Toekomstmuziek? D r. A n n e t t e S t e m e r d i n g *

Transcriptie

1 Toekomstmuziek? Dr. Annette Stemerding *

2 SNELdiagnostiek SNEL

3 Inhoud - Hoe vinden we verwekkers van infectieziekten? - Tijdschema? - Moet dit sneller (en waarom)? -Kan dit sneller (en hoe)? Microbiologie in een notendop

4 Inhoud - Hoe vinden we verwekkers van infectieziekten? - Tijdschema? - Moet dit sneller (en waarom)? -Kan dit sneller (en hoe)? Microbiologie in een notendop

5 Bacteria: 3.5 billion years Homo sapiens: years Earth: 4.6 billion years

6

7

8 Bacteriën werden voor het eerst gezien ~ 350 jaar geleden (1676)

9 140 jaar microbiologie microben maken ziek!

10 140 jaar microbiologie microben maken ziek! isolatie microben op primitieve voedingsbodems

11 140 jaar microbiologie ontdekking afweer van de gastheer

12 140 jaar microbiologie ontwikkeling van specifieke voedingsbodems

13 140 jaar microbiologie eerste antibioticum (Salvarsan > syfilis)

14 140 jaar microbiologie eerste antibioticum (Salvarsan > syfilis) penicilline Prontosil (sulfonamide)

15 140 jaar microbiologie onder druk ontstaat selectie en aanpassing: RESISTENTIE

16 140 jaar microbiologie ontdekking structuur DNA eerste x hele genoom microbe (HI) ontrafeld ontwikkeling PCR = techniek om gericht bepaalde stukjes DNA te kunnen vermeerderen zodat het bv zichtbaar wordt

17 Inhoud - Hoe vinden we verwekkers van infectieziekten? - Tijdschema? - Moet dit sneller (en waarom)? -Kan dit sneller (en hoe)? Microbiologie in een notendop

18 Inhoud - Hoe vinden we verwekkers van infectieziekten? - Tijdschema? bloedbaan infecties

19 Bloedbaan infecties

20 Bloedbaan infecties Levende bacteriën(en/of gisten) betreden de normaal gesproken steriele bloedbaan = bacteriëmie(fungemie)

21 Bloedbaan infecties Levende bacteriën(en/of gisten) betreden de normaal gesproken steriele bloedbaan = bacteriëmie(fungemie) Eerste casus gepubliceerd in 1897 Emanuel Libman, MD ( ) Sindsdien ontwikkeling van kweekmethoden voor bloed

22 Bloedbaan infecties Levende bacteriën(en/of gisten) betreden de normaal gesproken steriele bloedbaan = bacteriëmie(fungemie) veroorzaakt door een breed microbieel spectrum (en primaire infecties) Gram positieve pathogenen -CoNS - Staphylococcus aureus - Enterococcus spp. Gram negative pathogenen - Escherichia coli - Pseudomonas aeruginosa - Klebsiella pneumoniae - Enterobacter cloacae Gisten - Candida spp.

23 Bloedbaan infecties Levende bacteriën(en/of gisten) betreden de normaal gesproken steriele bloedbaan = bacteriëmie(fungemie) trauma intravasculair kunstmateriaal invasieve procedures orgaan infecties SIRS/SEPSIS

24 SIRS/SEPSIS

25 SEPSIS Hoog in Top10 doodsoorzaken Prevalentieop de IC neemt toe

26 Severe sepsis op de NL- IC s = (+/-929)/year = 0.054% vd NL-populatie(5.4/10,000) = 0.61% vd ziekenhuis opnames (61/10,000) = 11% vd IC opnames (1100/10,000)

27 SEPSIS Hoge mortaliteit en morbiditeit Mortaliteit 20-70% gerelateerd aan de ernst van onderliggende ziekte Toegenomen gezondheidszorgkosten

28 Bloedbaan infecties Optimale behandeling 1. Herkenning ziektebeeld 2. Laboratorium testen 3. Behandeling Ideale test? I R S!

29 Ideale laboratorium test? 1) Snelle en accurate detectie en identificatie van levende en ziekmakende microbe(n)(~met hoge sensitiviteit en specificiteit) x x

30 Bloedkweek: de gouden standaard

31 Bloedkweek: de gouden standaard venapunctie 2 flesjes (8-10 ml bloed) kind max1% TBV

32 Bloedkweek: de gouden standaard venapunctie 2 flesjes (8-10 ml bloed) kind max1% TBV Concentratie bacteriën tijdens een bacteremie Volwassenen: KVE/ml Kinderen: >100 KVE/ml Detectie is afhankelijk van het gekweekte bloedvolume

33 Bloedkweek: de gouden standaard venapunctie 2 flesjes (8-10 ml bloed) kind max1% TBV en incuberen Concentratie bacteriën tijdens een bacteremie Volwassenen: KVE/ml Kinderen: >100 KVE/ml Detectie is afhankelijk van het gekweekte bloedvolume

34 Bloedkweek: de gouden standaard delende bacteriën CO 2 -detectie afenten op voedingsmedia Gram - kleuring biochemische testen and AST

35 Bloedkweek: de gouden standaard biochemische test en AST

36 Bloedkweek: de gouden standaard 1-enkele dagen biochemical testing and AST

37 Bloedkweek: de gouden standaard Nadelen: Kweek van contaminanten(huidflora) diepe huiddesinfectie en afname door goed getraind personeel Lage sensitiviteit voor traag groeiende en veeleisende microben (vb. M. tuberculosis en de meeste gisten Coxiella burnetii) Antibiotica gebruik fout negatieve resultaten Kost veel tijd!

38 Tijdschema minimaal uur uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag 2

39 Tijdschema minimaal uur uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! 2

40 Inhoud - Hoe vinden we verwekkers van infectieziekten? - Tijdschema? - Moet dit sneller (en waarom)? -Kan dit sneller (en hoe)? Microbiologie in een notendop

41 Moet dit sneller?

42 Verkeerde therapie

43 Ja, we moeten sneller!

44 Bloedbaan infecties

45

46 Bacteriële resistentie

47 Therapie is ook schadelijk! the microbiome

48 Tijdschema minimaal uur uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! 2

49 Inhoud - Hoe vinden we verwekkers van infectieziekten? - Tijdschema? - Moet dit sneller (en waarom)? -Kan dit sneller (en hoe)? Microbiologie in een notendop

50 Tijdschema minimaal uur uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! 2

51 Bloedkweken: verkorten tijd tot detectie HOE? Verbeteringen in de kweekmedia opbrengst omhoog snellere detectie Voorkom vertraging in proces tot aan de incubatie (transport) Nb. Opslag kamertemperatuur > latere detectie Snelle groei > uitputting CO2 en latere detectie of geen detectie VOORKOM VERTRAGING!

52 Tijdschema minimaal uur uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID DNA profiel ID DNA profiel PROTEIN profiel

53 Tijdschema minimaal uur uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID DNA profiel ID DNA profiel PROTEIN profiel

54 Tijdschema minimaal uur uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID DNA profiel ID DNA profiel EIWIT profiel

55 P ower Ionising V acuum N egative MALDI-TOF for bacterial identification

56

57 P ower Ion isin g V acu um N eg ati ve MALDI-TOF MS: basis principes Uniek EIWIT profiel

58 MALDI-TOF MS: basis principes selectie en overbrengen van cellen van een kolonie toevoegen 1µL Matrix oplossing

59 MALDI-TOF MS P ower Ionising V acuum N egative

60 MALDI-TOF MS: basis principes Ion kanaal vanaf kolonie incorporatie van molekulenin matrix kristallen op het plaatje 60

61 MALDI-TOF MS: basis principes Ion kanaal LASER desorptie en ionisatie vanaf kolonie 61

62 MALDI-TOF MS: basis principes Ion kanaal versnelling door electromagnetisch veld vanaf kolonie 62

63 MALDI-TOF MS: basis principes scheiding op massa Ion kanaal vanaf kolonie 63

64 MALDI-TOF MS: basis principes detectie Ion kanaal From sample 64

65 <<C:\Dok um ente und Eins tellungen\m.erhard\eigene Dateien\Anagnos Tec -dc \Zwis c henablage\dok um ent Banner.tx t>> Spec [BP = 3 P ow er Ionising V a cuu m Ne ga tiv e Maldi TOF proces % Intensity Mass (m/z)

66 Escherichia coli 99,9%

67 MALDI-TOF MS: evaluatie Stap Sample preparation MALDI TOF MS Measurement Data analysis Sample Prep Station Pro snel (minuten) Con detectie limiet: >10 7 kve/ml kve/ml fingerprint~ negatieve kweek - kweekstap nodig voor optimaal resutlaat - direct MS vanuit lage sensitiviteit (30%-x%) ~4 uur = genoeg moeilijkheden viridans streptokokken/meng infecties

68 Tijdschema minimaal uur uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID DNA profiel ID DNA profiel EIWIT profiel

69 FISH PCR DNA-gebaseerde diagnostiek: Microarray Real-time PCR Uniek DNA profiel

70 FISH = Fluorescence in situ hybridization Fluorescente oligonucleotide probes target rrna molekulen van verschillende microorganismen eiwitten en rrna

71 FISH = Fluorescence in situ hybridization

72 FISH - evaluatie FISH assaysontwikkeld voor specifieke pathogenen: S. aureus; CoNS, Enteroccus spp.; Streptococcus spp.; Pseudomonas spp; E. coli; Brucella spp, and fungi FISH protocol: identificatie binnen 60 minuten Veelbelovend maar voorlopig geremd door: - doordringbaarheid van de cel wand - hybridisatie condities - beperkte probe collectie C/ identificatie voor alle verwekkers van bloedbaaninfecties vandaag de dag nog niet mogelijk

73 PCR-gebaseerde technologiën = polymerase chain reaction Microarray Real-time PCR

74 PCR-gebaseerde technologiën Microarray-platform: Prove-It Sepsis

75 PCR based technologies Microarray-platform: Prove-It Sepsis ~90 % van alle sepsisverwekkers: - 60 bacteriën -13gisten - meca(mrsa) Sensitiviteit 94.7% Specificiteit 98.8% Tisseri et al. Lancet 2010

76 PCR-gebaseerde technologiën Real-time PCR

77 PCR-gebaseerde technologiën Real-time PCR: 1) Breed (18S/16S) (+ 4 uur voor sequencing) 2) Pathogeenspecifiek (S. aureus / MRSA; S. pneumoniae; E. faecalis; N. meningitidis; Aspergillus spp; Candida spp.) weten wat je verwacht 3) Multiplex

78 PCR-gebaseerde technologiën C/ Pathogeen identificatie binnen enkele uren vanaf groei in bloedkweek

79 Tijdschema uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID DNA profiel ID DNA profiel EIWIT profiel

80 Tijdschema uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID DNA profiel ID DNA profiel EIWIT profiel

81 Tijdschema uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID DNA profiel ID DNA profiel EIWIT profiel

82 Tijdschema uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID ID

83 Tijdschema uren enkele dagen 1 enkele dagen 1 dag! ID ID DNA profiel

84 PCR-gebaseerde detectie en identificatie direct vanuit bloed Nadelen bloedkweken Kweek van contaminanten(huidflora) diepe huiddesinfectie en afname door goed getraind personeel Lage sensitiviteit voor traag groeiende en veeleisende microben (vb. M. tuberculosis en de meeste gisten Coxiella burnetii) Antibiotica gebruik fout negatieve resultaten Kost veel tijd!

85

86

87 De ideale laboratorium test? 1) Snelle en accurate detectie en identificatie van levende en ziekmakende microbe(n)(~met hoge sensitiviteit en specificiteit) x x

88 Dank voor de aandacht! Vragen??