Automatisatie van variabele real time PCR plaat set-up voor moleculaire diagnostiek. Karen Dierickx - 5 april 2016

Transcriptie

1 Automatisatie van variabele real time PCR plaat set-up voor moleculaire diagnostiek Karen Dierickx - 5 april 2016

2 Onze-Lieve-Vrouw Ziekenhuis in Aalst, België Eén van de grootste regionale niet-universitaire ziekenhuizen in Vlaanderen met een internationale reputatie op talrijke domeinen OLV-Ziekenhuis: 3 campussen: Aalst, Asse, Ninove Aantal bedden: 844 Aantal werknemers: 2554

3 Klinisch laboratorium Overzicht diensten binnen labo Bloedafname-dispatching Microbiologie: bacteriologie en serologie Klinische chemie: biochemie, urgentie, toxicologie, hematologie Moleculaire diagnostiek Nucleaire geneeskunde Moleculaire diagnostiek: DNA/RNA in patiënten stalen Virale en bacteriële infecties Opsporen van aangeboren/verworven aandoeningen Identificatie van micro-organismen Diagnose, follow-up Technieken: PCR en Real-time PCR 16 S Sequencing Genotypering

4 Labo moleculaire biologie Moleculaire technieken (+) zeer gevoelig: vroegtijdige diagnose (+) snel (-) kostenplaatje (-) contaminatie gevaar: vals positieven Sinds 2008 BELAC accreditatie: ISO15189 elk jaar strenge kwaliteitscontrole: testen, lokalen, administratie alle testen onderworpen aan strenge validatie nodig voor de eventuele terugbetaling van het RIZIV

5 Labo moleculaire biologie Moleculaire diagnostiek: +/ stalen per jaar VIROLOGIE: CMV, EBV, enterovirus, HBV, HCV, HEV, HSV, VZV, HPV, polyoma, RSV, hmpv, Influenza, PIV, Coronavirus, Rhinovirus, Adenovirus, Bocavirus BACTERIOLOGIE: Bordetella, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonnorhoeae, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium tuberculosis, MRSA, gisten, pneumocystis, 16S sequencing HEMATOLOGIE: BCR/ABL translocatie, Jak2, IGH en TCR genherschikking, Gilbert syndroom, HLA, factor II en factor V, Hemochromatose

6 Workflow Labo Moleculaire LIS: staal invoeren tot 11 uur RNA/DNA extractie: semi-automatisch EasyMag extractie toestel van Biomerieux RT-PCR analyse: ABI 7500 Fast PCR set-up: 96 well microtiterplaat Vt=25µl In-house RT-PCRs: zelfde tijdsprofiel Plaatverdeling opstellen Reactie mixen aanmaken en uitverdelen Stalen en controles toevoegen Plaatopstelling doorgeven aan het qpcr toestel Validatie resultaten LIS systeem: resultaat zelfde dag rapporteren

7 Noodzaak automatisatie in het labo moleculaire biologie Verhoogde werkdruk Toenemend aantal stalen/analyses per dag Dezelfde (of verlaagde) personeelsbezetting Verdere uitbreiding van diagnostiek Routine wordt steeds complexer Uitbreiding van het aantal PCR testen Verwerking wordt complexer door de verhoogde variatie aan technieken Verhoogde foutenlast

8 Workflow Labo Moleculaire LIS: staal invoeren tot 11 uur RNA/DNA extractie: semi-automatisch EasyMag extractie toestel van Biomerieux RT-PCR analyse: ABI 7500 Fast Validatie resultaten PCR set-up: In-house RT-PCRs: zelfde tijdsprofiel Plaatverdeling opstellen Reactie mixen aanmaken en uitverdelen Stalen en controles toevoegen Plaatopstelling doorgeven aan het qpcr toestel JANUS pipetteerstation, Perkin Elmer LIS systeem

9 Labo moleculaire biologie Moleculaire diagnostiek: +/ stalen per jaar VIROLOGIE: CMV, EBV, enterovirus, HBV, HCV, HEV, HSV, VZV, HPV, polyoma, RSV, hmpv, Influenza, PIV, Coronavirus, Rhinovirus, Adenovirus, Bocavirus BACTERIOLOGIE: Bordetella, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonnorhoeae, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Tropheryma whipplei, Mycobacterium tuberculosis, MRSA, gisten, pneumocystis, 16S sequencing HEMATOLOGIE: BCR/ABL translocatie, Jak2, IGH en TCR genherschikking, Gilbert syndroom, HLA, factor II en factor V, Hemochromatose

10 JANUS pipetteer robot Perkin Elmer Varispan pipetteerarm: vier tip posities Vaste tip of wegwerptips Afzonderlijk bewegen van de tips Systeemvloeistof: demi water + Proclin 300 Op en neer bewegen van de spuiten geeft een vloeistofverplaatsing waardoor kleine volumes exact opgezogen worden Accusens TM liquid level sense technology : detecteert en volgt het vloeistofoppervlak tijdens het uitverdelen en opzuigen van de vloeistof Verzekert het pipetteren van exact volume Minimaliseert de kans op contaminatie Geleidbare wegwerptips Het systeem detecteert de vloeistof heel nauwkeurig doordat het een verschil in geleiding detecteert Elke tip heeft een liquid sensing systeem waardoor ze dus elk verschillende volumes kunnen detecteren en opzuigen

11 Implementatie toepassing op op het het pipetteerstation: Algemene stappen 1. Installatie/kalibratie van het toestel en toestelvalidatie: Accuraatheid: vergelijking manueel pipetteren/robot, absorbantie bepaling met tartrazine kleurstof (gewenst volume met CV<5%) Precisie: reproduceerbaarheid van het pipetteren (CV<5%) Cross-contaminatie: dambordpatroon water/kleurstof 2. Ontwikkeling/Design van de toepassing Optimale lay-out van het dek Opbouw uitvoerende stappen in de software van de robot Programmatie onderliggend script van de uitvoerende stappen Bewerkstelling van de communicatie: GLIMS-robot-ABI7500 Fast RT-PCR toestel Uittesten protocol en bijsturen waar nodig: met water en vervolgens met reagentia/stalen (methodevalidatie)

12 Implementatie toepassing op het pipetteerstation Algemene stappen 3. Methode validatie Vergelijking resultaten referentiemethode: ΔCt waarde en curves nakijken Reproduceerbaarheid: maximaal een interrun variatie van 3 Ct Traceerbaarheid nagaan 4. Opvolging Evolutie protocolwijzigingen bijhouden Externe kwaliteitscontrole stalen Accuraatheid toestel halfjaarlijks nakijken

13 Implementatie toepassing op het pipetteerstation Toepassingen Aanmaak Primer Probe mixen voor RT-PCR analyses Primers/Probes/water samenvoegen Aliquoteren voor verder gebruik op de robot Vaste 96 well plaat set-up enkel voor respiratoir panel Per rij een multiplex RT-PCR (8 in totaal) Per kolom een staal of controle (max 12 in totaal) Enige variabele: aantal stalen ingeven in het begin van het protocol Variabele plaat set-up voor alle in-house RT-PCR analyses Input: barcode stalen / GLIMS werklijst Variabele: op elk staal verschillende analyse adhv de werklijst

14 Implementatie toepassing op het pipetteerstation Tijdsbesteding Vaste 96 well plaat set-up enkel voor respiratoir panel START programmatie: Januari 2012 START methode validatie: September 2012, duur: 3 maanden IN ROUTINE: December 2012 Variabele plaat set-up voor alle in-house RT-PCR analyses START programmatie: Januari 2013 START methode validatie: September 2013, duur: 1 maand IN ROUTINE: Oktober 2013

15 PCR Set-up Creator Interface Doel Gebruiksvriendelijke interface Gemakkelijk definiëren en aanpassen van klantgerichte eigenschappen Eenvoudiger om analyse toe te voegen aan het protocol met de PCR Recipe Administrator Tool

16 PCR set-up Creator Interface Illustratie variabel plaat set-up protocol Opstarten Winprep protocol Ingeven van het aantal stalen en inscannen barcodes van extracten In het LIS systeem wordt een werklijst gegenereerd met alle stalen en bijhorende analyses De PCR set-up Creator interface wordt geopend Glims werklijst wordt geïmporteerd

17 PCR set-up Creator Interface Illustratie variabel plaat set-up protocol Genereren van tabel adhv de werklijst Selectie van de uit te voeren analyses Visuele check van opvulling plaat

18 PCR set-up Creator Interface Illustratie variabel plaat set-up protocol Barcode lezen van controles, PP mixen en enzyme mixen 2D barcode label, 9 cijfercode: Vb: Unieke 3 cijfercode

19 PCR set-up Creator Interface Illustratie variabel plaat set-up protocol Uitvoeren Winprep protocol door pipetteerrobot Aanmaken reactiemixen: PP mixen + enzyme Uitverdelen van reactiemixen in de plaat Toevoegen van stalen en controles Genereren van werklijst voor het ABI toestel

20 PCR set-up Creator Interface Illustratie variabel plaat set-up protocol Importeren van de set-up werklijst in het RT-PCR toestel: ABI 7500 Fast van Thermo Fisher life technologies

21 PCR set-up Creator Interface Resultaten methodevalidatie variabele set-up 226 klinische stalen geevalueerd Vergelijking van Ct waarden: manueel versus geautomatiseerde plaat set-up 20 multiplex in-house Real time PCR assays 1RSV-A/RSV-B/hMPV/IC (4-plex) Infl-A/Infl-B (3-plex) PIV1/PIV4/Rhino (3-plex) PIV2/PIV3/entri (3-plex) Coronavirussen (4-plex Adeno/Boca/IC (3-plex) M. pneumoniae/c. pneumoniae/ic (3-plex) B. pertussis/b. parapertussis/b. holmesii/ic (4-plex) CMV/IC (2-plex) HSV/VZV/IC (3-plex) HBV/IC (2-plex) C. trachomatis/n. gonorrhoeae/ T. vaginalis/ic (6-plex) Polyoma/IC (2-plex) EBV/IC (2-plex) Bof (2-plex) L. pneumophila/ic (3-plex) MRSA (3-plex) JAK2 mutation (2x 1-plex) HLAB27/Betaglobin (2-plex) Resultaten 53 positieve stalen hebben vergelijkbare Ct waarden met een gemiddelde delta Ct waarde van 0,04 Delta Ct waarde van de controles is < 2 Sensitiviteit 96% Specificiteit 100% Accuraadheid 99% Geen intra of interrun contaminatie geobserveerd Traject volledig traceerbaar

22 Voordelen van automatisatie Verlagen van de werkdruk Standaardisatie Nauwkeurig Digitalisering van het volledige verwerkingsproces waardoor alles traceerbaar is (kwaliteitszorg) Logfile van de run: gebruikte reagentia en pipetteerstappen nagaan Verminderen van foutenlast Nadelen van automatisatie Opzetten van het proces neemt tijd in beslag (Trial and error) Bij technisch defect steeds back-up nodig Prijskaartje, consumables

23 Besluit De geautomatiseerde plaat set-up met behulp van het JANUS pipetteerstation werd succesvol geïmplementeerd in het labo moleculaire biologie en is een grote meerwaarde binnen het labo