KWALITEITSANALYTIEK VAN ZALM CALCITONINE IN EEN BIOADHESIEF NASAAL POEDER

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische analyse Drug Quality and Registration (DruQuaR) laboratorium Academiejaar KWALITEITSANALYTIEK VAN ZALM CALCITONINE IN EEN BIOADHESIEF NASAAL POEDER Nele CLOTTENS Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Promotor Prof. dr. Bart De Spiegeleer Commissarissen Prof. dr. Baeyens Dr. Mehuys

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische analyse Drug Quality and Registration (DruQuaR) laboratorium Academiejaar KWALITEITSANALYTIEK VAN ZALM CALCITONINE IN EEN BIOADHESIEF NASAAL POEDER Nele CLOTTENS Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Promotor Prof. dr. Bart De Spiegeleer Commissarissen Prof. dr. Baeyens Dr. Mehuys

4 AUTEURSRECHT De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 2 juni 2009 Promotor Prof. Dr. Bart De Spiegeleer Auteur Nele Clottens

5 Woord vooraf Om tot dit resultaat te komen werd heel wat inspanning gevergd, niet alleen van mezelf maar ook van de mensen rondom mij. Daarom wil ik graag van deze gelegenheid gebruik maken om enkele mensen te bedanken zonder wie het verwezenlijken van deze masterproef niet mogelijk was geweest. Eerst en vooral wil ik mijn promotor Prof. Dr. Bart De Spiegeleer bedanken voor de inspanning die hij besteed heeft aan het onderzoek en mijn thesis. Bij hem kon ik altijd terecht met problemen en vragen, zijn deur stond altijd open. Daarnaast wil ik graag Kevin en Valentijn bedanken voor hun hulp die ik gekregen heb bij de experimenten en rapporten. Eveneens wil ik ook Elien, Nadia en Sylvia bedanken, aan hen kon ik mijn kleine vraagjes stellen die voor mij van groot belang waren. Graag wil ik mijn ouders hartelijk bedanken voor de steun en hulp die ze mij al 21 jaar lang geven en waarschijnlijk nog een lange tijd zullen geven. Tot slot wil ik mijn vriend Dimitri en mijn vrienden bedanken. Het zijn soms kleine dingen die belangrijk zijn op moeilijke momenten.

6 INHOUDSOPGAVE Woord vooraf INHOUDSOPGAVE LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 1.INLEIDING HET BELANG VAN PEPTIDE GENEESMIDDELEN Algemeen Aanmaak van peptiden Problematiek van peptiden CALCITONINE Structuur en functie Soorten en hun verschillen Orale toediening Formulaties van calcitonine Chemische stabiliteit van calcitonine Calcitonine in polymeren Thesisonderzoek OBJECTIEVEN MATERIAAL EN METHODEN HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY Algemeen principe Specificaties UV/VIS EN PDA DETECTOR MASSASPECTROSCOPIE Algemeen principe Specificaties ANDERE TOESTELLEN RESULTATEN GEHALTEBEPALING: PILOOT EXPERIMENT... 19

7 4.2 OPTIMALISATIE VAN DE HPLC METHODE Beschrijving experimenten Resultaten HPLC methode optimalisatie STAALBEHANDELING FA-gebaseerde optimalisatie Bereiding van de oplossingen Evaluatie van het Plackett-Burman design Evaluatie van de FA als zuur voor de staalvoorbereiding TFA-gebaseerd proefopzet (1) onion design Het onion proefopzet Bereiding van de oplossingen Resultaat van de responsen Fitten van het model met PLS Mathematisch model Evaluatie van het onion design TFA-gebaseerd proefopzet (2) Plackett-Burman design Het Plackett-Burman design Bereiding van de oplossingen Evaluatie van het Plackett-Burman design FINALE METHODE EN PILOOT EVALUATIE Bereiding van de oplossingen: System suitability test De gehaltebepaling van zalm calcitonine Korte evaluatie van de finale methode DEGRADATIEPROFILERING VAN ZALM CALCITONINE Bereiding van de oplossingen Resultaat degradatieproducten Resultaat selectiviteit VERIFICATIE VAN DE LC-MS METHODE BIJ LAGERE CONCENTRATIES DISCUSSIE CONCLUSIES... 50

8 7. LITERATUURLIJST BIJLAGEN... BIJLAGE 1: GEGEVENS VAN DE GEFORCEERDE STRESS DEGRADATIE...

9 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN ESI: Elektrospray ionisatie FA: Formic acid (mierenzuur) FTIR: Fourier transform infrared spectroscopy (infraroodspectroscopie) IU: Internationale eenheid LOD: Limit of detection (detectielimiet) LOQ: Limit of quantification (kwantificatie limiet) MLR: Multiple linear regression (meervoudige lineaire regressive) MS: Massaspectrometer (massaspectrometrie) PBS: Phophate buffered saline (fosfaat gebufferde zoutoplossing) PDA: Photo diode array PEG: Polyethyleenglycol PEGT: Poly(ethyleenglycol)-tereftalaat PBT: Poly(butyleentereftalaat) Ph. Eur.: Europese pharmacopee PLS: Partial least squares RRT: Relatieve retentietijd RP-HPLC: Reverse phase-high performance liquid chromatography SEC-LC: Size exclusion-liquid chromatography SCX-LC: Strong cation exchange-liquid chromatography SIM: Single/selected ion monitoring TFA: Trifluoroacetic acid (trifluorazijnzuur) USA: United states of America UV: Ultraviolet VIS: Visueel (zichtbaar)

10 1.Inleiding 1.1 HET BELANG VAN PEPTIDE GENEESMIDDELEN Algemeen De structuur van peptiden en proteïnen, als aminozuren aan elkaar gekoppeld door amide CO-NH binding, is reeds meer dan 100 jaar gekend (Fischer, 1902) (Hofmeister, 1902). Ondanks hun schijnbaar eenvoudige chemische structuur, duurde het nog eens 50 jaar alvorens routine methoden werden ontwikkeld voor de karakterisatie van peptiden (Verlander, 2007). De chemische synthese van peptiden verliep evenmin vlot: pas in 1953 werd oxytocin, als eerste peptide geneesmiddel, gesynthetiseerd door du Vigneaud. Alhoewel sindsdien peptide geneesmiddelen op de markt werden gebracht (o.a. leuprolide = leuprorelin), is hun aantal nog steeds relatief klein. Hiervoor zijn verschillende redenen zoals de relatief hoge kosten voor productie van peptiden in vergelijking met de conventionele geneesmiddelen, de enorm lange tijd die nodig was om een robuust proces voor de fabrikant te ontwikkelen, Met de introductie van de Merrifield s Solid Phase peptide synthesis (SPPS) in 1963 en de komst van high performance liquid chromatography in dezelfde periode werd een nieuwe revolutie gestart, die nu uiteindelijk voldoende maturiteit bereikt heeft om als industriële processen in de geneesmiddelproductie gebruikt te worden. Het gebruik van RP- HPLC voor de karakterisatie en zuivering van peptiden en het gebruik van de SPPS methode, zorgen ervoor dat peptiden als active pharmaceutical ingredients (APIs) meer geaccepteerd kunnen worden. Bovendien hebben deze technieken een enorme impact op de tijd en kost nodig voor de ontwikkeling van het productieproces (Verlander, 2007). Tot begin de 90 jaren focusten farmaceutische bedrijven zich meer op onderzoek naar kleine moleculen dan op peptiden omdat deze kleine moleculen voordelen boden op vlak van in vivo stabiliteit en farmacokinetische eigenschappen. Naarmate meer toxiciteit van kleine moleculen vastgesteld werd en gezien de technologische peptiden-mogelijkheden zoals hierboven besproken, verschoof de focus. Een hoge specificiteit en, in de meeste gevallen, een laag toxiciteitsprofiel stimuleerden het gebruik van peptiden en designer peptide drugs in geneesmiddelenontwikkeling. Het aantal onderzoeken nam sindsdien toe. Designer peptide drugs overwonnen de slechte farmacologische eigenschappen die het 1

11 oorspronkelijk peptide bezat. Deze peptiden bevatten onnatuurlijke aminozuren, substituties of cyclische structuren. Ze vormen met hun hoge specificiteit en lage toxiciteit eveneens een waardig alternatief voor de kleine moleculen. (Otvos, 2008a) Tegenwoordig bestaat meer dan 10 % van de geneesmiddelenmarkt uit peptide-/ proteïnegeneesmiddelen, hoewel de meerderheid oraal niet beschikbaar is en massaproductie heel duur is. Volgens Frost & Sullivan (2004) waren er 720 peptidegeneesmiddelen en geneesmiddelkandidaten in Hoeveel er daarvan reeds op de markt waren, in klinische fase, preklinische fase of registratie, wordt aangetoond in Figuur 1.1. FIGUUR 1.1: PEPTIDEGENEESMIDDELEN/KANDIDATEN 2004 (Frost & Sullivan, 2004) Aanmaak van peptiden Peptiden kan men genereren op drie verschillende manieren: via natuurlijke isolatie, via recombinante methode of via synthetische methode. (Sato et al., 2006) Robert Bruce Merrifield is de pionier in Solid phase peptide synthesis (synthetische aanmaak). Een onoplosbare drager wordt gebruikt om gewenste aminozuren vast te hechten. Synthese gebeurt van C- naar N-terminus, waarbij telkens één enkel aminozuur, beschermd t.h.v. de N-terminus, gekoppeld wordt. Vervolgens wordt de bescherming opgeheven m.b.v. trifluoroazijnzuur oplossing in dichloromethaan gevolgd door 2

12 neutralisatie, zodat de N-terminus vrijkomt om een nieuw aminozuur te koppelen. Dit proces van koppeling en deprotectie wordt herhaald tot de gewenste sequentie gesynthetiseerd is. Nadat drager en beschermende groepen van het peptide verwijderd zijn, wordt het solitair peptide vrijgesteld, hiervoor is een sterk zuur nodig. Vaak wordt waterstoffluoride of trifluoromethaan sulfonzuur aangewend. De reagentia worden in overmaat gebruikt tijdens de synthese, wat resulteert in snelle synthese en hoge zuiverheid. Bovendien kan men met een simpele wasprocedure de reagentia op het einde van elke synthetische stap makkelijk verwijderen. ( ( Problematiek van peptiden Een van de grootste problemen bij peptiden is de korte verblijftijd in het bloed. Dit is te wijten aan enerzijds snelle afbraak door proteasen (die het peptide enzymatische afbreken) en anderzijds renale klaring. Deze klaring varieert naargelang het peptide maar kan slecht enkele minuten bedragen. Modificatie van het peptide, is een oplossing om de verblijftijd in het bloed te verlengen: zoals bijv. wijziging van N- of C-terminus, cyclisatie van het peptide, vervanging van aminozuren die gevoelig zijn voor enzymatische afbraak door onnatuurlijke aminozuren, enzym inhibitie en verhoging van moleculair gewicht door binding met polyethyleenglycol, ook PEGylatie genoemd. (Sato et al., 2006) (Ayoub & Scheidegger, 2006). Daar exopeptidasen aanvallen op therapeutische peptiden, stijgt de enzymatische stabiliteit significant indien één of beide termini gewijzigd worden. N-acetylatie en C- amidatie worden vaak toegepast. Eveneens kan de degradatie door exopeptidasen verhinderd worden door vorming van amide brug tussen de N- en C-terminus, dit wordt ook kop-staart cyclisatie genoemd. (Werle& Bernkop-Schnürch, 2006) 3

13 Sato et al. (2006) hebben reeds het effect van PEGylatie bestudeerd. PEG gebonden aan de N- of C-terminus van de peptide biedt verscheidene voordelen. Zo worden de PEGpeptides niet meer renaal geklaard ten gevolge van de grootte en is hierbij de N- of C- terminus afgeschermd. Dit leidt tot een hogere biologische beschikbaarheid. Een ander belangrijk probleem dat mogelijks optreedt bij peptiden is immunogeniciteit. Het peptide wordt hierbij herkend als lichaamsvreemd. Dit leidt tot een overbodige immuunrespons. Indien peptiden geconjugeerd worden met PEG leidt dit tot een verminderde immunogeniciteit. Men mag deze PEG-verbetering wel niet veralgemenen, aangezien deze niet geldt voor alle peptiden. (Sato et al., 2006) 1.2 CALCITONINE Structuur en functie Calcitonine is een natuurlijk voorkomend peptide hormoon, opgebouwd uit 32 aminozuren en kan zowel door recombinante DNA techniek aangemaakt worden alsook door synthetische methode. In zijn primaire structuur bevat zalm calcitonine vier basische aminozuren (Lys 11, Lys 18, His 17 en Arg 24), waardoor bij een ph kleiner dan 10.4 (i.e. isoelektrisch punt), zalm calcitonine voorkomt als kation. Opdat calcitonine zijn biologische activiteit kan uitoefenen zijn de volgende componenten noodzakelijk: een disulfidebrug tussen cysteïnes op plaats 1 en 7, acht specifieke aminozuren aan de N-terminus en een proline amide groep aan de C-terminus. (Seyferth & Lee, 2003), (Silvestro & Savu, 1996), (Baudys et al.,1996) Calcitonine is een inhiberend hormoon dat in ons lichaam wordt gesecreteerd door parafolliculaire C-cellen van de schildklier. Calcitonine is betrokken bij de regulatie van calcium- en botmetabolisme, meer specifiek induceert calcitonine reductie van de botresorptie door binding op de osteoclastreceptoren. De minerale botdensiteit neemt hierdoor toe alsook de botsterkte. Calcitonine is geïndiceerd voor de behandeling van postmenopausale osteoporose en de ziekte van Paget, hierbij alleen of in combinatie met andere geneesmiddelen. (Stuart& Silverman, 2003), (Capelle et al., 2008) 4

14 FIGUUR 1.2: PRIMAIRE STRUCTUUR VAN ZALM CALCITONINE ( Soorten en hun verschillen Voor medisch gebruik zijn enkel varken, paling, zalm en humaan calcitonine van toepassing. Calcitonine van deze species onderscheidt zich in aminozuren van positie 10 tot 27. Als gevolg hiervan zijn sterkte en duur van de activiteit verschillend tussen de species. De structurele verschillen van varken, paling, zalm en humaan calcitonine worden aangetoond in Tabel 1.1. Zalm en humaan calcitonine zijn de meest potente, waarbij zalm calcitonine nog 20 tot 30 maal meer potent is dan de humane vorm. Beiden zijn klinisch effectief. (Baudys et al., 1996) Humaan calcitonine heeft in tegenstelling tot de zalm calcitonine het voordeel dat ze geen neutraliserende antilichamen vrijzet na langdurige toediening. Maar humaan calcitonine is fysisch instabiel en slaat neer in waterig milieu met een troebele en viskeuze massa tot gevolg. Dit is te wijten aan aggregatievorming, waarbij fibrillen gevormd worden. Zalm calcitonine vertoont deze eigenschap minder, mogelijks doordat het iso-elektrisch punt (pi) voor beide species verschillend is. (Baudys et al., 1996) 5

15 TABEL 1.1: STRUCTURELE VERSCHILLEN VAN VARKEN, PALING, ZALM EN HUMAAN CALCITONINE ( Species Sequentie Moleculaire formule pi Varken calcitonine Paling calcitonine Zalm calcitonine Humaan calcitonine H-Cys 1 -Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser- Ala-Tyr- Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly- Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro 32 -NH 2 (S-S brug tussen Cys 1 en Cys 7 ) H-Cys 1 -Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu- Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr- Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro 32 -NH 2 (S-S brug tussen Cys 1 en Cys 7 ) H-Cys 1 -Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu- Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro 32 -NH 2 (S-S brug tussen Cys 1 en Cys 7 ) H-Cys 1 -Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr- Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr- Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro 32 -NH 2 (S-S brug tussen Cys 1 en Cys 7 ) C 145 H 240 N 44 O 48 S C 146 H 241 N 43 O 47 S C 148 H 228 N 40 O 46 S C 151 H 226 N 40 O 45 S Orale toediening Voor chronische ziekten is de orale inname heel belangrijk voor de therapietrouw en aanvaardbaarheid. Hierbij moet rekening gehouden worden met de verschillende barrières waarmee calcitonine te maken heeft na orale inname: chemische en enzymatische degradatie, mucosale barrière, hepatische eliminatie en metabolisme tijdens transepitheliaal transport (Lu et al., 1999). Er werd en wordt dan ook veelvuldig gezocht naar technieken om de orale toediening te verbeteren. Lee & Sinko (2000) beschreven verschillende manieren om de absorptie van zalm calcitonine te verbeteren na orale inname. De ph verlagen van de dunne darm zodanig dat de activiteit van de proteasen afneemt is hier één van. Deze daling van ph leidde tot een significante stijging van de plasmaconcentratie van zalm calcitonine. Een andere mogelijkheid was het gebruik van verschillende additieven in de formulatie. Deze additieven hadden een invloed op de permeabiliteit van de dunne darm. De biologische beschikbaarheid van zalm calcitonine kan bijgevolg met verschillende methoden verhoogd worden, maar het gebruik van andere niet-parenterale 6

16 toedieningroutes blijft alsnog een belangrijke alternatieve optie om een voldoende hoge biologische beschikbaarheid te verkrijgen Formulaties van calcitonine Momenteel zijn enkel injecties en nasale sprays beschikbaar. De nasale toediening geniet de voorkeur bij vele patiënten en is daardoor de meest gebruikte vorm. Naast zijn gebruiksgemak bezit de nasale spray een goede tolerantie. De dosissen kunnen bij dezen op elk moment van de dag toegediend worden en nevenwerkingen zijn minimaal. De biologische beschikbaarheid na nasale toediening is echter beduidend lager in vergelijking met de injecteerbare vorm. In Tabel 1.2 wordt aangetoond welke formulaties met zalm calcitonine nu reeds op de markt zijn of waren in USA en Europa met bijhorende bewaarcondities. Allen zijn waterige oplossingen (Capelle et al., 2008), (Stuart & Silverman, 2003), (Karsdal et al., 2008). TABEL 1.2: ZALM CALCITONINE PRODUCTEN GOEDGEKEURD DOOR USA EN/OF EUROPA Product Toedieningsroute Bewaringsomstandigheden Calcimar, Sanofi-Aventis; 1975 FDA goedgekeurd; 2005 afgekeurd Oplossing voor injectie 2-8 C; 2 weken stabiel op kamertemperatuur Miacalcic, Novartis; 1997 FDA goedgekeurd Oplossing voor injectie 2-8 C Forcaltonin, Unigene; 1999 EU goedgekeurd Oplossing voor injectie 2-8 C Miacalcic, Novartis; 1995 FDA goedgekeurd Nasale spray (multidosis) 200IU/spray Fortical, Unigene; 2005 FDA goedgekeurd Nasale spray (multidosis) 200IU/spray Voor gebruik bij 2-8 C, tijdens gebruik bij C gedurende max. 35 dagen Voor gebruik bij 2-8 C, tijdens gebruik bij C gedurende max. 30 dagen 7

17 1.2.5 Chemische stabiliteit van calcitonine Calcitonine is zoals vele peptiden gelimiteerd in zijn gebruik wegens de chemische instabiliteit. Deze instabiliteit is te wijten aan de vorming van degradatieproducten en fibrillen. Calcitonine wordt via de volgende mechanismen afgebroken: zuur-gekatalyseerd deamidatie, water-gekatalyseerde hydrolyse, base-gekatalyseerde dimerisatie en sulfide disproportionatie. De afbraak is hierbij ph-afhankelijk; waarbij de molecule het meest stabiel is bij ph 3 en 4. Naarmate de ph verhoogd wordt zal de degradatiesnelheid alsook het aantal degradatiepathways snel toenemen. In de literatuur worden verschillende synthese onzuiverheden en degradanten van calcitonine beschreven: N-acetyl-cys 1 -calcitonine, O- geacetyleerd calcitonine, Cys 1 -Ser 2 -hydrolyseproduct, trisulfide, Glu-gedeamideerde producten, dimeren, Een overzicht van alle degradatieproducten tot op heden beschreven in de literatuur is weergegeven in Tabel 1.3. (Windisch et al., 1997), (Lee et al., 1992), (Silvestro& Savu, 1996) (Capelle et al., 2008), (Chang et al., 2003) TABEL 1.3: OVERZICHT DEGRADATIEPRODUCTEN CALCITONINE UIT DE LITERATUUR Referentie Methode Degradatieproducten Conditie Analytische info (1) Ph. Eur. Windisch et al., 1997 Lee et al., 1992 Silvestro & Savu, 1996 (1) SCX-LC RP-LC + MS SEC-LC RP-LC RP-LC-MS Onzuiverheid F: disulphooxidatie analoog Cys 1 -Ser 2 -hydrolyse product Trisulfide Glu 14 gedeamideerd Glu 20 gedeamideerd Dimeer Gereduceerd analoog 1-11 segment breuk Hydroxy analoog - RRT 0.6 ph 4, stress (60 C, 5 dagen) ph 6, stress (60 C, 5 dagen) ph 3, stress (60 C, 5 dagen) ph 3, stress (60 C, 5 dagen) ph 6, stress (60 C, 5 dagen) ph 2.2, stress (70 C, 3 uur) 2 jaar oude waterige oplossing Drug producten (6.9%) RRT 0.74 (11.1%) RRT 0.92 (3.7%) RRT 1.05 (5.2%) RRT 1.07 (38.0%) RRT 0.91 (Ca 41%) RRT 0.83 (Ca 10%) RRT 0.91 (0.46 tot 3.51%) RRT 0.96 Dihydro analoog Referentie standaarden; RRT 0.96 descys analoog niet geobserveerd als degradant RRT 0.97 Percentages weergegeven zijn gewichtsprocenten. De RRT zijn de relatieve retentietijden t.o.v. zalm calcitonine met een standaard RP-HPLC acetonitrile gradiënt. 8

18 1.2.6 Calcitonine in polymeren Om het aantal toedieningen te reduceren kan men gebruik maken van preparaten met gecontroleerde vrijgave. Aangezien de inname-frequentie vermindert, komt dit de therapietrouw ten goede en wordt de werking ook tijdens de nacht gecontroleerd. Er zijn verschillende mogelijkheden om zo n preparaat te maken. Het gebruik van polymeren om een matrix te creëren waaruit de actieve substantie diffundeert is er één van. Deze incorporatie van calcitonine in een polymeer beschermt het peptide tegen een snelle klaring wat een groot voordeel is. Preparaten met gecontroleerde vrijgave bieden dus vele voordelen, maar het probleem stelt zich echter in de degradatie en/of een onvolledige vrijstelling van calcitonine uit het polymeer. Van Dijkhuizen-Radersma et al. (2002) onderzochten de stabiliteitsaspecten van zalm calcitonine in een degradeerbaar PEGT/PBT copolymeer matrix. Deze werd bereid door een emulsie te maken van waterige zalm calcitonine en de polymeer oplossing, vervolgens werd het solvent verdampt en de resterende film gevriesdroogd. Er werd vastgesteld dat de copolymeer samenstelling een invloed had op de vrijstelling uit het matrix en dat de onvolledige vrijstelling mogelijks te wijten was aan de vorming van aggregaten. Om dit verder uit te klaren onderworpen ze de stalen na bereiding en bewaring aan een screening met FTIR. Enkel in PBS-bewaarde stalen nam men een duidelijke β-sheet conformatie en dus aggregatie waar, aangezien β-sheet conformatie wijst op aggregatie. Een dissolutie experiment werd eveneens uitgevoerd bij verschillende buffer oplossingen om te controleren of deze een invloed hadden op de vrijstelling van zalm calcitonine. Hieruit bleek dat de procentuele vrijstelling in fosfaat- en acetaatbuffer respectievelijk 25% en 100% bedroeg. Deze volledige vrijstelling van zalm calcitonine in de acetaatbuffer toonde volgens de auteurs aan dat er geen aggregatie optrad mogelijks te wijten aan de afwezigheid van metaalionen Thesisonderzoek De formulatie van calcitonine blijft dus een noodzakelijke uitdaging. Vele instabiliteitsproblemen treden op en een oplossing vinden is niet altijd evident. Daarom is 9

19 het van belang de kwaliteit en stabiliteit van calcitonine in de formulatie te onderzoeken. De doelstelling van dit werk is de ontwikkeling van een stabiliteitsindicerende analytiek voor een nieuw ontwikkelde formulatievorm met een laag gehalte aan zalm calcitonine. De nadruk lag hierbij op de gehaltebepaling. De samenstelling van het nasaal poeder was als volgt (ontwikkelingsformule): TABEL 1.4: SAMENSTELLING NASAAL MIACALCIC POEDER (VOOR VRIESDROOGPROCES) Component Miacalcic 100 IU/ml (zalm calcitonine) Amioca zetmeel Carbomeer Zuiver water Natrium hydroxide (2M) Hoeveelheid IU (i.e. 480 ml) 3 g 9 g 360 ml q.s. ad ph 7.4 (ong.)(48 ml) Dit viskeus mengsel werd gelyofiliseerd en vervolgens werd het poeder gezeefd tot een deeltjesgrootte van 63 µm. Bij nasale toediening van 25 mg poeder zou er in principe 60 IU zalm calcitonine in de neusholte moeten terecht komen. Er wordt in dit onderzoek gebruik gemaakt van de IU als eenheid (en niet in massa-eenheid) omdat die klinisch veel gebruikt wordt (cfr. Tabel 1.2 dosis van de nasale sprays). Het eerste probleem is de extreem lage concentratie van zalm calcitonine in het preparaat. Volgens de Europese Pharmacopee is 1 mg zalm calcitonine equivalent aan 6000 IU wat betekent dat 60 IU overeenstemt met 10 µg zalm calcitonine per 25 mg nasaal poeder. Een goede methode om het gehalte zalm calcitonine in dit nasaal poeder te bepalen zal dus niet evident zijn. Meer nog, de mogelijke degradatieproducten en andere verwante onzuiverheden zullen in een nog lagere concentratie aanwezig zijn. Een tweede probleem is de daling van recovery van calcitonine uit het staal in functie van tijd dat in een initiële piloot-studie werd vastgesteld. Is dit te wijten aan degradatie van calcitonine met vorming van degradatieproducten, of reageert het calcitonine met de excipiënten op een irreversibele manier waardoor het niet meer wordt vrijgesteld? 10

20 2. Objectieven Het doel van dit onderzoek is een geschikte methode ontwikkelen voor de gehaltebepaling en degradatieprofilering van zalm calcitonine in een bioadhesieve polymeer-formulatie. Deze methode zal in de vrijgave van en het stabiliteitsonderzoek voor klinisch materiaal gebruikt worden. HPLC met enerzijds UV-detectie voor de gehaltebepaling, en anderzijds MS voor degradatieprofilering zal gebruikt worden. Omwille van de extreem lage concentratie calcitonine en de matrix waarin het zich bevindt, zal een goede staalvoorbereiding noodzakelijk zijn. Dit aspect werd hoofdzakelijk onderzocht m.b.v. experimentele proefopzetten zoals onion en Plackett-Burman. 11

21 3. Materiaal en Methoden 3.1 HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY Algemeen principe Vloeistof chromatografie is een analytische techniek gebruikt voor scheiding, identificatie, isolatie en kwantificatie van moleculen. Een staal wordt geïnjecteerd in het chromatografisch systeem en verder gedreven d.m.v. een pomp in de vloeibare mobiele fase langs de stationaire fase. De opgeloste substanties in het staal zullen met verschillende snelheid doorheen het chromatografisch systeem vloeien naargelang hun chemische en / of fysische interactie met de stationaire fase. Hierdoor zullen de componenten op verschillende tijdstippen elueren en dus van elkaar gescheiden worden. Deze elutietijd, beter gekend als retentietijd, wordt geregistreerd m.b.v. een detector (bijv. UV-detectie) en gebruikt ter identificatie. De detectoren gebruikt in de analyses worden verder nog belicht. Meer specifiek wordt in het thesisonderzoek gebruikt gemaakt van RP-HPLC. Hierbij wordt de mobiele fase onder hoge druk over de stationaire fase geperst, vandaar de naam High Pressure Liquid Chromatography of beter High Performance Liquid Chromatography genoemd. Naargelang de stationaire fase polair of apolair is, spreekt men respectievelijk van normale fase (normal phase = NP) en omgekeerde fase (reverse phase = RP). RP-HPLC wordt veel gebruikt voor de zuivering en analyse van proteïnen en peptiden. De reden hiertoe is de resolutie, peptiden met bijna identieke sequentie kunnen op adequate wijze van elkaar gescheiden worden: zelfs voor polypeptiden waarvan de sequentie enkel met één aminozuur verschilt! (Carr, 2002) De stationaire fase in de kolom bestaat uit deeltjes, die kunnen verschillen in chemie naargelang de soort chromatografie. Silica en chemisch gemodificeerde dragers zoals C8, C18, C6H5, CN, worden gebruikt voor respectievelijk normal- en reversed-phase terwijl polymeren met zure of base groepen gebruikt worden voor ion exchange chromatografie (IEC) en poreuze silica en polymeren voor size exclusion chromatografie (SEC). Een belangrijk aspect bij deze deeltjes zijn: deeltjesgrootte, vorm, porositeit en specifiek oppervlak. Deze 12

22 bepalen in belangrijke mate het retentiegedrag van de desbetreffende molecule. Bovendien zijn de kolomafmetingen (lengte en inwendige diameter) eveneens van belang. Voor de elutie van zalm calcitonine werd gebruik gemaakt van 2 mobiele fasen, (A) een waterige solvent en (B) een solvent met acetonitril (organische fase). Met behulp van deze fasen werd een lineaire gradiënt ingesteld waarbij de concentratie acetonitril lineair stijgt en dus het apolaire karakter van de mobiele fase toeneemt. Hierdoor zal de affiniteit van calcitonine voor de stationaire fase afnemen en vervolgens elueren. Indien deze elutietijd lang is, kan deze ingekort worden door een steilere lineaire gradiënt in te stellen. Nadat de maximale concentratie van acetonitril bereikt is, zal deze daarna terug dalen om het evenwicht te bereiken van de startcondities. Een schematisch overzicht van lineaire gradiënt wordt gegeven in Figuur 3.1. FIGUUR 3.1: SCHEMATISCH OVERZICHT VAN DE LINEAIRE GRADIENT VAN ACETONITRILE MET IN DE Y-AS DE PROCENTUELE HOEVEELHEID VAN MOBIELE FASE B MET ACETONITRIL Specificaties HPLC analyses werden uitgevoerd op een Waters HPLC system (Waters, Zellik, België). Dit systeem bevat een Waters Alliance 2695 Separations module met kolomoven en ontgasser. De gebruikte software, waarmee de chromatogrammen geïntegreerd werden, was Empower Pro software version 2. De kolom die gebruikt werd, was een Vydac Everest C EV54 ( Grace Vydac, Hesperia, U.S.A.). De kolom heeft de volgende dimensies: lengte van 250 mm, interne diameter van 4.6 mm, deeltjesgrootte van 5 µm en een poriediameter van 300 Å. 13

23 De HPLC-methode wordt gedurende de methodeontwikkeling continu veranderd zowel in samenstelling van de mobiele fase als het lineaire gradiënt programma met acetonitril. Daarom worden deze methodes besproken bij de resultaten. Het debiet en injectievolume blijven constant gedurende de ontwikkeling, deze bedragen respectievelijk 1 ml/min en 100 µl. 3.2 UV/VIS EN PDA DETECTOR De UV/VIS detector is de meest populaire detector bij vloeistofchromatografie. Het is een gevoelige detector voor moleculen die ultraviolet (UV) of zichtbaar (VIS) licht absorberen. Moleculen die niet natief UV/VIS-absorberend zijn kunnen eerst gederivatiseerd worden tot een UV/VIS-absorberend derivaat bijv. met ninhydrine. Als enige voorzorg moet er rekening gehouden worden dat het oplosmiddel UV-transparant dient te zijn. De belangrijkste onderdelen van deze UV/VIS detector zijn: een lichtbron (deuterium lamp) met bijhorende optische onderdelen die het licht focussen naar de cuvet, een monochromator, een doorstroom microcuvet en een detector. De lichtbron zendt polychromatisch licht uit waarbij de monochromator een welbepaalde golflengte selecteert. Dit licht bereikt de microcuvet waarbij de componenten in het eluens het licht zullen absorberen. De intensiteit van het resterende licht wordt gemeten door de detector. Voor de analyses werd gebruik gemaakt van een Waters Alliance 2487 Dual λ Absorbance UV/VIS detector. De Photo Diode Array (PDA) detector (of DAD) biedt de mogelijkheid om over een bepaald golflengtegebied een absorptiespectrum op te nemen, dit in tegenstelling tot de UV/VIS detector die in principe slechts metingen doet bij één welbepaalde golflengte. De belangrijkste onderdelen van de PDA detector zijn: een stralingsbron (deuterium lamp met bijhorende optische onderdelen die het licht focussen richting de cuvet), beamsplitter, een flow cel en de diode array detector (DAD). Deze DAD bevat een diode array die bestaat uit 512 lichtgevoelige fotodiodes, deze meten elk de hoeveelheid doorgelaten licht bij een specifiek golflengte interval. De hoeveelheid gemeten licht wordt vervolgens omgezet tot een elektrisch signaal. Hierdoor wordt een spectrum verkregen van de verschillende golflengtes. Bij de analyses werd gebruik gemaakt van een Waters 2996 photodiode array detector. 14

24 3.3 MASSASPECTROSCOPIE Algemeen principe Massaspectroscopie is een techniek die gebruikt wordt voor structuurbevestiging/- opheldering. Kwantificatie is ook mogelijk: dit wordt eerder massaspectrometrie genoemd. MS is gebaseerd op vorming van ionen in een ionisatieproces (bv. met elektronenspray ionisatie). Deze ionen worden vervolgens gescheiden volgens massa-over-ladingverhouding (m/z) in de x-as met de relatieve hoeveelheid (meestal in %) waarin elke soort ionen voorkomen als y-as (massaspectrum). Het is een gevoelige, veelzijdige, informatierijke en selectieve techniek waarbij zelfs isotopen kunnen onderscheiden worden van elkaar. De belangrijkste onderdelen van de massaspectrometer zijn: een inlaat, een ionenbron, een massafilter en een detector. Een overzicht is weergegeven in Figuur 3.2. FIGUUR 3.2: VEREENVOUDIGDE VOORSTELLING VAN DE MASSASPECTROMETER De moleculen worden geïoniseerd met Elektrospray Ionisatie (ESI). Dit is een zachte vorm van ionisatie waarbij de fragmentatie tot een minimum wordt beperkt. Hierdoor zijn in het spectrum hoofdzakelijk de moleculair ionen aanwezig. Een schematische voorstelling van de elektrospray ionisatie is weergegeven in Figuur 3.3. Het HPLC effluent vloeit uit de kolom door een capillair waarop een potentiaal is aangebracht. Afhankelijk of de component positief of negatief geladen is, zal de lading van de potentiaal respectievelijk positief of negatief zijn waardoor een grote afstotingskracht optreedt. De uittredende oplossing zal dispergeren in kleinere druppeltjes doordat het solvent verdampt, geholpen door een drooggas N 2. De afmeting van de druppels verkleint en de ladingsconcentratie aan de oppervlakte neemt toe. Hierbij treden ook nog eens 15

25 Coulombse repulsiekrachten op, de oppervlaktespanning van de druppels wordt overtroffen waardoor de druppels exploderen tot kleinere druppeltjes. Het proces van exploderen en verdampen van solvent gaat door tot er enkel individueel geladen ionen in de gasfase overblijven. Na dit proces worden de ionen verder geleid naar de massafilter. FIGUUR 3.3: ELEKTROSPRAY IONISATIE (ESI) Deze massafilter, in ons geval een ion trap, zal de ionen scheiden volgens hun m/zverhouding. Een schematische voorstelling van de ion trap wordt weergegeven in Figuur 3.4. De ion trap is opgebouwd uit 3 elektroden: 2 elektrodes naar elkaar gericht met daartussen een ringelektrode. Op deze elektrodes wordt een bepaalde gelijkstroomspanning en radiofrequentie aangelegd waardoor een elektrisch veld gecreëerd wordt waarin de ionen met bepaalde m/z-waarde gevangen zitten. De beweging van deze ionen is afhankelijk van zowel het elektrisch/magnetisch veld als hun m/z-verhouding. Door het elektrisch/magnetisch veld gecontroleerd te variëren zullen ionen met bepaalde m/z-waarde onstabiel worden en bijgevolg de ion trap verlaten. Tot slot bereiken de ionen de detector, deze geeft een elektrisch signaal dat rechtevenredig is met het aantal invallende ionen waardoor een spectrum wordt geregistreerd. Voor de registratie van een massaspectrum werd er gebruik gemaakt van Single/selected Ion Monitoring (SIM). SIM betekent dat de intensiteit van één of een beperkt 16

26 aantal m/z-waarden wordt geregistreerd omdat enkel één of een beperkt aantal m/zwaarden worden doorgelaten naar de detector. De gevoeligheid van de detectie is hierbij groter in tegenstelling tot de scan-modus (registratie van alle m/z-waarden). Dit is te verklaren doordat de massaspectrometer meer tijd per m/z-waarde spendeert en hierdoor meer ionen kan registeren, alsook dat de achtergrondsruis vermindert. FIGUUR 3.4: SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE ION TRAP Specificaties LC-MS analyses werden uitgevoerd met een Thermo HPLC system (Thermo Finnigin, Brussel, België). Deze HPLC is uitgerust met een Thermo Spectra System SN4000 interface, Thermo Spectra System SCM1000 ontgasser, Thermo Spectra System P1000XR pomp en Thermo Spectra System AS3000 autosampler. De detectie gebeurde met een Waters 2487 dual wavelength UV detector (Waters, Zellik, België) ingesteld op 195 nm. De HPLC is gekoppeld aan een Finnigan LCQ ion trap massaspectrometer met elektronenspray ionisatie (ESI). De gebruikte software was Xcalibur version 2.0. Er werd een Vydac Everest C EV54 kolom (250 mm 4.6 mm, 5 µm deeltjesgrootte, 300Å) ( Grace Vydac, Hesperia, U.S.A ) gebruikt met guardkolom in een oven bij 30 C met mobiele fase bestaande uit 0.1 % m/v mierenzuur in water (mobiele fase A) en 0.1 % m/v mierenzuur in acetonitril (mobiele fase B). Het debiet werd vastgelegd bij

27 ml/min. De gradiënt die gebruikt werd, wordt weergegeven in Tabel 3.1. Deze instellingen bleven constant gedurende de ontwikkeling van een methode voor degradatieprofilering. TABEL 3.1: GRADIENTPROGRAMMA LC-MS METHODE Tijd (min) Solvent samenstelling %A %B ANDERE TOESTELLEN Voor nauwkeurige afwegingen bij de bereiding van stalen werd een Mettler Toledo XS105 Dualrange (Mettler Toledo, Zaventem, België) gebruikt. Deze heeft een afleesbaarheid tot op 0.01 mg. Vortexen van de stalen gebeurde met een vortex mixer (Voor t Labo, Eeklo, België). De stalen werden gemixt al dan niet bij verhoogde temperatuur in een Eppendorf thermomixer comfort (Voor t Labo, Eeklo, België). Centrifugeren gebeurde met de Centrifuge 5417R Eppendorf (Voor t Labo, Eeklo, België). 18

28 4. Resultaten 4.1 GEHALTEBEPALING: PILOOT EXPERIMENT Als initiële test met betrekking tot de methodeontwikkeling voor de gehaltebepaling van zalm calcitonine in het nasale poeder, met Miacalcic als referentie, werd volgende testoplossing bereid: mg van het nasale poeder werd overgebracht in een ml maatkolf en verdund met water. Nadien werd het mengsel goed gemengd tot een homogene suspensie werd verkregen. Hieraan werd 1.00 ml mierenzuur toegevoegd. Het geheel werd nadien opnieuw geschud. Na centrifugatie bij 3000 g gedurende 5 minuten werd het supernatans geïnjecteerd op een HPLC systeem onder standaard condities voor peptide analyses in het algemeen: zie Tabel 4.1. TABEL 4.1: ALGEMENE STANDAARD CONDITIES VOOR PEPTIDEN ANALYSES Parameter Specificatie Kolom Everest C 18 (300 Å), mm, 5 µm Guard kolom Everest C 18 (300 Å), guard kolom, 5 µm Kolomtemperatuur 30 C - Solvent A: 0.1% m/v mierenzuur in water. Mobiele fase - Solvent B: 0.1% m/v mierenzuur in acetonitril. Solvent samenstelling Tijd (min) %A %B Gradiëntprogramma Debiet 1 ml/min injectievolume 100 µl Injectienaald solvent Extractiesolvent - PDA = 190 nm tot 400 nm Detectie - Fluorescentie: λ EX = 230 nm; λ EM = nm 19

29 Op basis van de bekomen chromatogrammen, werd een gehalte van IU/mg berekend, wat overeenkomt met slechts 27.84% op basis van een labelclaim van IU/mg. Verdere ontwikkeling van de methode met nadruk op staalvoorbereiding is dus noodzakelijk om een hogere recovery van zalm calcitonine uit de polymeer matrix te verkrijgen. Gezien de relatief lange elutietijd van zalm calcitonine (33.46 minuten), werd beslist het gradiënt programma aan te passen om de analysetijd in te korten (Tabel 4.2). De pieken van zalm calcitonine waren daarenboven niet symmetrisch en vertoonden sterk tailing: verbetering hiervan zou wenselijk zijn. 4.2 OPTIMALISATIE VAN DE HPLC METHODE Beschrijving experimenten Om een betere chromatografie te verkrijgen werden analyses uitgevoerd met TFA als zuur in de mobiele fase. Deze nieuwe mobiele fase met TFA bestond uit: (A) 0.1% V/V TFA in water en (B) 0.085% V/V TFA in acetonitril. De gradiënt werd ingesteld zoals weergegeven in Tabel 4.2. Dezelfde zalm calcitonine oplossing werd geanalyseerd met beide methoden (detectie met UV bij 195 nm). Aansluitend werden bijkomende analyses uitgevoerd om het effect na te gaan van de kolomtemperatuur (30 C, 37.5 C, 45 C) met de TFA-HPLC methode. TABEL 4.2: GRADIENT PROGRAMMA FA-METHODE / TFA-METHODE Tijd (min) Solvent samenstelling met FA Tijd (min) Solvent samenstelling met TFA %A %B %A %B Om het resultaat te beoordelen werden chromatografische karakteristieken zoals: symmetriefactor, plaatgetal, resolutie, piek-tot-dal verhouding en piekcapaciteit berekend. De gebruikte formules zijn als volgt: 20

30 As = b 0.05 / 2A (4.1) Waarin: As: symmetriefactor b 0.05 : piekbreedte op 1/20 van de hoogte (min) A: afstand van de perpendiculaire lijn uit het maximum van de piek tot aan de leading edge op 1/20 van de hoogte (min) N a = 5.54 (t r / b 1/2 )² (4.2) waarin: N a : apparent plaatgetal t r : retentietijd (min) b 1/2 : piekbreedte op halve hoogte (min) R s = 1.18 (t R2 t R1 ) / (w h1 + w h2 ) (4.3) waarin: R s : resolutie t R : retentietijd (min) w h : piekbreedte op halve hoogte (min) N g 16 (t 0 ( k*) / w)². (4.4) waarin: N g : plaatgetal (rekening houdend met gradiënt) t 0 : doodvolume (min) w: piekbreedte op basislijn (min) k* = t g F /(1.15 V m ΔФ S) waarin : t g : gradiënt tijd (min) F: debiet (ml/min) V m : L dc ² waarin: L: lengte kolom (mm) dc: diameter kolom (mm) ΔФ: gradiënt verschil S = 0.25 (Mw) 1/2 waarin: Mw: Moleculair gewicht (g/mol) 21

31 p/v = H kleine / H dal (4.5) waarin: p/v : piek-tot-dal verhouding H kleine : piekhoogte van de kleinste piek (UA) H dal : dalhoogte tussen de 2 pieken (UA) PC = (t G /w) +1 (4.6) waarin: PC: piekcapaciteit t G : gradiënt tijd (min) w: breedte van de piek op de basislijn (min) Resultaten HPLC methode optimalisatie TABEL 4.3: OVERZICHT CHROMATOGRAFISCHE KARAKTERISTIEKEN Zuur / Kolomtemperatuur Parameter Mierenzuur Trifluorazijnzuur 30 C 30 C 37.5 C 45 C QR 275 (1) QR 276 (1) Piekoppervlakte (zalm calcitonine) Piekoppervlakte (zalm calcitonine + onzuiverheden) Symmetriefactor (zalm calcitonine) Apparent plaatgetal = N a (zalm calcitonine) (2) Plaatgetal = N g (zalm calcitonine) Resolutie sct vs RRT Resolutie sct vs RRT 1.09 (4) (3) Resolutie sct vs RRT Piek-tot-dal verhouding (zalm calcitonine vs RRT 1.09) (4) Piekcapaciteit RRT = Relatieve retentietijd Grenswaarde voor rapportering van onzuiverheden bij UV detectie lag bij de 10%. (1) Dit is het QR nummer van de HPLC toestellen want verschillende toestellen werden gebruikt. (2) Er werden geen onzuiverheden gedetecteerd, daarom is deze waarde identiek aan de piekoppervlakte van zalm calcitonine. (3) Er werden geen andere pieken gedetecteerd. (4) De onzuiverheid met RRT = 1.09 was te klein om een breedte op halve hoogte en piekhoogte te verkrijgen, met als gevolg dat resolutie en piekcapaciteit niet konden berekend worden. 22

32 Indien we enkel het effect van het zuur in de mobiele fase observeren, zien we dat het zuur TFA een veel hogere piekcapaciteit en hogere plaatgetallen (N a en N g ) heeft. Bovendien zijn de pieken meer symmetrisch in tegenstelling tot FA als zuur in de mobiele fase. Bij de analyses met TFA wordt bij 37.5 C en 45 C een zeker plateau bereikt met hoge waarden voor de plaatgetallen (N a en N g ) en piekcapaciteit. Een relatief hogere kolomtemperatuur resulteert dus in een betere chromatografie. Omdat 45 C nogal hoog is en we geen enkel risico willen lopen tot het on-line vormen van afbraakproducten, wordt 40 C (tussen de experimentele punten 37.5 C en 45 C) als definitieve kolomtemperatuur genomen voor verdere analyses met TFA als zuur in de mobiele fase. 4.3 STAALBEHANDELING De resultaten van de initiële methode voor gehaltebepaling toonden aan dat een betere staalvoorbereiding noodzakelijk is aangezien het weergevonden gehalte calcitonine slechts 27.84% van de theoretische bedroeg. Een betere extractie van calcitonine uit het polymeer matrix moet bereikt worden. Verder dient nagegaan te worden of externe kalibratie boven standaardadditie te verkiezen valt. Om dit verder uit te klaren zullen beide methodes gebruikt worden bij de optimalisatie van de staalvoorbereiding FA-gebaseerde optimalisatie Om de staalvoorbereiding te optimaliseren werd gebruik gemaakt van een Plackett- Burman design om de effecten van de extractievariabelen te evalueren. Hierbij werden extractievariabelen onderzocht die mogelijks een invloed hadden op de recovery van zalm calcitonine uit de polymeer matrix. Deze mogelijke extractievariabelen staan opgelijst in Tabel 4.4 met hun bijhorende niveaus. Er werden 11 variabelen gebruikt in het design: 6 extractievariabelen en 5 dummy variabelen. Het toegepaste Plackett-Burman design is weergegeven in Tabel 4.5. In deze tabel stelt elke rij een experiment voor en elke kolom een verschillende variabele. 23

33 TABEL 4.4: OVERZICHT VAN DE FACTOREN VOOR HET PLACKETT-BURMAN DESIGN Factor # Parameter Niveaus - + A HPβCD (mg/ml) 0 10 B Temperatuur ( C) C Tijd (uur) 1 2 D Aantal stappen 1 2 E Mix snelheid (rpm) F Mierenzuur (% V/V) 1 5 HPβCD = hydroxypropyl-β-cyclodextrine TABEL 4.5: TOEGEPAST PLACKETT-BURMAN DESIGN Exp. # Factoren A d1 B d2 C d3 D d4 E d5 F Met A, B, C, D, E en F de factoren zoals beschreven in Tabel 4.4 met bijhorende levels. d1, d2, d3, d4 en d5 stellen de 5 dummy factoren van het Plackett-Burman design voor. De experimenten werden toegepast op 3 verschillende stalen (allen met zelfde hoeveelheid vaste stof en eindvolume): (1) test staal: zalm calcitonine drug poeder + water, (2) standaard-additie test staal: zalm calcitonine drug poeder + Miacalcic 80 IU, (3) spiked placebo staal: placebo poeder (amioca zetmeel + carbomeer) + Miacalcic 80 IU (het placebo poeder bootste de matrix van het drug poeder na, maar is niet geneutraliseerd met NaOH). 24

34 De responsen die in het design gebruikt werden, waren de volgende: (1) de piekoppervlakten van zalm calcitonine, (2) de recovery van zalm calcitonine. Deze recovery werd op verschillende wijze berekend: a. door externe kalibratie met Miacalcic referentie om de % labelclaim van het drug product en standaardadditie product te berekenen; en ingeval van de spiked placebo s % recovery. b. met standaardadditie berekeningen Bereiding van de oplossingen Algemene bereidingswijze: Voor het test staal en standaard-additie staal werd ongeveer mg drug poeder accuraat afgewogen. In geval van de spiked placebo stalen werd er mg amioca zetmeel carbomeer mengsel afgewogen. Daaraan werd vervolgens 800 µl Miacalcic 100 IU/ml of 800 µl water (in geval van het test staal), 600 µl water en 100 µl HPβCD oplossing of water toegevoegd. Het mengsel werd gemengd tot een volledig homogene dispersie verkregen was. In geval van een 2-staps staalvoorbereiding werden deze stalen geïncubeerd bij de temperatuur en mixsnelheid beschreven zoals Tabel 4.5 gedurende de helft van de beschreven tijd. Vervolgens werd er 100 µl van de beschreven mierenzuuroplossing toegevoegd, de stalen werden geïncubeerd op de beschreven duur, temperatuur en mixsnelheid van Tabel 4.5 (en voor 2-staps staalvoorbereiding gedurende de helft van de duur). Nadat de stalen afgekoeld waren tot kamertemperatuur werden ze gecentrifugeerd bij g gedurende 15 minuten, het supernatans werd geïnjecteerd op de HPLC met UVdetectie bij 195 nm gebruik makend van de FA-HPLC methode. (Aangezien het experiment met TFA als zuur in de mobiele fase slechts nadien werd uitgevoerd.) HPβCD oplossing: Deze oplossing werd aangemaakt door mg hydroxypropyl-β-cyclodextrine op te lossen met ml water. Mierenzuuroplossing (1 1600/100 = 16% V/V, /100 = 80% V/V): Er werd respectievelijk 4.00 ml en 5.00 ml mierenzuur overgebracht in een ml maatkolf en aangelengd met water tot aan de ijkstreep. Referentie oplossing (100%): 800 µl Miacalcic 100 IU/ml gemengd met 800 µl water. 25

35 Evaluatie van het Plackett-Burman design De resultaten van de recovery zijn weergegeven in Tabel 4.6. Om het effect van elke extractievariabele te observeren werd het effect van elke factor berekend volgens Vergelijking (4.7). Deze effecten zijn weergegeven in Tabel 4.7. De factoren die significant zijn (p < 0.05) worden weergegeven in het vet. Deze significantie kan men duidelijk zien aan de grootte van het effect in vergelijking met de kritische E-waarde, indien deze hoger is, duidt dit op een significant effect. ( (response waarde van + levels) (response waarde van ) 1 Effect = levels) (4.7) 6 (1) (2) (3) Exp. # Gehalte (1) (% LC) TABEL 4.6: OVERZICHT VAN DE RECOVERY Gehalte (2) (% LC) Recovery Stand. additie (3) (%) Recovery (4) (%) Staal Test staal Test staal + Miacalcic 80 IU Spiked placebo Berekenings wijze (4) Externe kalibratie. Stand. additie (incl. data test staal) Externe kalibratie Externe kalibratie Gemiddelde (%) Gehalte calcitonine van het test staal werd berekend door externe kalibratie als volgt: (piekoppervlakte van het test staal) (50 IU/ml 1.6 ml 100) /[2.389 IU/mg (piekoppervlakte van de referentie oplossing) (massa in mg van het poeder gebruikt voor de bereiding van het test staal)]. Gehalte calcitonine van het nasale poeder van het test staal werd berekend door middel van standaard additie als volgt: (piekoppervlakte van test staal) (100 IU/ml 0.8 ml 100) / IU/mg { (piekoppervlakte van test standaard-additie staal) [(piekoppervlakte van test staal) (massa van poeder van gebruikt voor bereiding van test standaard-additie staal) / (massa van poeder gebruikt voor de bereiding van test staal)]} (massa van poeder gebruikt voor de bereiding van het test staal). Recovery voor de standaard-additie hoeveelheid werd berekend met externe kalibratie als volgt: {(piekoppervlakte van standaard-additie staal) [(Piekoppervlakte van test staal) (massa poeder gebruikt voor de bereiding van het test standaard-additie staal) / (massa van het poeder gebruikt voor de bereiding van het test staal)]} 100 /(piekoppervlakte van de referentie oplossing). Recovery van de spiked placebo oplossingen werd berekend door externe kalibratie als volgt: (piekoppervlakte van de spiked placebo) 100 /(piekoppervlakte van de referentie oplossing). 26

36 Experiment 11 levert over alle resultaten de hoogste gehaltes zalm calcitonine op gevolgd door experimenten 8, 10 en 2. Deze experimenten bevatten steeds de hoogste concentratie mierenzuur (5% V/V). Indien we de factoren statistisch evalueren kunnen we zien dat hydroxypropyl-βcyclodextrine, temperatuur, extractieduur, het aantal stappen tijdens de extractie en mix snelheid geen statistisch significant effect hebben op het gehalte en de recovery (Tabel 4.7). Mierenzuur daarentegen heeft wel een statistisch significant effect: 5% V/V mierenzuur leidt tot hogere gehaltes calcitonine en een hogere recovery dan 1% V/V (positieve effectwaarde). Een grafische voorstelling van de effecten per factor (inclusief dummy factoren) wordt gegeven d.m.v. boxplots in Figuur 4.1, waarin duidelijk te zien is dat het effect van mierenzuur significant hoger is dan het effect van alle andere factoren. TABEL 4.7: EFFECTEN VAN DE FACTOREN (INCLUSIEF DUMMIES) VOOR DE RECOVERY Factor Recovery Gehalte (% LC) Gehalte (% LC) Stand. additie (%) Recovery (%) Berekeningswijze Ext. cal. St. add. Ext. cal. Ext. cal. HPβCD Dummy Temperatuur Dummy Tijd Dummy Aantal stappen Dummy Mix snelheid Dummy Mierenzuur E critical [p=0.05] E critical [p=0.1]

37 FIGUUR 4.1 BOXPLOTS VAN ELKE FACTOR Evaluatie van de FA als zuur voor de staalvoorbereiding Hoewel er enkele stalen zijn waarbij hoge gehaltes calcitonine verkregen zijn, liggen de recovery waarden toch beneden de verwachtingen. Het zou kunnen dat dit veroorzaakt wordt door elektrostatische aantrekkingskrachten tussen zalm calcitonine en de carboxylfuncties van het carbomeer. Daarom werd overgegaan tot een sterker zuur bij de staalvoorbereiding, nl. trifluorazijnzuur (TFA). TFA heeft een pka = 0.3 en is een sterker zuur dan FA met een pka = TFA-gebaseerd proefopzet (1) onion design Met TFA in de staalvoorbereiding beogen we een hogere recovery te behalen. Bij de ontwikkeling van deze nieuwe staalvoorbereiding is ook de analytische stabiliteit eveneens van groot belang, we willen immers geen afbraken creëren tijdens de staalbehandeling. Om dit te bereiken werd een kwadratisch onion design als proefopzet gebruikt. 28

38 Het onion proefopzet Er werd gekozen voor een onion design omdat de experimentele ruimte heel groot is, een kwadratisch model bekomen kan worden en het aantal experimenten toch beperkt is. Het aantal experimenten wordt bepaald door zowel het aantal lagen als het model van de lagen. Een design in lagen biedt het voordeel om volledig controle te hebben over zowel het model als de experimentele ruimte. Met dit design werd gezocht naar de beste staalvoorbereiding. Hier werd niet gestreefd naar het optimum van elke variabele maar een optimum dat rekening hield met interacties die kunnen optreden tussen de verschillende variabelen. De variabelen die we onderzochten staan opgelijst in Tabel 4.8 met hun bijhorende range, zijnde de laagste en hoogste waarde die de variabele mocht aannemen. De stalen die werden gebruikt in het design zijn spiked placebo oplossingen. Dit zijn oplossingen van placebo (amioca zetmeel + carbomeer) poeder met toevoeging van 60 IU Miacalcic. De responsen van het onion model waren: piekoppervlakte van zalm calcitonine, de absolute recovery van zalm calcitonine en de som van onzuiverheden gedetecteerd met HPLC-MS en HPLC-UV. De identificatie van de onzuiverheden werd uitgevoerd door SIM. Er werd geopteerd voor een onion design met 2 lagen, op die manier hielden we het aantal runs beperkt, omwille van economische redenen (kost van het zalm calcitonine). Modde 8 werd gebruikt voor de interpretatie en grafische voorstelling van de resultaten. TABEL 4.8: VARIABELEN MET HUN RESPECTIEVELIJKE KWANTITATIEVE RANGES Factor # Variabele Laagste Range Hoogste A Concentratie TFA (% V/V) B Temperatuur ( C) C Incubatietijd (min)

39 TABEL 4.9: TOEGEPAST ONION DESIGN MET 16 EXPERIMENTEN Exp. # Niveaus van de factoren Concentratie TFA (% V/V) Temperatuur ( C) Incubatietijd (min) Bereiding van de oplossingen Algemene procedure om de 16 spiked placebo stalen te maken: Ongeveer mg amioca zetmeel carbopol mengsel werd accuraat afgewogen en overgebracht in een 2 ml LoBind Eppendorf buisje. Hieraan werd 400 µl water en 600 µl Miacalcic 100 IU/ml toegevoegd, het geheel werd gemengd tot een homogene dispersie werd bereikt. Vervolgens werd er 600 µl van de corresponderende TFA oplossing toegevoegd en de oplossing werd geïncubeerd bij temperatuur en tijd zoals hierboven wordt aangegeven. Nadien werden de oplossingen gecentrifugeerd gedurende 15 minuten op een snelheid van g. Het supernatans werd overgebracht in zowel total recovery vials voor injectie in de HPLC-UV als in screw top vials met een insert van 150 µl voor injectie in de LC- MS. De HPLC-UV gebruikt TFA als zuur in de mobiele fase zoals beschreven in 4.2 invloed zuren in HPLC solvens. De HPLC-MS maakt gebruik van mierenzuur in de mobiele fase zoals werd beschreven in materiaal & methoden. 30

40 TFA oplossingen: Deze werden bereid als volgt: 135 µl, 350 µl, 565 µl, 800 µl en 1000 µl TFA werden respectievelijk overgebracht in een 50 ml maatkolf en aangelengd tot aan de ijkstreep met water om TFA oplossingen te bekomen van 0.267% V/V, 0.700% V/V, 1.133% V/V, 1.567% V/V, 2.000% V/V. Deze oplossingen komen niet overeen met de concentraties beschreven in Tabel 4.9, dit is te wijten aan de verdunning die optreedt wanneer 600 µl TFA oplossing wordt toegevoegd aan 1000 µl oplossing. Als referentie wordt er 600 µl Miacalcic 100 IU/ml toegevoegd aan 1000 µl water in een 2 ml LoBind Eppendorf buisje Resultaat van de responsen Behalve voor 2 gedeamideerde calcitonine verwante verbindingen in testoplossing 8 en 12 werden geen extra onzuiverheden gevonden in de chromatogrammen wanneer we de testoplossingen vergeleken met de referentie oplossing (zowel gedetecteerd door UV als MS). De testoplossing 12 werd bekomen bij de meest extreme niveau s van elk van de drie variabelen (nl. 0.75% V/V TFA, 70 C en 90 minuten) van de staalbehandeling. Testoplossing 8 verschilde van testoplossing 12 enkel in een kortere tijd (30 minuten). Deze onzuiverheden werden kwantitatief geschat op respectievelijk 7.3% (opl. 8) en 13.4% (opl. 12) (gebaseerd op massaspectrum met SIM m/z) wanneer we gebruik maken van piekoppervlakte normalisatie relatief aan de som van alle piekoppervlakten (zalm calcitonine en gedeamideerd calcitonine). De MS chromatogrammen van testoplossing 1 (zonder afbraakproducten) en testoplossing 12 (met gedeamideerd calcitonine product) zijn weergegeven in Figuur 4.2. Een overzicht van alle responsen gebruikmakend van HPLC-UV en HPLC-MS wordt weergegeven in Tabel

41 FIGUUR 4.2: MS CHROMATOGRAM VOOR TESTOPLOSSING 1 EN 12 TABEL 4.10: OVERZICHT VAN DE RESPONSEN Soort oplossing Piekopp. (µau.s) Recovery (1) (%) Onzuiverheden (2) (%) Referentie oplossing Niet toepasbaar Test oplossing Test oplossing Test oplossing Test oplossing Beneden grenswaarde voor rapportering Test oplossing Test oplossing Test oplossing Test oplossing Test oplossing Test oplossing Test oplossing Beneden grenswaarde voor rapportering Test oplossing Test oplossing Test oplossing Test oplossing Beneden grenswaarde voor rapportering Test oplossing De grenswaarde voor rapportering in deze experimenten bedraagt voor HPLC-UV 10% en voor HPLC-MS 0.2%. (1) Recovery werd met UV respons berekend als volgt: (Piekoppervlakte zalm calcitonine test oplossing / Piekoppervlakte zalm calcitonine referentie oplossing) 100. (2) Onzuiverheden (%) werden berekend met MS respons gebruikmakend van piekoppervlakte normalisatie relatief aan de som van alle piekoppervlakten (calcitonine en onzuiverheden). 32

42 Fitten van het model met PLS Om voorspellingen te kunnen maken en het optimum te zoeken dienden de resultaten van het design eerst in een model gegoten te worden. Verschillende wiskundige technieken zijn mogelijk, o.a. PLS (partial least squares) of MLR (multiple linear regression). Bij dit model worden dan eventuele interacties of tweedegraadseffecten verwijderd die niet significant zijn, op basis van hun p-waarde. Vertrekkend van het startmodel die alle interacties en tweedegraadstermen bevat werd deze dus verfijnd door tweedegraadseffecten (temperatuur*temperatuur en tijd*tijd), interacties (concentratie*temperatuur, concentratie*tijd en temperatuur*tijd) en factor incubatietijd te verwijderen op basis van hun p-waarden die groter was dan 0,05. Omdat er slechts in 2 testoplossingen onzuiverheden gedetecteerd waren, kon er geen goed model gemaakt worden voor deze respons. De niveau s waarbij er onzuiverheden gevormd werden worden in gedachten gehouden om uiteindelijk een zo goed mogelijke conclusie te trekken uit dit design Mathematisch model Het bekomen mathematische model is weergegeven in Tabel Een tweede model werd opgesteld met één afwijkende experimentele waarde als robuustheids test: testoplossing 4 werd als recovery respons 61.2% toegekend i.p.v. 94.2%. De reden om deze testoplossing die afwijkende waarde te geven was door een aantal herhalingsexperimenten van een aantal experimentele punten uit te voeren, waarbij enkel voor testoplossing 4 deze afwijkende waarde werd gevonden. Dit model wordt weergegeven in Tabel Aan de hand van deze modellen krijgen we een eerste indruk over de impact van elke extractievariabele op het gehalte zalm calcitonine. Omdat de coëfficiënten gecentreerd en geschaald zijn, kan de invloed van elke factor vergeleken worden t.o.v. elkaar. De invloed van temperatuur is hier beduidend hoger in vergelijking met de andere factoren. 33

43 TABEL 4.11: MATHEMATISCH MODEL VOOR DE RESPONSE RECOVERY Termen Gecentreerde & geschaalde factoren Coëfficiënten Ongeschaalde factoren P-waarde (1) Constante < 0.01 Concentratie Temperatuur < 0.01 Conc*conc (1) Deze P-waarde toont de significantie van elke factor aan. TABEL 4.12: MATHEMATISCH MODEL VOOR DE RESPONSE RECOVERY ( SIMULATIE MET 1 AFWIJKENDE EXPERIMENTELE WAARDE ) Termen Gecentreerde & geschaalde factoren Coëfficiënten Ongeschaalde factoren P-waarde (1) Constante < 0.01 Concentratie Temperatuur < 0.01 Conc*conc werd hier uit het mathematisch model verwijderd omdat deze niet significant is. (P-waarde = 0.24) (1) Deze P-waarde toont de significantie van elke factor aan Evaluatie van het onion design Om de beste staalvoorbereiding parameters te definiëren werden de effecten van elke factor berekend. Hiervoor werd er een statistisch significant effect (p < 0.05) gevonden voor temperatuur en concentratie TFA. De incubatietijd in ons finaal model bleek niet significant te zijn en werd vastgelegd bij 45 minuten. Omdat we niet over recovery gegevens beschikken bij incubatietijden lager dan 30 minuten, hebben we geen zekerheid dat 30 minuten incubatietijd leidt tot een robuuste staalvoorbereiding in tegenstelling tot 60 minuten. Vandaar werd de intermediaire waarde van 45 minuten gekozen. De contourplots van recovery bij de incubatietijd van 45 minuten werden weergegeven in Figuur 4.3 en 4.4. Hier worden de 2 significante variabelen, temperatuur en concentratie TFA, weergegeven. De kruisjes die weergegeven zijn in de figuren stellen experiment 8 en 12 voor waarbij onzuiverheden werden waargenomen. Aangezien we met dit design eveneens een stabiele analysemethode willen ontwikkelen, zullen we 34

44 voorzichtigheidshalve rekening houden met deze punten. De onzuiverheden die gevormd werden bij experiment 8 en 12 waren bij de hoogste niveaus van de factoren. Hierdoor werd ons optimum van recovery gekozen bij zachtere condities. Op die manier was er een zekere veiligheidsmarge tussen de optimale staalvoorbereiding en de staalvoorbereiding die mogelijks leidde tot afbraakproducten. De meest robuuste conditie om een recovery van min. 95% te verkrijgen werden vervolgens uit Figuur 4.3 gehaald. Voor dit model (Figuur 4.3) en voor het gesimuleerde model (Figuur 4.4) waren de extractievariabelen bij het gekozen optimum respectievelijk: 0.55% V/V TFA - 55 C en 0.58% V/V TFA 62 C. Beide berekende optimale condities liggen relatief dicht bij elkaar. FIGUUR 4.3: CONTOURPLOT GEHALTE (RECOVERY %) BIJ 45 MIN. FIGUUR 4.4: CONTOURPLOT GEHALTE (RECOVERY %) BIJ 45 MIN. (GESIMULEERD MODEL) 35