Microbiële genetica Nieuwe mogelijkheden voor preventie en behandeling van (orale) infecties

Transcriptie

1 D.M. Deng, W. Crielaard Microbiële genetica Nieuwe mogelijkheden voor preventie en behandeling van (orale) infecties Meer inzicht in de microbiële genetica van pathogene orale micro-organismen en een nieuw scala van moleculair genetische technieken hebben samen geleid tot andere strategieën in de ontwikkeling van antimicrobiële geneesmiddelen. In dit artikel wordt de belangrijke rol van de kennis van de microbiële genetica in het voorkomen en bestrijden van (orale) infectieziekten geïllustreerd. Na een aantal termen van het jargon te hebben geïntroduceerd, wordt de rol die de microbiële genetica speelt in de target-based ontwikkeling van antimicrobiële geneesmiddelen ter preventie en behandeling van (orale) infecties besproken. Daarna wordt ook nog de impact van de microbiële genetica op vaccinontwikkeling en een aantal nog vooral experimentele preventiestrategieën behandeld. Deng DM, Crielaard W. Microbiële genetica. Nieuwe mogelijkheden voor preventie en behandeling van (orale) infecties. Ned Tijdschr Tandheelkd 2008; 115: Microbiële genetica en infecties Genetica en genetische technieken worden steeds meer onderdeel van het dagelijks leven. Genetische inzichten, begrippen en technieken worden niet alleen meer toegepast in fundamenteel of toegepast onderzoek, ze vinden steeds sneller hun weg naar de kliniek. Een goed voorbeeld is de vinding van de RNA-interferentietechniek (Fire et al, 1998). Nu, 10 jaar later, wordt deze techniek al toegepast in kankertherapieën. In tegenstelling tot de klassieke genetica (erfelijkheidsleer) en de klinische genetica (risicobeoordeling) is de microbiële genetica moleculair gericht. Het onderzoek richt zich vooral op de (moleculaire) mechanismen van expressie (activiteit) van sets van genen en, in de mondzorg en de medische microbiologie, vanzelfsprekend op de genen die betrokken zijn bij de virulente eigenschappen van micro-organismen. Steeds vaker worden alle genen van 1 micro-organisme tegelijkertijd geanalyseerd en gevolgd, bijvoorbeeld om het effect van een (nieuw) antimicrobieel middel te begrijpen. Alle genen samen vormen het genoom van het micro-organisme. De interpretatie van de functie van genen op het genoom en het bestuderen en vergelijken van verschillende genomen wordt genomics genoemd. De activiteit van de genen op het genoom kan worden gemeten via transcriptomics. Omdat tijdens deze analyse DNA-micro-arrays (DNA-chips) worden gebruikt, wordt dit soort onderzoek vaak een micro-array -experiment genoemd. Ook wordt vaak de techniek proteomics gebruikt. Hierbij worden alle microbiële eiwitten die onder een bijvoorbeeld virulente conditie aanwezig zijn, geanalyseerd. Cariës en parodontitis zijn de 2 belangrijkste infectieziekten in de mond. Beide ziekten zijn het resultaat van een orale microflora die uit balans is geraakt. Voor het -omics - tijdperk werden micro-organismen vooral bestudeerd en gekarakteriseerd aan de hand van hun fysiologische eigenschappen. De nadruk werd gelegd op het chemisch karakteriseren van bacteriële metabole tussen- en eindproducten (bijvoorbeeld zuren) en het isoleren van de daarbij betrokken enzymen. Het onderzoek in de orale microbiologie was gecentreerd rond het karakteriseren van de micro-organismen in plaque en de rol die deze speelden in cariës, gingivitis en parodontitis (Socransky, 1977; Kleinberg, 2002). Op verschillende manieren werd duidelijk dat Streptococcus mutans en andere mutans streptokokken belangrijk waren in de etiologie van cariës, terwijl Aggregatibacter actinomycetemcomitans en Porphyromonas gingivalis als belangrijke micro-organismen in het ontstaan van parodontitis werden geïdentificeerd (Loesche, 1986; Dahlén, 1993). In de afgelopen 5 jaar is de genoomsequentie van een groot aantal (orale) bacteriën opgehelderd (Duncan, 2005). Op dit moment is de genoomsequentie van meer dan 10 orale pathogene bacteriën beschikbaar, waaronder die van Streptococcus mutans, Aggregatibacter actinomycetemcomitans en Porphyromonas gingivalis. Onderzoek naar de etio logie, de diagnostiek en de preventie van cariës en parodontitis heeft enorm geprofiteerd van deze kennis van het genoom en van de nieuwe ontwikkelingen in de biotechnologie en de moleculaire biologie. Bijna alle veranderingen in de fysiologie en de virulentie 93

2 van een bacterie worden ingeleid door veranderingen in genexpressie. Streptococcus mutans UA159, een bacteriestam waarvan de genoomsequentie bekend is geworden, heeft 1 chromosoom met daarop genen (Ajdić et al, 2002). Onder normale groeiomstandigheden is maar een gedeelte van die genen actief. Als de condities veranderen, bijvoorbeeld als de ph in de mond lager wordt, worden allerlei nieuwe genen geactiveerd, zoals groesl en clpp (Len et al, 2004). Dit is een groep genen die de bacterie beschermen tegen stresscondities of betrokken zijn bij het opruimen van door de lage ph beschadigde celcomponenten. Andere genen worden tegelijkertijd gedeactiveerd met als eindresultaat een Streptococcus mutans met een fysiologie die volledig is aangepast aan de zure, cariogene omstandigheden. Naast variatie in de activiteit van de eigen set genen hebben veel bacteriën ook nog de mogelijkheid om zich aan te passen door te muteren of door actief DNA op te nemen en te gebruiken van andere bacteriën (in de mond). De ontwikkeling van antibioticaresistentie in nosocomiale pathogenen is een voorbeeld van actieve DNA-opname door bacteriën (Wenzel, 2007). In het genoom van Streptococcus mutans UA159 kan een gen worden gevonden dat de bacterie heeft overgenomen van Actinobacillus pleuropneumoniae. Dit gen, dat een duidelijke functie heeft, kan Streptococcus mutans helpen te overleven onder nog zuurdere (cariogene) omstandigheden (Korithoski et al, 2005; Marri et al, 2006). Microbiële genetica en preventie en behandeling van infecties Al jaren wordt veel energie gestoken in het controleren van (de effecten) van orale infectieziekten. Allerlei nieuwe preventiestrategieën zijn ontwikkeld waarvan in de cariologie het gebruik van fluoride, via het remmen van demineralisatie en het bevorderen van remineralisatie zeer succesvol is geweest (Ten Cate, 2004). Het is echter nog niet gelukt de microbiële component van de orale infecties effectief onder controle te krijgen. Er bestaan 2 inzichten die worden gevolgd bij de ontwikkeling van preventie- en behandelstrategieën tegen orale pathogene micro-organismen: de specifieke plaquehypothese en de ecologische plaquehypothese (Marsh, 1994). Bij de eerste hypothese staat het bestrijden van een specifiek pathogeen centraal. Op basis van die hypothese zijn onder andere antimicrobiële stoffen en vaccins tegen bekende pathogenen als Streptococcus mutans en Porphyromonas gingivalis ontwikkeld. Op basis van de ecologische plaquehypothese worden strategieën ontwikkeld vanuit het begrip dat de gehele microbiële populatie verschuift tijdens het infectieproces (Sbordone en Bortolaia, 2003). Het moge duidelijk zijn dat de moleculaire microbiële genetica in beide gevallen een zeer waardevolle bijdrage kan leveren. Ontwikkeling van antibacteriële geneesmiddelen Het is moeilijk gebleken (nieuwe) antimicrobiële middelen te ontwikkelen die langere tijd kunnen worden gebruikt en geen bijeffecten hebben. In de afgelopen jaren zijn artikelen verschenen waarin naar voren wordt gebracht dat de ontwikkeling van antibacteriële geneesmiddelen moeilijke tijden doormaakt. Een groot aantal farmaceutische bedrijven stopte of minimaliseerde de ontwikkeling en het onderzoek van antibacteriële middelen (Overbye en Barrett, 2005; Mills, 2006). In verband met de snel verkregen resistentie maakt de lange tijd die nodig is voor ontwikkeling en onderzoek het proces onrendabel. De ontwikkelingstijd moet worden versneld en er ontstaat steeds meer aandacht voor het ontdekken van antimicrobiële middelen waartegen resistentie minder voor de hand ligt. Genomics wordt gezien als een krachtig gereedschap om het hele proces weer vlot te trekken (Mills, 2006). In de afgelopen 15 jaar is target-based, op een specifiek doel gericht, het nieuwe paradigma in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Dit heeft de traditionele, op fysiologie gebaseerde strategie verdrongen (Sams-Dodd, 2005). Target-based geneesmiddelen zijn ontworpen om de functie of de expressie van 1 of meer virulentiefactoren te remmen, terwijl de traditionele antimicrobiële middelen gericht zijn op het doden van het pathogene micro-organisme. Targetbased antimicrobiële middelen zijn dus vaak soortspecifieke remmers, terwijl de traditionele antibiotica juist zijn gericht op aspecten die geconserveerd zijn in de moleculaire biologie van micro-organismen, zoals de machinerie van de celwandsynthese of de eiwitsynthese. Het brede spectrum van traditionele antibiotica heeft zeker in de mondzorg een aantal ongewenste bijeffecten: verstoring van de normale flora, groei van potentieel gevaarlijke bacteriën en schimmels en een verhoogde kans op transmissie van antibioticaresistentie (Curtis et al, 2002). Voor de identificatie en validatie van targets wordt de genoominformatie van het te bestrijden micro-organisme gebruikt. Daarna volgt het identificeren of screenen van remmers en het optimaliseren van de remmers (afb. 1). Onderzoekers in de moleculaire biologie, zeker die binnen de mondzorg werkzaam zijn, concentreren zich vooral op de initiële aspecten van het hele proces: het identificeren en valideren van mogelijke targets. Een dergelijk antibacterieel target is vaak een virulentiegen dat juist functioneert tijdens het infectieproces. Het targetgen moet belangrijk zijn tijdens de virulentie. Dus het kan te maken hebben met de aanhechting of de groei van het micro-organisme of met het omzeilen van het immuunsysteem. Als het proces waarin het gen is betrokken, geremd is, zullen de micro-organismen of niet overleven tijdens een infectie of niet virulent zijn. Als een dergelijk gen in het genoom van het micro-organisme is gevonden, wordt vervolgens het menselijk genoom onderzocht om te achterhalen of daarin ook een homoloog van het bacteriële target aanwezig is. Tevens wordt onderzocht in hoeveel aspecten dit homoloog overeenkomt met de bacteriële variant. Hiermee kan in een vroeg stadium al een risicoanalyse op potentiële toxiciteit van een geneesmiddel worden uitgevoerd (Sams-Dodd, 2005; Mills, 2006). 94

3 Deng en Crielaard: Microbiële genetica Ontwikkeling van antibacteriële middelen in vitro De meest gebruikte methode om de functionaliteit of het belang van een bacterieel gen te onderzoeken, is het maken van een zogenaamde knockout -stam, waarin het desbetreffende gen is verwijderd of vervangen door een marker -gen. Door vervolgens de fysiologische eigenschappen van deze knock-out -stam onder verschillende groeicondities te vergelijken met die van de originele stam kan de functie van het desbetreffende gen worden vastgesteld. Sinds de opheldering van de genoomsequenties van een aantal orale bacteriën is er een stroom van dergelijke onderzoeken op gang gekomen, waarvan 2 voorbeelden worden besproken. Beide onderzoeken zijn illustratief voor het belang van de moleculaire genetica bij de targetbased ontwikkeling en validering van geneesmiddelen. Voorbeeld 1. Porphyromonas gingivalis is al lang bekend als een van de belangrijke pathogenen in de subgingivale plaque. Dit micro-organisme is verantwoordelijk voor de progressie van parodontitis en het verlies van (bot)weefsel (Holt et al, 1988; Van Steenbergen et al, 1989). Virulentieeigenschappen van Porphyromonas gingivalis zijn onder andere aanhechtingsmechanismen, uitscheiding van toxinen, biofilmvorming en het verstoren of remmen van de gastheerafweer. Veel genen die betrokken zijn bij de virulentie, zijn geïdentificeerd. Zo is bekend dat de genen fima, sspa/b en gtfa betrokken zijn bij aanhechting van Porphyromonas gingivalis aan de zachte weefsels in de mond of aan andere orale micro-organismen, zoals Streptococcus gordonii (Watanabe-Kato et al, 1998; Narimatsu et al, 2004; Park et al, 2006). De genen ftsh, gale en PG0106 zijn betrokken bij kapselsynthese (Davey en Duncan, 2006; Nakao et al, 2006; Simionato et al, 2006). De best bestudeerde virulentiefactoren zijn echter een groep cysteïne proteasen (eiwitafbrekende enzymen), de zogenaamde gingipains. Deze proteasen zijn vooral van belang voor het omzeilen van de afweermechanismen van de gastheer. Ze spelen een cruciale rol bij aggregatie, hemagglutinatie en hemoglobinebinding door Porphyromonas gingivalis (Potempa et al, 2003). Genen die betrokken zijn bij de productie van deze proteasen zijn kgp, rgpa en rgpb. Zowel de functie en de regulatie van deze genen als de driedimensionale structuur van de proteasen zijn uitgebreid bestudeerd (Holt et al, 2000; Nakayama, 2003). Gebaseerd op de driedimensionale structuur van het Kgp-protease kon, via computervoorspellingen de actieve locatie van het enzym worden gevonden. Vervolgens kon een aantal remmers worden ontwikkeld, gescreend en geselecteerd. Van al deze remmers bleek A71561 in staat Genoomsequentie Selectie van targets Identificatie van targets Verificatie van targets Selectie van targets Identificatie van remmer Ontwikkeling van screens Intensieve screening Mechanismen van remmer Hits Remmers Nieuwe antibacteriële geneesmiddelen Optimalisatie van remmer Optimalisatie van remmer Effectiviteit in genezing Optimalisatie van dosis Bijwerkingen Afb. 1. Illustratie van de speurtocht naar nieuwe antibacteriële geneesmiddelen (aangepast op basis van Rosamond en Allsop, 2000). specifiek de werking van het Kgp-eiwit te remmen in infectiemodellen (Curtis et al, 2002). Gebaseerd op de kennis dat Kgp en Rgp ook specifiek histatinen kunnen afbreken in combinatie met driedimensionale inzichten ontwikkelde een andere groep FA-70C1 (Kadowaki et al, 2004). Ook deze stof liet een indrukwekkend remmend effect op de groei van Porphyromonas gingivalis zien. Beide onderzoeken zijn illustraties van het belang van de moleculaire genetica bij de ontwikkeling en validatie van target-based geneesmiddelen. Voorbeeld 2. Ook de genoomsequentie van Streptococcus mutans is sinds enige tijd bekend. Deze bacterie, die in staat is snel suikers in zuren om te zetten en bij lage ph nog actief kan zijn, is betrokken bij cariës (Loesche, 1986). De belangrijkste virulentie-eigenschappen van deze bacterie zijn zuurresistentie en biofilmvorming. Ook voor deze bacterie zijn via knock-out -stammen veel genen geïdentificeerd die betrokken zijn bij deze processen, zoals vicrk, een signaaloverdrachtsysteem dat betrokken is bij beide processen, en clp, een gen dat bij zuurresistentie belangrijk is (Lemos en Burne, 2002; Senadheera et al, 2005; Deng et al, 2007a; Deng et al, 2007b). Onlangs werd een nieuwe klasse van antibiotica, de acyldepsipeptiden, ontwikkeld specifiek tegen ClpP (Brötz-Oesterhelt et al, 2005). Deze antibiotica bleken, via verstoring van gecontroleerde bacteriële eiwitrecycling, actief tegen grampositieve bacteriën, zowel in vitro als in bacterie-infectiemodellen. De moleculaire genetica heeft via de knock-outstrategie inderdaad een groot aantal targets in orale pathogenen kunnen identificeren, maar deze strategie is relatief bewerkelijk en tijdrovend. Een alternatieve moleculair genetische strategie, de antisense RNA-interferentietechniek, is een krachtig nieuw gereedschap gebleken. Deze techniek, waarmee de 95

4 Virulentie van geassocieerde genen Stamspecifieke genen Micro-array expressietechnologie Genoomvergelijkende analyses Levende verzwakte kandidaten voor vaccin Genoomsequentie Reverse vaccinology Geconserveerde eiwitten in oppervlakte Genoomvergelijkende analyses activiteit van een gen (artificieel) kan worden gedempt of geneutraliseerd, is al toegepast in de bacterie Staphylococcus aureus, in mycobacteriën en in de pathogene schimmel Candida albicans om belangrijke genen en virulentiefactoren te identificeren (Parish en Stoker, 1997; De Backer et al, 2001; Ji et al, 2001). Deze methode bleek ook effectief in het valideren van targets voor geneesmiddelen en onderzoek naar het mechanisme van nieuwe remmers (Ji et al, 2004). Ook in Streptococcus mutans is de RNA-interferentietechniek gebruikt om de functie van genen te bestuderen (Wang en Kuramitsu, 2005). In combinatie met de genoominformatie kan het een krachtig gereedschap worden in het selecteren van nieuwe targets voor specifieke remmers van Streptococcus mutans. Ontwikkeling van antibacteriële middelen in vivo Microbiële pathogenen in de mond zijn onderdeel van de gehele orale microflora. Ze groeien in biofilms (plaque) in microbiële gemeenschappen. In een dergelijke complexe microbiële gemeenschap komen allerlei interacties tussen de verschillende bacteriën voor en vanzelfsprekend zijn er ook interacties met de harde en zachte weefsels en met de cellen van de gastheer. Deze interacties kunnen tot zodanig veranderde microbiële eigenschappen leiden dat targets voor antimicrobiële middelen, die in vitro zijn geïdentificeerd en gevalideerd, geen of weinig effect hebben wanneer ze in vivo worden toegepast. Zoals al opgemerkt door Rediers et al (2005) laten eigenschappen die van groot belang zijn in de (orale) microbiële ecologie, zeer waarschijnlijk in vitro slechts subtiele effecten zien en waarschijnlijk nooit een volledig uitgeschakeld micro-organisme. Juist deze genen/ targets zijn dus in vitro nauwelijks op te sporen. Er zijn moleculaire technieken voorhanden die ook in in vivo-onderzoeken kunnen worden gebruikt. Micro-arrays Eiwitten in oppervlakte van cel In vivo aanwezige eiwitten in oppervlakte Op eiwit gebaseerde kandidaten voor vaccin Micro-array expressietechnologie & proteomics Afb. 2. Illustratie van de verschillende processen en technologieën die de basis vormen voor genoomgebaseerde vaccinontwikkeling (aangepast op basis van Scarselli et al, 2005). en ook proteomics kunnen worden gebruikt op biofilms met orale pathogenen en in plaquemonsters, maar het is lastig voldoende materiaal voor dit soort metingen te verkrijgen (Luppens en Ten Cate, 2005; Shemesh et al, 2007). Meer subtiele methoden, waarvan de voor- en nadelen zijn besproken door Rediers et al (2005), hebben nog nauwelijks hun weg gevonden in specifieke onderzoeken binnen de mondgezondheid. Vaccinatie Vaccins zijn geneesmiddelen die worden toegediend voordat een infectie plaatsvindt en ze zijn bedoeld om een infectieziekte te voorkomen. Vaccins hebben slechts een beperkte toepassing omdat ze specifiek zijn voor 1 ziekteverwekker of zelfs voor 1 variant (serotype) van een pathogeen micro-organisme (Cheng et al, 2003). Vaccinatie wordt in de mondzorg ook al lang overwogen. Klinische onderzoeken hebben aangetoond dat een immuunrespons van de orale mucosa tegen antigenen van orale pathogene micro-organismen inderdaad de pathogenese van orale infecties kan beïnvloeden (Persson, 2005; Taubman en Nash, 2006). Tot nu toe zijn alle vaccins die voorhanden zijn, gebaseerd op bijvoorbeeld dode of verzwakte micro-organismen, chemisch geïnactiveerde toxinen en gezuiverde antigenen. Het ontwikkelen van dit type vaccins kan jaren duren en regelmatig blijkt het lastig om een vaccin te produceren dat ook daadwerkelijk tegen infecties beschermt (Scarselli et al, 2005). Ook in de ontwikkeling van vaccins, biedt genomics grote mogelijkheden. De tijd om vaccins te ontwikkelen kan aanzienlijk worden verkort. Ook kunnen projecten die in het verleden niet succesvol waren opnieuw worden aangepakt (Grandi, 2003). Afbeelding 2 illustreert dat genoominformatie kan worden gebruikt in de meer traditionele ontwikkeling van vaccins, maar vooral ook in de zogenaamde reverse vaccinology. In het reverse vaccinology-proces worden vaccins ontwikkeld die op eiwitten zijn gebaseerd en waarvoor de kandidaten worden geselecteerd vanuit de genoominformatie via computeranalyses. De lokalisatie op of in de cel van alle eiwitten die op het genoom zijn gecodeerd, wordt via zogenaamde bio-informatica voorspeld. Alle eiwitten waarvan wordt voorspeld dat ze op het oppervlak van de cel aanwezig zijn, kunnen als een eerste groep kandidaten worden geselecteerd. Deze set van potentiële antigenen kan vervolgens worden gevolgd via micro-arrays of proteomics om te achterhalen of ze ook daadwerkelijk worden geactiveerd door het micro-organisme. Voor toepassingen in de mondzorg is via deze strategie een vaccin tegen Porphyro- 96

5 Deng en Crielaard: Microbiële genetica monas gingivalis ontwikkeld (Ross et al, 2001). Vanuit een genoomsequentie van genen werden via bioinformatica 120 kandidaten geselecteerd. Deze kandidaten werden vervolgens via moleculair biologische technieken geproduceerd en gescreend met antisera tegen Porphyromonas gingivalis. De 40 kandidaten die in deze screening positief bleken, werden gezuiverd en getest in een muisinfectiemodel. Uiteindelijk bleken 2 nieuwe vaccins inderdaad significant tot bescherming tegen infectie met Porphyromonas gingivalis te leiden. Andere experimentele preventie- en behandelstrategieën Kennis van de moleculaire genetica van bacteriën leidt niet alleen tot nieuwe kansen in allerlei target-based-strategieën, maar blijkt ook van waarde in alternatieve nieuwe preventiestrategieën, zoals de vervangingstherapie en de steeds populairder wordende toepassing van probiotica. De vervangingstherapie gaat ervan uit dat een nietpathogene variant van een oraal micro-organisme in de orale microflora de kolonisatie van allerlei pathogenen kan voorkomen. Om op die manier cariës te kunnen voorkomen werd een Streptococcus mutans-stam gemaakt die geen lactaat meer kan produceren (en dus niet sterk kan verzuren), maar wel een verhoogde hoeveelheid toxine tegen concurrerende Streptococcus mutans-stammen maakt. Deze vervangingsstam bleek inderdaad in staat cariogene varianten uit de mond te verdringen (Hillman, 2002). Onlangs werd deze therapie nog verfijnd en veiliger gemaakt door deze niet-cariogene stam verder te muteren en afhankelijk te maken van de aanwezigheid van een specifieke voedingsstof. Mocht de therapie tot onverwachte effecten leiden, dan kan de vervangingsstam worden gestopt door de specifieke voedingsstof niet meer te geven (Hillman et al, 2007). Probiotica zijn levende micro-organismen die na consumptie de gezondheid bevorderen (Gorbach, 2002). Recente onderzoeken hebben aangetoond dat probiotica ook de mondgezondheid kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld door het reduceren van de hoeveelheid pathogene microorganismen in de mond. Een kaas met probiotica bleek effectief in het terugdringen van de hoeveelheid schimmels in de mond van ouderen (Hatakka et al, 2007). Omdat het voor de ontwikkeling van probiotica die de mondgezondheid bevorderen noodzakelijk is de moleculaire mechanismen van het gezondheidsbevorderende effect te begrijpen, zullen ook hier genomics en moleculaire genetica een grote rol gaan spelen (Meurman, 2005). Metagenomics De meeste in dit artikel besproken strategieën richten zich specifiek op 1 pathogeen micro-organisme. Zoals al aangegeven, maken de micro-organismen in de mond deel uit van een complex micro-ecosysteem. Meer dan 700 verschillende soorten micro-organismen kunnen in de mond worden aangetroffen en de helft hiervan kan (nog) niet worden geïsoleerd en dus ook niet worden bestudeerd (Aas et al, 2005; Starke et al, 2006). Wel is duidelijk dat tijdens infecties het hele micro-ecosysteem verschuift en dat ook (veel van) de nog niet gekarakteriseerde micro-organismen deel uitmaken van de pathogene flora. Om ook inzicht te krijgen in de rol van deze unculturables in de pathogenese, wordt op dit moment een nieuw scala aan moleculair genetische technieken ontwikkeld waarmee via zogenaamde metagenomics de gehele orale microflora (grotendeels) in kaart kan worden gebracht (Kuramitsu, 2003). In de microbiële ecologie is metagenomics een van de belangrijkste nieuwe onderzoeksvelden, waarin plaque een centrale rol kan gaan spelen. In onderzoeken is al aangetoond dat zelfs een gezonde orale flora zeer variabel is, sterk verschilt van persoon tot persoon en van locatie tot locatie in 1 mond (Aas et al, 2005). Bij parodontitis hangt de samenstelling van de flora sterk af van de diepte van de pockets (Socransky et al, 1998). Slotbeschouwing De in dit artikel besproken voorbeelden geven aan dat onderzoek naar inzichten in en controle van de orale pathogene micro-organismen voor nieuwe preventie- en behandelstrategieën zich laat leiden door de meest recente inzichten in de microbiële genetica. Onderzoekers gebruiken moderne moleculaire technieken en maken gebruik van genetische databases en computeralgoritmen (bio-informatica) tijdens de speurtocht naar nieuwe antibacteriële geneesmiddelen en vaccins. In de meeste gevallen bevindt het onderzoek zich echter nog in de beginfase, waarin targets worden geïdentificeerd. In de vervolgstappen staan ook nog de nodige problemen te wachten (Sams-Dodd, 2005). Het is echter geheel duidelijk dat genomics ook een belangrijke plaats zal hebben binnen dit ontwikkelingsproces (Mills, 2006). In tegenstelling tot de meeste andere infectieziekten worden infecties in de mond veroorzaakt door een complex mengsel van micro-organismen. Dit inzicht wordt steeds vaker meegenomen in de ontwikkeling en de evaluatie van nieuwe preventie- en behandelstrategieën. Er is een duidelijke trend waar te nemen van verschuiving van onderzoeken gebaseerd op de specifieke plaquehypothese naar onderzoeken gebaseerd op de ecologische plaquehypothese. Dit betekent dat modelsystemen en experimentele technieken verder worden ontwikkeld en bijgesteld en dat metagenomics een steeds belangrijkere rol gaat spelen. Literatuur > Aas JA, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst FE. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol 2005; 43: > Ajdic'D, McShan WM, McLaughlin RE, et al. Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a cariogenic dental pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: > Backer MD De, Nelissen B, Logghe M, et al. An antisense-based functional genomics approach for identification of genes critical for growth of Candida albicans. Nat Biotechnol 2001; 19:

6 > Brötz-Oesterhelt H, Beyer D, Kroll HP, et al. Dysregulation of bacterial proteolytic machinery by a new class of antibiotics. Nat Med 2005; 11: > Cate JM ten. Fluorides in caries prevention and control: empiricism or science. Caries Res 2004; 38: > Cheng Q, Wang S, Salyers AA. New approaches for anti-infective drug discovery: antibiotics, vaccines and beyond. Curr Drug Targets Infect Disord 2003; 3: > Curtis MA, Aduse Opoku J, Rangarajan M, et al. Attenuation of the virulence of Porphyromonas gingivalis by using a specific synthetic Kgp protease inhibitor. Infect Immun 2002; 70: > Dahlén G. Role of suspected periodontopathogens in microbiological monitoring of periodontitis. Adv Dent Res 1993; 7: > Davey ME, Duncan MJ. Enhanced biofilm formation and loss of capsule synthesis: deletion of a putative glycosyltransferase in Porphyromonas gingivalis. J Bacteriol 2006; 188: > Deng DM, Liu MJ, Cate JM ten, Crielaard W. The VicRK system of Streptococcus mutans responds to oxidative stress. J Dent Res 2007a; 86: > Deng DM, Cate JM ten, Crielaard W. The adaptive response of Streptococcus mutans towards oral care products: involvement of the ClpP serine protease. Eur J Oral Sci 2007b; 115: > Duncan MJ. Oral microbiology and genomics. Periodontol ; 38: > Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391: > Gorbach SL. Probiotics in the third millennium. Dig Liver Dis. 2002; 34: S2-S7. > Grandi G. Rational antibacterial vaccine design through genomic technologies. Int J Parasitol 2003; 33: > Hatakka K, Ahola AJ, Yli-Knuuttila H, et al. Probiotics reduce the prevalence of oral candida in the elderly -- a randomized controlled trial. J Dent Res 2007; 86: > Hillman JD. Genetically modified Streptococcus mutans for the prevention of dental caries. Antonie Van Leeuwenhoek 2002; 82: > Hillman JD, Mo J, McDonell E, Cvitkovitch D, Hillman CH. Modification of an effector strain for replacement therapy of dental caries to enable clinical safety trials. J Appl Microbiol 2007; 102: > Holt SC, Ebersole J, Felton J, Brunsvold M, Kornman KS. Implantation of Bacteroides gingivalis in nonhuman primates initiates progression of periodontitis. Science 1988; 239: > Holt SC, Kesavalu L, Walker S, Genco CA. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol ; 20: > Ji Y, Zhang B, Van SF, et al. Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA. Science 2001; 293: > Ji Y, Yin D, Fox B, Holmes DJ, Payne D, Rosenberg M. Validation of antibacterial mechanism of action using regulated antisense RNA expression in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 2004; 231: > Kadowaki T, Baba A, Abe N, et al. Suppression of pathogenicity of Porphyromonas gingivalis by newly developed gingipain inhibitors. Mol Pharmacol. 2004; 66: > Kleinberg I. A mixed-bacteria ecological approach to understanding the role of the oral bacteria in dental caries causation: an alternative to Streptococcus mutans and the specific-plaque hypothesis. Crit Rev Oral Biol Med 2002; 13: > Korithoski B, Krastel K, Cvitkovitch DG. Transport and metabolism of citrate by Streptococcus mutans. J Bacteriol 2005; 187: > Kuramitsu HK. Molecular genetic analysis of the virulence of oral bacterial pathogens: an historical perspective. Crit Rev Oral Biol Med. 2003; 14: > Lemos JA, Burne RA. Regulation and physiological significance of ClpC and ClpP in Streptococcus mutans. J Bacteriol 2002; 184: > Len AC, Harty DW, Jacques NA. Stress-responsive proteins are upregulated in Streptococcus mutans during acid tolerance. Microbiology 2004; 150: > Loesche WJ. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Rev 1986; 50: > Luppens SB, Cate JM ten. Effect of biofilm model, mode of growth, and strain on streptococcusmutans protein expression as determined by two-dimensional difference gel electrophoresis. J Proteome Res 2005; 4: > Marri PR, Hao W, Golding GB. Gene gain and gene loss in streptococcus: is it driven by habitat? Mol Biol Evol. 2006; 23: > Marsh PD. Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease. Adv Dent Res 1994; 8: > Meurman JH. Probiotics: do they have a role in oral medicine and dentistry? Eur J Oral Sci 2005; 113: > Mills SD. When will the genomics investment pay off for antibacterial discovery? Biochem Pharmacol 2006; 71: > Nakao R, Senpuku H, Watanabe H. Porphyromonas gingivalis gale is involved in lipopolysaccharide O-antigen synthesis and biofilm formation. Infect Immun 2006; 74: > Nakayama K. Molecular genetics of Porphyromonas gingivalis: gingipains and other virulence factors. Curr Protein Pept Sci 2003; 4: > Narimatsu M, Noiri Y, Itoh S, Noguchi N, Kawahara T, Ebisu S. Essential role for the gtfa gene encoding a putative glycosyltransferase in the adherence of Porphyromonas gingivalis. Infect Immun 2004; 72: > Overbye KM, Barrett JF. Antibiotics: where did we go wrong? Drug Discov Today 2005; 10: > Parish T, Stoker NG. Development and use of a conditional antisense mutagenesis system in mycobacteria. FEMS Microbiol Lett 1997; 154: > Park Y, James CE, Yoshimura F, Lamont RJ. Expression of the short fimbriae of Porphyromonas gingivalis is regulated in oral bacterial consortia. FEMS Microbiol Lett 2006; 262: > Persson GR. Immune responses and vaccination against periodontal infections. J Clin Periodontol 2005; 32: > Potempa J, Sroka A, Imamura T, Travis J. Gingipains, the major cysteine proteinases and virulence factors of Porphyromonas gingivalis: structure, function and assembly of multidomain protein complexes. Curr Protein Pept Sci 2003; 4: > Rediers H, Rainey PB, Vanderleyden J, De Mot R. Unraveling the secret lives of bacteria: use of in vivo expression technology and differential fluorescence induction promoter traps as tools for exploring nichespecific gene expression. Microbiol Mol Biol Rev 2005; 69:

7 Deng en Crielaard: Microbiële genetica > Rosamond J, Allsop A. Harnessing the power of the genome in the search for new antibiotics. Science 2000; 287: > Ross BC, Czajkowski L, Hocking D, et al. Identification of vaccine candidate antigens from a genomic analysis of Porphyromonas gingivalis. Vaccine 2001; 19: > Sams-Dodd F. Target-based drug discovery: is something wrong? Drug Discov Today 2005; 10: > Sbordone L, Bortolaia C. Oral microbial biofilms and plaque-related diseases: microbial communities and their role in the shift from oral health to disease. Clin Oral Investig 2003; 7: > Scarselli M, Giuliani MM, Adu-Bobie J, Pizza M, Rappuoli R. The impact of genomics on vaccine design. Trends Biotechnol 2005; 23: > Senadheera MD, Guggenheim B, Spatafora GA, et al. A VicRK signal transduction system in Streptococcus mutans affects gtfbcd, gbpb, and ftf expression, biofilm formation, and genetic competence development. J Bacteriol 2005; 187: > Shemesh M, Tam A, Steinberg D. Differential gene expression profiling of Streptococcus mutans cultured under biofilm and planktonic conditions. Microbiology 2007; 153: > Simionato MR, Tucker CM, Kuboniwa M, et al. Porphyromonas gingivalis genes involved in community development with Streptococcus gordonii. Infect Immun 2006; 74: > Socransky SS. Microbiology of periodontal disease present status and future considerations. J Periodontol 1977; 48: > Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL jr. Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 1998; 25: > Starke EM, Smoot JC, Smoot LM, et al. Technology development to explore the relationship between oral health and the oral microbial community. BMC Oral Health 2006; 6 (Suppl. 1): S10. > Steenbergen TJ van, Winkelhoff AJ van, Velden U van der, Graaff J de. Taxonomy, virulence and epidemiology of black-pigmented Bacteroides species in relation to oral infections. Infection 1989; 17: > Taubman MA, Nash DA. The scientific and public-health imperative for a vaccine against dental caries. Nat Rev Immunol 2006; 6: > Wang B, Kuramitsu HK. Inducible antisense RNA expression in the characterization of gene functions in Streptococcus mutans. Infect Immun 2005; 73: > Watanabe-Kato T, Hayashi JI, Terazawa Y, et al. Isolation and characterization of transposon-induced mutants of Porphyromonas gingivalis deficient in fimbriation. Microb Pathog 1998; 24: > Wenzel RP. Health care-associated infections: major issues in the early years of the 21st century. Clin Infect Dis 2007; 45 (Suppl. 1): S85-S88. Summary Microbial genetics. New possibilities for the prevention and treatment of (oral) infections New insights in the microbial genetics of pathogenic oral microorganisms and the development of a new array of molecular genetic techniques together have led to alternative strategies in the development of antimicrobial agents. In this article the importance of insights in microbial molecular biology for the prevention and treatment of (oral) infectious diseases is illustrated. Following the introduction of relevant terminology, the role of microbial genetics in developing of target-based anti-microbial drugs for prevention and treatment of (oral) infections is discussed. Subsequently, the impact of microbial genetics on vaccine development and several, mainly still experimental, prevention strategies are discussed. Bron D.M. Deng, W. Crielaard Uit de afdeling Cariologie Endodontologie Pedodontologie van het Academisch Centrum voor Tandheelkunde Amsterdam (ACTA) Datum van acceptatie: 10 november 2007 Adres: prof. dr. W. Crielaard, ACTA, Louwesweg 1, 1066 AA Amsterdam w.crielaard@acta.nl 99