 en lid 9, geen Salmonella paratyphi B var. Java meer wordt aangetroffen, dienen enkele maatregelen gedurende drie achtereenvolgende ronden te worden uitgevoerd. De erkende instantie voert het hygiëne-onderzoek uit en onderzoekt de stal op aanwezigheid van Salmonella spp. 12. De erkende instantie, als bedoeld in het negende en elfde lid wordt aangewezen door de voorzitter en werkt volgens een door het bestuur goedgekeurd protocol. De bijlagen VI en VII bij dit besluit worden toegevoegd. Artikel II Dit besluit treedt in werking met ingang van de tweede dag na de dag van dagtekening van het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie, waarin het wordt geplaatst. Zoetermeer, 10 juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. 110

111 TOELICHTING BIJ HET BESLUIT TOT WIJZIGING VAN HET HYGIËNEBESLUIT VLEESKUIKENBEDRIJVEN 1999 (2004-I) In het afgelopen jaar heeft met name Salmonella paratyphi B var. Java (S. Java) zich gemanifesteerd in pluimvee. Begin 2003 was zo'n 50% van de met Salmonella besmette eindproducten besmet met S. Java. S. Java wordt voor de volksgezondheid een steeds groter probleem vanwege de groeiende resistentie tegen een aantal antibiotica. Met het oog hierop is reeds een meldplicht voor S. Java van kracht. Dit houdt dat zodra bij een pluimveehouder of broederij een S. Java besmetting wordt geconstateerd dit binnen 48 uur gemeld moet worden bij het productschap. Zodra bijgaand wijzigingsbesluit van kracht is zal de pluimhouder die een S. Java besmetting heeft gemeld, door het productschap geïnformeerd worden over de te nemen maatregelen. Om S. Java op effectieve wijze te kunnen bestrijden is een plan opgesteld ter preventie en bestrijding van Salmonella paratyphi B var. Java. In dit wijzigingsbesluit is een aantal maatregelen opgenomen dat de pluimveehouder moet uitvoeren nadat S. Java op zijn bedrijf is geconstateerd. De aanpak is hordengewijs. Dit wil zeggen dat de intensiteit van de te nemen maatregelen wordt opgevoerd bij opeenvolgende rondes besmettingen met S. Java. Dit betekent dat de pluimveehouder niet onmiddellijk verplicht is het volledige arsenaal aan maatregelen in te zetten bij een constatering van S. Java. Na de eerste ronde besmetting met S. Java is zelfs nog geen enkele verplichting van kracht, aangezien er nog vanuit gegaan kan worden dat deze besmetting een passant betreft. Na de tweede besmette ronde volgt de eerste set van maatregelen, waarbij het uitvoeren van een intensief reinigings- en ontsmettingsprogramma volgens een in de bijlage bij dit besluit opgenomen protocol een essentieel onderdeel is, en het swabonderzoek in de stal om na te gaan of de stal nog besmet is met S. Java. Nadat ook in de derde achtereenvolgende ronde een besmetting met S. Java bij het koppel is gesignaleerd, moet aanvullend op de maatregelen die na de tweede besmetting genomen dienden te worden ook het voersysteem gereinigd en ontsmet worden en dient in de navolgende ronde het drinkwater gedurende twee weken voor het pluimvee behandeld te worden met een bacteriedodend middel. Voorts moet de pluimveehouder nadat de stal vrij is van S. Java en geen S. Java meer bij het zittende koppel wordt gevonden, nog gedurende drie ronden extra controles uitvoeren op de aanwezigheid van S. Java via hygiëneonderzoeken en swabonderzoeken in de stal. Tot slot is ten behoeve van meer transparante regelgeving de verplichting tot het nader serotyperen van alle met Salmonella besmette pluimveemonsters nu ook in artikel 4 van het hygiënebesluit opgenomen. Deze verplichting was reeds in het monstername- en analyseprotocol in de bijlage l, II en III opgenomen. Zoetermeer, 10 juni 2004 J.J. Ramekers, voorzitter, S.B.M. Jongerius, secretaris. 111

112 BIJLAGE VI Protocol voor reinigen en ontsmetten van pluimveestallen en inventaris Woord vooraf In dit artikel wordt een protocol beschreven dat algemeen toepasbaar is en dient te worden ingevuld op basis van de specifieke bedrijfssituatie. Hiermee wordt onder meer bedoeld dat de te kiezen middelen en doseringen door de pluimveehouder zelf moeten worden ingevuld. Uiteraard is het raadzaam om deskundig advies in te winnen over de keuze van het materiaal, zodat de verschillende middelen goed op elkaar zijn afgestemd en niet contraproductief werken. Daarnaast hangt de werkwijze af van het type pluimvee en de daarbij horende staltypen. Inleiding Over reinigen en ontsmetten bestaan veel verschillende meningen bij mensen die in de pluimveehouderij werkzaam zijn. De meningen lopen uiteen van alles moet steriel zijn als in een operatiekamer tot alleen met water reinigen is genoeg. De verordeningen van de Productschappen Pluimvee en Eieren schrijven echter bepaalde werkwijzen voor die kunnen bijdragen tot de vermindering van de Salmonella- en Campylobacterbesmettingen van het eindproduct: pluimveevlees of eieren. In de bestrijding van deze bacteriën speelt de reiniging en ontsmetting van stallen terecht, een belangrijke rol. Toch is dit niet de enige reden om goed te ontsmetten. Allerlei ongewenste ziektekiemen voor de dieren zelf dienen ook te worden gedood. Bij elk nieuwe koppel dient er met een schone lei te worden begonnen, waarbij ook de insleep vanuit de omgeving van de stallen moet worden voorkomen. Er bestaat geen algemeen geldende "beste" methode waarmee een stal dient te worden gereinigd en ontsmet. Wel zijn er tal van specifieke zaken waarmee rekening moet worden gehouden en die in de loop van de jaren verwateren of worden vergeten. In dit artikel staan vele zaken die uiteraard bekend en voor de hand liggend zijn, maar er wordt getracht uw geheugen op te frissen en uzelf scherp te houden. De werkzaamheden rondom het schoonmaken en ontsmetten van pluimveestallen komt in grote lijnen hierop neer: * Afvoer van losse inventaris uit de stal * Mest verwijderen * Droog reinigen van stal en vaste inventaris (bezemschoon) * Inweken onder toevoeging van inweekmiddel * Reinigen van "vaste" drinknippelsystemen * Schoonmaken stal en vaste inventaris * Droogtrekken vloer * (gedeeltelijk) Herinrichten * Nat ontsmetten * Droog na-ontsmetten Reinigen en ontsmetten zijn twee afzonderlijke handelingen. De aanwezigheid van organisch vuil, maar vooral van vet staat een goede ontsmetting in de weg. Organisch materiaal inactiveert ontsmettingsmiddelen en vet is een prima beschermer is van micro-organismen. Alleen als er loog wordt gebruikt, weliswaar met in achtneming van voldoende inweektijd, zouden ze in één procesgang kunnen worden uitgevoerd. Algemeen geldt echter, als zowel een reinigings- als een desinfectiemiddel wordt gebruikt, dat de beide middelen op elkaar moeten zijn afgestemd. Deze informatie is te verkrijgen bij de leverancier van de middelen. 112

113 Reinigen Voor een goede reiniging van de stal en directe omgeving is het van belang dat de werkzaamheden in de juiste volgorde worden uitgevoerd. Het water dat voor de reiniging wordt gebruikt dient minimaal geschikt te zijn als drinkwater voor vee, om te voorkomen dat er stoffen in zitten die de reiniging negatief beïnvloeden. Werkwijze reiniging stal: 1. Direct na het afleveren van de dieren beginnen met bestrijden van piepschuimkevers en larven door het spuiten van een bestrijdingsmiddel op de wand en op de kieren en naden tussen vloer en wand. Hiertoe moeten naden eerst worden vrijgemaakt van mest en strooisel. Ook de kieren tussen staanders en spanten moeten worden behandeld, kevers en larven verdwijnen niet alleen naar boven, maar ook naar beneden!! 2. Voerruimten, hygiënesluis en andere ruimten die met de stal in verbinding staan moeten worden ontruimd en goed schoongemaakt. 3. Voersysteem volledig leeg draaien, voerresten verwijderen en het voersysteem goed handmatig schoonmaken. De silo en opvoervijzel naar en van de weeginstallatie niet vergeten. Silo's moeten leeggedraaid worden en voerresten onder in de silo en weegapparatuur handmatig worden verwijderd. 4. Demonteerbare en niet ter plaatse te reinigen apparatuur uit de stal verwijderen en opslaan op een verharde ondergrond met een goede waterafvoer. 5. Mest verwijderen en direct afvoeren van het bedrijf. Bij opslag op het eigen bedrijf zo ver mogelijk van de stal en goed afdekken. 6. Uitneembare ventilatoren uit de kokers halen en opslaan op verharde ondergrond. Ventilatieopeningen droog schoonmaken. Bij lengteventilatie de ventilatoren en de kasten goed schoonmaken. Zorg hierbij voor een goede afvoer van vuil water. 7. Luchtinlaatkleppen en kasten schoonborstelen zowel aan de binnen- als buitenkant. De moeilijke bereikbaarheid van buitenaf werkt hier vaak belemmerend. Het schoonmaken van de beschermkappen buiten is belangrijk in verband met naar binnen trekken van stof dat daar is opgehoopt. Bovendien zijn ze vaak van hout en afgeschermd met gaas en daardoor lastig schoon te maken. Perslucht kan hier een hulpmiddel zijn. 8. Apparatuur die niet met water is te reinigen schoonborstelen en schoonblazen met een luchtcompressor en daarna afdekken met plastic of op een stofvrije plaats opslaan. 9. Stal schoonvegen en zo nodig mestresten wegkrabben. 10. Drinkwatersysteem leeg laten lopen, doorspelen en volzetten met een specifiek reinigingsmiddel. Na voldoende inwerktijd spoelen. 11. Sterk bevuilde vloeren en vloeren van een slechte kwaliteit eerst gedurende minimaal 3 uur tot overnacht laten inweken met water waaraan een inweekmiddel is toegevoegd en daarna onder hoge druk schoonspuiten. Hierbij extra aandacht besteden aan de kieren en naden. Deze dienen goed te worden schoongespoten zodat later het desinfectiemiddel diep in de naden kan doordringen. Soms is het nodig de stal iets langer te laten afkoelen om de naden ver genoeg open te krijgen. 12. Plafond, ventilatorkokers en wanden in delen inschuimen met een reinigingsmiddel. Schuimmiddelen zijn te verkiezen boven vloeibare middelen want ze werken langduriger. Vervolgens 30 minuten later deze onderdelen afspuiten met water: - ventilatorkokers en plafond met een rondstraler; - wanden met een vlakstraler. Hierbij van boven naar beneden werken. 13. Vloer, voer- en drinkwatersysteem inschuimen met een reinigingsmiddel. Vervolgens 30 minuten later afspuiten met water. Er op letten dat niet het vuil van de vloer weer op de wanden wordt gespoten door (te) hoge druk. Zorg voor een voldoende afvoer van water. 14. Kachels dienen van binnen en van buiten te worden gereinigd. Als de stal wordt drooggestookt, droogt de vuillaag aan de binnenkant uit, laat los en wordt in de schone stal geblazen. 15. Leidingen en buizen die in een stal lopen worden vaak vergeten, vooral die zich hoog in de stal bevinden. Hetzelfde geldt voor lampen en TL armaturen die soms schuin zijn gemonteerd zodat er een laag stof op ligt. 113

114 16. Stalvloer droogtrekken. 17. Alle in relatie tot de stal staande lokalen en gebouwen droog schoonmaken en daarna nat met een reinigingsmiddel. Ook de ruimte waar kadavers worden bewaard moet goed worden gereinigd. 18. Inspecteer de stalruimte en apparatuur op achtergebleven visuele verontreinigingen. 19. Opgeslagen inventaris reinigen met een reinigingsmiddel, daarna afspoelen met water. 20. Gedemonteerde ventilatoren reinigen met een compressor of een aangepaste borstel. 21. Stal inrichten maar geen inventaris op de Stalvloer plaatsen. Ventilatoren plaatsen en nadat de stal is opgedroogd, kokers afsluiten. 22. Stal zo goed mogelijk afsluiten. Zorg echter voor goede bereikbaarheid van de te behandelen oppervlakken, bijvoorbeeld de luchtinlaatkleppen. 23. Kleding wassen. Schoeisel of laarzen schoonmaken. Reinigen en ontsmetten drinkwatersysteem: Probeer allereerst vast te stellen wat de aard is van de inwendige vervuiling van het systeem. Dit kan gedaan worden door het systeem op enkele plaatsen te ontkoppelen. Ruwweg kan dit bestaan uit organisch vuil (bacteriën, algen en schimmels) of anorganisch (kalksteen). Organische aanslag kan worden verwijderd met een alkalisch reinigingsmiddel of waterstofperoxide; anorganische aanslag moet worden bestreden met een zuur reinigingsmiddel (pas op voor corrosie). Tijdens de reiniging dient de stal c.q. de watertemperatuur minimaal 10 C te bedragen. Werkwijze reiniging drinkwatersysteem. Nippel- en cupsvstemen en centrale leidingen: Systeem voorspoelen met hoge druk. Via doseerapparaat of voorraadvat slangen en systeem vullen met een oplossing van het reinigingsmiddel. Elk tappunt controleren of de vloeistof is doorgedrongen (ruiken of ph papiertjes). Gedurende minimaal 24 uur in laten werken. Systeem leeg laten lopen en goed spoelen met schoon water. Drinktorens en losse cups: Onderdompelen in de reinigingsvloeistof (kalkoplossend) en 2 tot 6 uur in laten werken. Daarna onder druk afspuiten met een koude waterstraal. Bij ernstige vervuiling met een harde borstel reinigen. Daarna de nippelleidingen volzetten met een ontsmettingsmiddel, de benodigde tijd laten staan en met schoon drinkwater naspoelen. Controleer hierbij desgewenst of alle ontsmettingsmiddel weg is. De drinktorens dompelen of afsproeien met een ontsmettingsmiddel, waarna ze worden nagespeeld met schoon drinkwater. Ontsmetten Ontsmetting kan gedaan worden met verschillende ontsmettingsmiddelen, die elk één of meerdere werkzame stoffen bevatten. Om een goede werkzaamheid tegen Salmonella paratyphi B var. Java te verkrijgen wordt ontsmetting met formalinehoudende middelen geadviseerd. Voor de meeste middelen geldt dat de stal zeer goed gereinigd moet zijn, omdat de werkzame stof door vuilresten onwerkzaam wordt gemaakt. Ontsmetting kan uitgevoerd worden met de aanwezige reinigingsapparatuur. Er moet echter geen hoge druk gebruikt worden. De beste resultaten worden behaald door een combinatie van een ontsmetting van de vloer, de opgaande wand en de inlaatkleppen met de hogedrukreiniger gevolgd door een ruimteontsmetting met een hoge druk vernevelaar. Werkwijze ontsmetting 1. Breng de stal tijdig van tevoren op de gewenste temperatuur. Wanneer deze niet bereikt kan worden, kies dan een ander ontsmettingsmiddel dat wel bij de behaalde temperatuur past of laat het middel langer inwerken. 2. Neem maatregelen om insleep tijdens en na de ontsmetting te voorkomen. Deuren in verband met de eigen veiligheid nog niet op slot. 114