Snelle moleculaire diagnostiek virologie

Transcriptie

1 Snelle moleculaire diagnostiek virologie Kurt Beuselinck CEMOL LabA (microbiologie) November 2016

2 Snelle moleculaire diagnostiek microbiologie Inleiding Waarom / hoe? Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven Snellere moleculaire diagnostiek in het labo Kort overzicht Point of care / Point-of impact toestellen & analyses Toestel hardware Reagentia / Analyse-verloop Werkwijze / manuele handelingen Testaanbod: huidig en nabije toekomst Resultaten / studies van het huidig testaanbod

3 Snelle moleculaire diagnostiek microbiologie: waarom? Verbeteren patiënten management. Vermijden van secundaire verspreiding infecties Vermijden van onnodig antibiotica gebruik Betere en tijdige behandeling Kostenreductie door het vermijden van onnodige testen Verkorten ziekenhuisverblijf

4 Snelle moleculaire diagnostiek microbiologie: hoe? Analyse bestaande uit 4 stappen: Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Verkorten analysetijd: Snellere procedures per stap Integratie van meerdere stappen in één (Automatisatie van één of meerdere stappen)

5 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven Stijgend stalenaantal Vast personeelskader Kortere antwoordtijd (TAT)

6 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven 1994 Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Manueel: fenol/chloroform Manueel: COBAS Ampliprep CT/NG Manueel: kolom (QIAGEN) Manueel PE 9600 Electroforese (PAGE) GeneAmp 9700 ELISA (probe detectie): ES300 COBAS amplicor CT/NG: PCR + ELISA Signaal-amplificatie: bdna (Chiron) (HIV-VL) Hybrid Capture (Digene HPV) minimum TAT: 8 uur

7 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven 2000 Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Manueel: kolom (QIAGEN) Manueel Real-time PCR ABI7900 ABI7500 minimum TAT: 6 uur

8 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven 2006 Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Semi-automatisch: easymag Manueel Real-time PCR ABI7900 ABI7500 Automatisch: extractie + PCR set-up Real-time PCR m1000/ m2000sp (Abbott) m2000rt (Abbott) minimum TAT: 6 uur

9 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven 2007 Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Semi-automatisch: easymag Manueel Real-time PCR ABI7900 ABI7500 Fast Real-time PCR SmartCycler minimum TAT: 5 uur

10 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven 2009 Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Semi-automatisch: easymag Manueel Fast Real-time PCR ABI7900Fast Fast Real-time PCR SmartCycler minimum TAT: 5 uur

11 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven 2009 Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Automatisch: GeneXpert (Cepheid) MRSA (2009) Enterovirus (weekend) (2012) MTB-Rif (2012) vana / vanb (2013) minimum TAT: 1,5 2,5 uur

12 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven 2013 Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Automatisch: Qiasymphony SP/AS Fast Real-time PCR EDTA-bloed (transplant parameters) ABI7900Fast QuantStudio Dx minimum TAT: 5 uur

13 Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven 2014 Staalvoorbereiding DNA/RNA-extractie PCR set-up PCR Amplicon detectie Automatisch: Panther HPV E6/E7 mrna (cervixcytologie) TC TMA HPA DKA Target Capture Transcription Mediated Amplification Hybridisation Protection Assay Dual Kinetic Assay minimum TAT: 3,5 uur

14 Snelle moleculaire diagnostiek microbiologie Inleiding Waarom / hoe? Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven Snellere moleculaire diagnostiek in het labo Kort overzicht Point of care / Point-of impact toestellen & analyses Toestel hardware Reagentia / Analyse-verloop Werkwijze / manuele handelingen Testaanbod: huidig en nabije toekomst Resultaten / studies van het huidig testaanbod

15 Nieuwe geïntegreerde labo systemen Panther (Hologic) COBAS 6800 (Roche) BD MAX (BD) ELITe InGenius (ELITech) 3M Integrated cycler (Focus Diagnostics) eplex (GenMark Dx) ARIES (Luminex) Iridica (Abbott)

16 Snelle moleculaire diagnostiek in het labo: Panther Technologie: TC + TMA + HPA + DKA Volledige automatisatie: staal in resultaat uit Random access (continu laden stalen mogelijk) TAT: 3,5 uur eerste staal of prioritair staal ( + 5 min per 5 stalen) Voornaamste analyses: HPV mrna HIV-VL HCV-VL HBV-VL CT/NG Open mode: Panther Fusion vanaf eind 2017 (+ RT PCR module) 3,5 uur

17 Snelle moleculaire diagnostiek in het labo: COBAS 6800 Technologie: NZE + real-time PCR Volledige automatisatie: staal in resultaat uit Batches van max. 96 TAT: 3,5 uur per batch + 1,5 uur voor volgende batch Voornaamste analyses: HIV-VL HBV-VL HCV-VL CT/NG HPV MTB/MAI MPX (screening HIV, HBV en HCV) Open mode: ja 3,5 uur

18 Snelle moleculaire diagnostiek in het labo: BD MAX Technologie: NZE + real-time PCR Volledige automatisatie: staal in resultaat uit Batches van max. 24 TAT: 2,5 uur per batch Voornaamste analyses: MRSA C. difficile CT/GC/TV Group B streptokokken Enteric bacterieel panel Enteric parasieten panel Enteric viraal panel Open mode: ja 2,5 uur

19 Snelle moleculaire diagnostiek in het labo: ELITe InGenius Technologie: NZE + real-time PCR Volledige automatisatie: staal in resultaat uit Batches van max. 12 TAT: 2,5 uur per batch Voornaamste analyses: MRSA/SA ELITe MGB C. difficile ELITe MGB HSV-1/HSV-2 ElITE MGB CMV ELITe MGB EBV ELITe MGB Adeno ELITE MGB BKV ElITE MGB Parvovirus B19 ELITE MGB Open mode: ja 2,5 uur

20 Snelle moleculaire diagnostiek in het labo: 3M Integrated Cycler Technologie: NZE + real-time PCR op Direct Amplification Disc Automatisatie: staal /reagens zelf pipetteren resultaat uit Batches van max. 8 TAT: 1 uur per batch Voornaamste analyses: Simplexa Flu A/B & RSV Direct Kit Simplexa HSV 1 & 2 Direct Kit Simplexa Group A Strep Direct Kit Open mode: ja (via Universal Disc evt. afz. extractie) 1 uur

21 Snelle moleculaire diagnostiek in het labo: eplex Technologie: NZE + PCR + multiplex detectie (esensor) in cassette Migratie van vloeistofdruppels via electrowetting esensor: electrochemische detectie met ferrocene label Automatisatie: Staal in resultaat uit Capaciteit : 6 stalen / toren. Max 4 torens. TAT: minuten per staal Voornaamste analyses: Respiratoir panel (> 20 targets) Bloed cultuur ID GP (> 20 targets) Bloed cultuur ID GN (> 20 targets) Open mode: nee 1 uur

22 Snelle moleculaire diagnostiek in het labo: ARIES Technologie: NZE + real-time PCR in cassette Automatisatie: Staal in cassette pipetteren resultaat uit Capaciteit ARIES: 2 x 6 stalen TAT: 2 uur per staal Voornaamste analyses: ARIES HSV 1 & 2 ARIES FluA/B & RSV (RUO) ARIES GBS (RUO) Open mode: ja (User Defined Protocol Capability) 2 uur

23 Snelle moleculaire diagnostiek in het labo: IRIDICA Technologie: lysis + NZE + PCR + ontzouten + massa-spectrometrie Automatisatie: beperkt tot laden van de toestellen en overzetten 96-well plaat Capaciteit: 6 stalen per batch (BAC BSI / BAC SFT) TAT: 8 uur (snel t.o.v. cultuur rechtstreeks van staal) Voornaamste analyses: IRIDICA BAC BSI /SFT / LRT (> 750 ID) Fungal assay (> 200 fungi) Viral assay (> 130 virussen) Open mode: Nee 8 uur

24 Snelle moleculaire diagnostiek microbiologie Inleiding Waarom / hoe? Historiek moleculaire microbiologie UZ Leuven Snellere moleculaire diagnostiek in het labo Kort overzicht Point of care / Point-of impact toestellen & analyses Toestel hardware Reagentia / Analyse-verloop Werkwijze / manuele handelingen Testaanbod: huidig en nabije toekomst Resultaten / studies van het huidig testaanbod

25 Point-of-care / Point-of-impact toestellen / analyses GeneXpert (Cepheid): uitgebreid gamma aan testen Idylla TM (Biocartis): alle staalsoorten mogelijk Aleri TM i (Alere): snelheid van snelle antigentest gecombineerd met gevoeligheid van PCR Filmarray (BioFire / BioMérieux): syndroom gerichte panels COBAS-Liat (Roche)

26 GeneXpert (Cepheid): Toestel hardware GeneXpert I GeneXpert II GeneXpert IV GeneXpert XVI GeneXpert Omni 2016 GeneXpert Infinity 48S GeneXpert Infinity 80S

27 GeneXpert (Cepheid): Reagentia / analyse-verloop GeneXpert cassette Staalvoorbehandeling : filtreren + sonicatie mogelijk Lysis: + SPC (Sample Processing Control) DNA/RNA opzuivering Amplificatie en detectie: Nested PCR mogelijk (eerste amplificatie zonder detectie) real-time PCR met specifieke primers en probes in 1 PCRkamer telkens met detectie van SPC en één tot 6 targets. Vloeistoftransport in de reactiekamers via een verticaal bewegende toestelplunjer en een draaiende klep onderaan de cassette 11 kamers Staal Buffers Beads met gelyophiliseerde reagentia (SPC, enzyme, primers / probes) Amplificatie tube Draaiende klep + filter + ultrasoon interface

28 GeneXpert (Cepheid): Werkwijze Werkwijze: Staal inscannen GeneXpert specifieke assay cassette inscannen Staal toevoegen (evt. kleine voorbehandeling) Cassette in het GeneXpert toestel plaatsen 2-5 min min

29 GeneXpert (Cepheid): Testaanbod

30 Idylla TM (Biocartis): Toestel hardware In ontwikkeling Automatisch laden cassettes

31 Relevance Idylla TM i (Biocartis): Reagentia / analyse-verloop Lysis-kamer: staal + SPC (Sample Processing Control) + lysis buffer DNA/RNA opzuivering:gu binding buffer + silica membraan + wasbuffers + elutiebuffer Idylla cassette Amplificatie en detectie: real-time PCR met specifieke primers /probes in 5 afzonderlijk PCR-kamers telkens met detectie van SPC en één of meerdere targets. Max. targets/cassette = 30 Uniek voor Idylla-cassette: compabiliteit met vele staalsoorten zonder extra voorbehandeling (nu gevalideerd voor VTM en FFPE) BLOOD/ PLASMA/ SERUM SWAB URINE SPUTUM STOOL FFPE FINE NEEDLE ASPIRATE Viral load tests Sepsis Liquid biopsies Infectious disease tests Genetic tests STDs Urogenital cancers Liquid biopsies Respiratory tract infections Gastrointestinal tract infections Standard sample type for tumor biopsies Lung biopsies Spinal fluid (meningitis)

32 Idylla TM i (Biocartis): Werkwijze Werkwijze: Staal inscannen Idylla specifieke assay cassette inscannen Staal toevoegen Cassette in het Idylla toestel plaatsen 2 min min.

33 INFECTIOUS DISEASES ONCOLOGY Idylla TM (Biocartis): Testaanbod BRAF (melanoma) KRAS (colon) NRAS / BRAF / EGFR492 (colon) *** ctbraf *** NRAS (colon) NRAS / BRAF (colon) LCP ctkras *** ctnras *** ctlc *** MSI undisclosed assay undisclosed assay undisclosed assay Ebola * Influenza Virus Respiratory Syncytial Virus + Influenza Virus Surveillance + Sepsis Respiratory mixed panel HIV-VL ++ HBV-VL HCV-VL * Emergency Use Authorization label ** LC is the code name for an undisclosed lung cancer panel assay *** research use only + J&J assay ++ Biocartis assay in collaboration with J&J

34 Idylla TM (Biocartis): Testaanbod Idylla TM Respiratory (IFV-RSV) Panel CE-IVD 8 kwalitatieve resultaten in 50 min Influenza A H1 H H1N1 Overeenkomst H275Y mutatie Influenza B RSV A 200 µl 500 µl RSV B Infl A 96, ,6 100 Studie/evaluatie: Bijsluiter-info 349 NPS stalen t.o.v. FDA goedgekeurde NAAT of sequencing % pos % neg % pos % neg H1 96, H3 96, ,3 100 H1N1 96, ,7 100 H275Y n.v.t. 100 n.v.t. 100 Infl B 94,4 99,7 94,6 99,7 Staalsoort Nasopharyngeale wisser in viraal transport medium 200 µl 500 µl 50 min. RSV-A 96, ,0 100 RSV-B 97,4 99,7 97,3 100

35 Alere TM i (Alere): Toestel hardware

36 Alere TM i (Alere): Reagentia / analyse-verloop Staal-houder: lysis van het staal Gelyseerd staal Transfer cassette Test-basis (Gelyophiliseerde reagentia) Staal-houder (Lysis reagens) Transfer cassette Test basis Isotherme amplificatie Alere i NEAR technologie Alere i NEAR technologie: Nicking Enzyme Amplification Reaction Isotherme amplificatie + detectie via molecular beacons in 15 minuten RNA ssdna Primer 1 + reverse transcriptase Primer 2 + Nicking enzyme + DNA-polymerase dsdna - amplificatie detectie Molecular beacons

37 Alere TM i (Alere): Werkwijze 2 min min. Hurtado BMC Inf. Dis 2015

38 Alere TM i (Alere): Testaanbod Alere i Flu Influenza A + Influenza B + Internal Control Staalsoort: neuswisser / of viraal transport medium (200µl) Resultaat in 15 minuten Studie : Bell et al. JCV Multicenter studie op 545 stalen. - Alere i Flu t.o.v. cultuur + RT-PCR voor de discordante resultaten Gevoeligheid Specificiteit Influenza A 99,3% 98,1 % Influenza B 97,6% 98,9 % Nguyen Van et al DMID neuswissers. - Alere i Flu t.o.v. GeneXpert Flu /RSV Gevoeligheid Specificiteit Influenza A 93,8% 100 % Influenza B 100% 100 % Kurt Beuselinck - november 2016

39 Alere TM i (Alere): Testaanbod Alere i RSV RSV A / B + Internal Control Staalsoort: neuswisser / of viraal transport medium (200µl) Resultaat in 15 minuten Beschikbaar november 2016 Alere i StrepA Groep A Streptococcus + Internal Control Staalsoort: keelwisser Resultaat in 8 minuten Kurt Beuselinck - november 2016

40 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Toestel hardware Filmarray Torch 2016

41 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Reagentia / analyse-verloop Filmarray pouch Lysis-kamer: Mechanische lyse via bead beating DNA/RNA opzuivering: via magnetische beads en wasbuffers PCR I: multiplex PCR Dilutie PCR I: verwijderen primers PCR II: array-pcr. Array-PCR 102 wells elke well is gespot met één parameter specifiek primerpaar 3 wells per parameter Max. 27 parameters 2 IC: o RNA process (RNA transcript in lysis kamer) o PCR2 (DNA target in array) Reactiemix bevat fluorescent molecule die bindt aan dsdna Smeltcurve na de PCR Positief indien o Min. 2/3 wells positief o Tm binnen bepaald interval o Smeltcurve gelijklopend

42 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Werkwijze Werkwijze: Pouch in laadblok plaatsen Blauwe reagenstube: hydratatie-oplossing injecteren in pouch via laadblok Rode reagenstube: staalbuffer toevoegen staal toevoegen via een transferpipet sluiten en 3 maal opmengen door omdraaien Mengsel injecteren in pouch via laadblok Pouch in het Filmarray toestel plaatsen 2 min. 65 min.

43 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Respiratoir Panel Bloed Cultuur Identificatie Panel Gastrointestinaal Panel Meningitis Encephalitis Panel 2017: RP nieuw LRTI 20 targets 27 targets 22 targets 14 targets 3 bacteriën 17 virussen 19 bacteriën 5 fungi 3 antibiotica resistentie genen 13 bacteriën 5 virussen 4 parasieten 6 bacteriën 7 virussen 1 fungus

44 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Respiratoir Panel 20 targets 17 virussen 3 bacteriën Viraal Adenovirus Coronavirus 229E Coronavirus HKU1 Coronavirus OC43 Coronavirus NL63 Humaan metapneumovirus Humaan rhinovirus/ enterovirus Influenza A Influenza A/H1 Influenza A/H Influenza A/H3 Influenza B Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Parainfluenza 4 RSV Bacterieel Bordetella pertussis Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Staalsoort Nasopharyngeale wisser in viraal transport medium 300 µl

45 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Respiratoir Panel 20 targets 17 virussen 3 bacteriën Resultaten/ studies: Filmarray selection of publications 2015 Pettit N et al. JMM 2015 Filmarray RP decreased the average time to discontinuation of oseltamivir by 50% when compared to the Luminex Xtag RVP, resulting in cost savings The easy of use of Filmarray RP panel enables test to be run 24/7, optimizing lab workflow and resources used Rogers B.B. et al. APLM 2015 Filmarray RP impacted viral positive patients allowing earlier discontinuation of antibiotics, decreased length of stay and reduced time in isolation Xu M. et al. AJCP 2013 Patients tested with Filmarray RP were placed into cohorts effectively By using Filmarray RP patients were given appropriate treatment in a timely manner

46 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Bloed Cultuur Identificatie Panel 27 targets 19 bacteriën 5 fungi 3 antibiotica resistentie genen Gram + Bacteria: Enterococcus spp. L. monocytogenes Staphylococcus S. aureus Streptococcus spp. S. agalactiae (Group B) S. pyogenes (Group A) S. pneumoniae Gram - Bacteria : A. baumannii Enterobacteriaceae Enterobacter cloacae Complex E. coli H. influenzae K. oxytoca K. pneumoniae N. meningitidis P. aeruginosa Proteus S. marcescens Fungi: C. albicans C. glabrata C. krusei C. parapsiolosis C. tropicalis Antibiotic Resistance: meca Van A/B KPC Staalsoort Positieve fles bloedcultuur 100 µl

47 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Bloed Cultuur Identificatie Panel 27 targets Resultaten/ studies: Filmarray selection of publications 2015 Altun O et al. JCM 2013 Filmarray BCID covered microorganisms in 91,6% of the positive blood cultures included in the study Filmarray BCID detected some microorganisms not detected by conventional microbiological methods Zheng X et al. JCM 2014 Filmarray BCID identified 89,4% of 188 organisms recovered by culture Filmarray BCID accurately reported meca and vana/b resistance markers Banerjee R et al. CID 2015 Filmarray BCID testing combined with antimicrobial stewardship resulted in the most rapid antibiotic de-escalation 19 bacteriën 5 fungi 3 antibiotica resistentie genen

48 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Gastrointestinaal Panel 22 targets 13 bacteriën 5 virussen 4 parasieten Bacteriën: Campylobacter (C. jejuni, C. coli, and C. upsaliensis) Clostridium difficile (Toxin A/B) Plesiomonas shigelloides Salmonella Vibrio (V. parahemaemolyticus, V. Vulnificus and V. cholerae) Vibrio cholerae Yersinia enterocolitica E. coli O157 Enteroaggregative E. coli (EAEC) Enteropathogenic E. coli (EPEC) Enterotoxigenic E. coli (ETEC) Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC) stx1/stx2 Shigella/Enteroinvasive E. coli (EIEC) Virussen: Adenovirus F 40/41 Astrovirus Norovirus GI/GII Rotavirus A Sapovirus Protozoa: Cryptosporidium Cyclospora cayetanensis Entamoeba histolytica Giardia lamblia Staalsoort Stool in Cary Blair Transport Medium 200 µl

49 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Resultaten/ studies: Filmarray selection of publications 2015 Gastrointestinaal Panel 22 targets Buss S.N. et al. JCM 2015 Filmarray GI provides a comprehensive, rapid and streamlined alternative to conventional methods for the etiological diagnosis of infectious gastroenteritis The Filmarray GI has the potential to more quickly identify and further reduce transmission in an outbreak of enteric pathogens Stockman C. et al. CMID 2015 Filmarray GI showed a higher diagnostic yield than standard laboratory methods Filmarray GI helped identify additional bacterial infections, where treatment adjustments would be useful, and additional viral infections which could facilitate infection control efforts 13 bacteriën 5 virussen 4 parasieten

50 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Meningitis Encephalitis Panel 14 targets 7 virussen 6 bacteriën 1 fungus Viraal Cytomegalovirus (CMV) Enterovirus Herpes simplex type 1 (HSV-1) Herpes simplex type 2 (HSV-2) Human herpesvirus 6 (HHV-6) Parechovirus Varicella zoster virus (VZV) Bacterieel E. coli H. influenzae L. monocytogenes N. meningitidis S. agalactiae S. pneumoniae Fungi: Cryptococcus neoformans / gattii Staalsoort Cerebrospinaal vocht 200 µl

51 Filmarray (BioFire/BioMérieux): Testaanbod Meningitis Encephalitis Panel 14 targets Resultaten/ studies: Filmarray selection of publications 2015 Demogines A. et al. ASM 2015 (poster #1074) Overall, the Filmarray ME panel is a highly sensitive, specific and robust test for infectious bacterial, viral and yeast agents of meningitis and encephalitis illness. Bowman H. et al. ASM 2015 (poster #1068) The Filmarray ME panel assay are inclusive for clinically important variants of ME pathogens and exclusive of most other potential patogens or CSF contaminants The Filmarray ME panel process is tolerant of blood and and other potential PCR inhibitors that may be in CSF specimens The Filmarray ME panel leads to highly reproducible test results in the hands of multiple users, systems and other variables 7 virussen 6 bacteriën 1 fungus

52 COBAS Liat (Roche): Toestel hardware

53 COBAS Liat (Roche): Reagentia / analyse-verloop Principe: Reagentia in verschillende compartimenten. Verplaatsen reagentia en staal via plunjers Lysis: segment 1 DNA/RNA opzuivering: segment 2/3/4/5/6 Amplificatie en detectie: real-time PCR met specifieke primers /probes in 2 afzonderlijk PCR-kamers (segment 6/7) met elke kamer een eigen temperatuur en een photometer in segment 7.

54 COBAS Liat (Roche): Werkwijze

55 COBAS Liat (Roche): Testaanbod COBAS influenza A/B Influenza A + Influenza B Staalsoort: wisser nasopharynx Resultaat in 20 minuten Nog niet gelauncht in België! COBAS influenza A/B &RSV Influenza A + Influenza B + RSV Staalsoort: wisser nasopharynx Resultaat in 20 minuten COBAS Strep A Streptococcus pyogenus Staalsoort: keelwisser Resultaat in 20 minuten

56