Dr. Apr. Biol. Walter Verstrepen

Transcriptie

1 Symposium Moleculaire Biologie Dr. Apr. Biol. Walter Verstrepen Klinisch Laboratorium ZiekenhuisNetwerk Antwerpen

2 Dagelijkse kost of delicatesse? 2

3 Wat is biologie? tak van de biologie basis van biologische activiteit interacties tussen moleculen meer een aanpak dan arsenaal technieken DNA maakt RNA maakt eiwit 3

4 Hoe het begon 1938 Weaver: biologie verklaarbaar door processen 1944 Avery: verband tussen genen en DNA 1953 Watson & Crick: dubbele DNA helix 1958 Crick: DNA maakt RNA maakt eiwit 1961 Jacob & Monod: messenger RNA 1966 Khorana: genetische code ontcijferd 1983 Mullis: uitvinding PCR 1990 eerste commerciële PCR assay (HLA) 1995 beschrijving TaqMan PCR 4

5 Opzuivering van DNA en RNA ultracentrifugatie op CsCl-gradiënt 5

6 Opzuivering van DNA en RNA phenol chloroform extractie (Trizol) 6

7 Opzuivering van DNA en RNA anionenuitwisseling op (spin) kolommen (Qiagen) 7

8 Opzuivering van DNA en RNA (magnetische) silica extractie (Boom) 8

9 (Semi-)automatische extractie Nuclisens minimag Nuclisens easymag 9

10 (Semi-)automatische extractie MagNA Pure reeks 10

11 (Semi-)automatische extractie QiaCube QiaSymphony 11

12 Amplificatie door klonering 12

13 Southern blot 13

14 Southern blot om specifieke DNA sequenties op te sporen vraagt relatief veel DNA van goede kwaliteit omslachtig en tijdrovend analoge terminologie andere moleculen: Northern: RNA Western: eiwitten Southwestern: DNA-bindende eiwitten Eastern: posttranslationele modificaties (suikers/lipiden) 14

15 Hybrid Capture technologie 15

16 Fluorescent In Situ Hybridization 16

17 Polymerase chain reaction Kary Mullis 17

18 PCR enzymatische amplificatie van het substraat veel sneller resultaat minder gevoelig voor DNA degradatie (korte fragmenten) slechts kleine hoeveelheden DNA nodig toegankelijk voor labs niet gespecialiseerd in biologie 18

19 Low tech PCR 19

20 Iets minder low tech 20

21 Automatisatie 21

22 Eerste commerciële thermocycler Perkin Elmer Cetus

23 Verdere evolutie 9600 Perkin Elmer PTC-200 MJR C1000/S1000 Bio-Rad Veriti Life Technologies 23

24 Kwantitatieve PCR 24

25 Amplicon hybridizatie LIne Probe Assay 25

26 NASBA / TMA Isotherme amplificatie EasyQ BioMérieux 26

27 Strand Displacement Amplification Isotherme amplificatie 27

28 Loop mediated isothermal amplification (LAMP) Illumigene Meridian Biosciences 28

29 LAMP 29

30 Real-time PCR homogeen assay formaat amplificatie en detectie in dezelfde tube signaal opbouw tijdens de reactie sneller want geen post-pcr detectie minder risico op contaminatie kwantitatief verlaagde drempel voor implementatie 30

31 TaqMan versus Sybr Green 31

32 Kwantitatieve assay aantal cycli (Ct) is omgekeerd evenredig met logaritme van oorspronkelijke template 32

33 Förster Resonance Energy Transfer 33

34 Molecular beacons 34

35 Scorpions 35

36 Minor Groove Binder verhoogde smelttemperatuur kortere probe gevoeliger aan mismatchen opsporen van mutaties 36

37 Combinaties 37

38 Combinaties 38

39 High Resolution Melting 39

40 Eerste real-time PCR cycler 40

41 De opvolging ABI 5700 ABI 7700 Rotorgene LightCycler 480 ABI 7900 HT 41

42 Gericht op medische labo s Cobas Amplicor BD Probetec Cobas TaqMan 48 42

43 De pioniers verschillende platformen verschillende firma s verschillende assay condities beperkt aanbod weinig standardisatie in-house assays 43

44 Zelf koken? relevante sequenties opzoeken geschikte regio zoeken in uitgelijnde sequenties blast.ncbi.nlm.nih.gov primers en probes ontwerpen volgens bepaalde richtlijnen optimalisatie assay condities methode validatie 44

45 Wat schaft de pot? enterovirus HSV1&2 en VZV parechovirus B. burgdorferi (Lyme) hmpv N. meningiditis en S. pneumoniae B. pertussis en parapertussis Influenzavirus A en B M. pneumoniae, C. pneumoniae en L. pneumophila T. gondii adenovirus prothrombine mutatie FV Leiden BCL1 translocatie BCL2 translocatie 45

46 of toch uit eten? Kits en reagentia Artus >> Qiagen Argene >> BioMeriéux Diagenode -Becton Dickinson Nanogen >> Elitech Tibmolbiol -Roche Seegene Platform met reagentia Roche Qiagen BioMérieux Abbott Cepheid Becton Dickinson 46

47 Waar gaan we naartoe? consolidatie door uitbreiding aanbod integratie extractie opzetten reactie assay meerdere targets tegelijk eenvoudig te bedienen apparatuur 47

48 Drie gangen Cobas 4800 Abbott m2000 QiaSymphony SP/AS 48

49 Multiplex Ligation-Dependent Amplification 49

50 MLPA in real-time 50

51 Het buffet Doelwit Interne amplificatiecontrole Rhinovirussen/Enterovirussen Influenza A Influenza B Influenza AH1N1v Humaan metapneumovirus Adenovirus Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Parainfluenza 4 RSV-A RSV-B Corona NL63 Corona OC43 Corona 229E Corona HKU1 Bocavirus Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Bordetella pertussis Gen Polyproteïne gen van encephalomyocarditis virus 5 UTR Matrix proteïne gen (M1) Matrix proteïne gen (M1) Neuraminidase gen Nucleocapsid proteïne gen (NP) Hexon gen (H) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Major nucleocapsid proteïne gen (NP) Major nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Noncapsid (NP1) gen Major outer membrane (OmpA) gen Cytadhesin proteïne gen (P1) Macrophage inhibitor potentiator gen (mip) Pertussis toxin promoter gen (PT) 51

52 xtag technologie 52

53 MassTag technologie 53

54 Plex-ID PCR/ESI-MS 54

55 Fast food GeneXpert modulair instrument afgesloten cartridge extractie, amplificatie en detectie in één enkele minuten hands-on time beperkte opleiding niet goedkoop aanbod aan testen groeiende MRSA VRE MTB + rifar C. difficile GBS Influenzavirus enterovirus FII mutatie en FV Leiden BCR-ABL 55

56 Nieuwe tent 56

57 Opening soon Biocartis 57

58 Alles in één FilmArray 58

59 Makkelijk nu beschikbaar Respiratory panel 24 targets in ontwikkeling Blood ID panel: bacteria/fungi GI panel: bacteria/virus/protozoa Biothreat panel 59

60 Sanger sequencing 60

61 Capillaire sequencers ABI 310 ABI 3500 ABI

62 Next Generation Sequencing Verschillende platformen 62

63 Next Generation Sequencing Werkwijze 63

64 Next Generation Sequencing GS Junior Roche Helicos 64

65 Next Generation Sequencing 65

66 Emulsie PCR 66

67 Emulsie PCR 67

68 Pyrosequencing 68

69 Pyrosequencing 69

70 Pyrosequencing 70

71 Next Generation Sequencing Specificaties 71

72 Next Generation Sequencing 72

73 Next Generation Sequencing krachtige maar complexe technologie capaciteit enorm gestegen (500x) goedkoop per base, nog duur per run vereist expertise in biologie en bio-informatica zal technisch nog sterk evolueren reeds verspreid in medische genetica mogelijke toepassingen in medisch laboratorium voorlopig nog beperkt: somatische mutaties (personalized medicine) pharmacogenomics? 73

74 Digital PCR 74

75 Nabije toekomst geïntegreerde systemen één platform automatiseerbaar hogere throughput contaminatie? flexibiliteit? grotere schaal centraal black box instrumenten eenvoudige bediening gesloten systeem weinig interpretatie geen speciale opleiding nodig geen speciale omgevingseisen random access dringende en 24/7 onderzoeken kleinere labo s perifere sites 75

76 Start to PCR? behoefte/meerwaarde? aantal aanvragen? doorlooptijd? frequentie? alleenstaand of in panel? graad van automatisatie? koppeling met LIS? flexibiliteit? open of gesloten architectuur? gespecialiseerd personeel? KOSTPRIJS! 76

77 Dagelijkse kost of delicatesse? 77