Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation Author: Pratiwi, Sylvia U.T. Title: Anti-microbial and anti-biofilm compounds from Indonesian medicinal plants Issue Date:

2 CHAPTER 9 Nederlandse Samenvatting Microbiële resistentie tegen de meeste gebruikte antibiotica neemt steeds meer toe en daarom is het noodzakelijk om nieuwe anti-microbiële medicijnen te ontwikkelen. Daarnaast heeft recent onderzoek laten zien dat biofilms van micro-organismen een verhoogde resistentie bezitten tegen bijna alle antibiotica en het menselijke afweersysteem, wat vaak resulteert in blijvende of moeilijk te bestrijden infecties. De identificatie van nieuwe anti-microbiële middelen, die zowel actief zijn tegen vrij bewegende (planktonische) micro-organismen als micro-organismen aanwezig in biofilms, is daarom erg urgent om infecties beter te kunnen behandelen. Recent onderzoek wijst uit dat er natuurlijke producten de potentie hebben om pathogene microorganismen te bestrijden. Daarbij is gebleken dat planten een belangrijke en interessant bron zijn van verbindingen die een anti-biofilm werking kunnen hebben en dus een rijke bron zijn voor nieuwe moleculen met farmacologische eigenschappen, waarmee nieuwe geneesmiddelen kunnen worden ontwikkeld. Indonesië is een van de landen met een enorme diverse flora en een rijke traditie in het gebruik van medicinale planten. Omdat verschillende Indonesische medicinale planten antimicrobiële verbindingen bevatten leek het waarschijnlijk dat ze ook een bron konden zijn voor antibiofilm verbindingen. Daarom heeft het onderzoek beschreven in dit proefschrift zich gericht op het screenen en identificeren van mengsels met anti-microbiële en anti-biofim activiteit, welke mogelijk kandidaat verbindingen kunnen bevatten voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutica. In Hoofdstuk 1 wordt een uitleg gegeven over biofilms, een cluster van meerdere lagen van cellen, die oppervlakten koloniseren. De bestrijding van een biofilm is moeilijk door het steeds maar weer vormen van nieuwe lagen van cellen en de hoge inherente resistentie tegen anti-microbiële verbindingen en immuun response van de gastheer. Quorum sensing, een cel tot cel communicatie systeem tussen micro-organismen, is onder andere verantwoordelijk voor de vorming van biofilms en speelt dan ook een belangrijke rol bij microbiële pathogeniciteit en antibiotica resistentie. Infecties veroorzaakt door de aanwezigheid van micro-organismen die biofilms vormen zijn van grote zorg in de medische wereld omdat ze in staat zijn oppervlakte van medische hulpmiddelen zoals bijv. implantaten te koloniseren en daardoor te infecteren. 206

3 In vele gevallen moeten die implantaten worden verwijderd om de infectie te genezen. Nieuwe antimicrobiële middelen die een hoge anti-biofim activiteit hebben kunnen hier een oplossing bieden. Zoals eerder genoemd, een interessante bron voor nieuwe anti-biofilm verbindingen zijn met name medicinale planten. Dit komt mede omdat extracten van planten al decennia lang een brede belangstelling hebben gekregen voor het zoeken naar medicijnen van natuurlijke oorsprong. Deze verbindingen worden breed geaccepteerd vanwege de perceptie dat ze veilig zijn en een lange geschiedenis hebben als volksmedicijn ter behandeling en preventie van ziektes en infecties. In dit hoofdstuk worden Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Candida albicans besproken als model micro-organismen voor infecties via biofilm formatie. De screening van 54 ethanol extracten van verschillende Indonesische medicinale planten op de aanwezigheid van antimicrobiële en antibiofim activiteit tegen P. aeruginosa PAO1 en S. aureus Cowan I is beschreven in hoofdstuk 2. De extracten vertoonden een remmend effect op planktonische groei maar, nog interessanter, op de vorming van biofilm-achtige structuren. Bij een minimale concentratie van 0.12 mg/ml, wordt biofilm vorming van P. aeruginosa PAO1 geremd evenals die van S. aureus Cowan I. De volgende 5 plant ethanol extracten vertonen deze remmende activiteit: Kaempferia rotunda L., Caesalpinia sappan L., Cinnamomum burmanii Nees ex Bl., C. sintoc L., en Nymphaea nouchali Burm.f. Dezelfde extracten lieten ook een verstoring van reeds gevormde biofilms door eerder genoemde bacteriën zien maar wel bij hogere concentraties. Ook beperkte bacteriostatische activiteit werd waargenomen. Deze eigenschappen kunnen mogelijk klinisch toegepast worden om infectieve biofilms te behandelen in combinatie met bestaande antibiotica. Daarnaast zou een toepassing ookindustrieel kunnen zijn zoals bijvoorbeeld het verwijderen van gevormde biofilms uit waterpijpleidingen (Kim en Park, 2013). In hoofdstuk 3 en 4 is de screening voor anti-biofilm verbindingen in 29 essentiële oliën van Indonesische medicinale planten tegen P. aeruginosa PAO1, S. aureus Cowan I, en C. albicans ATCC biofilms beschreven. Candida cellen, zoals vele andere micro-organismen, zijn in staat zich aan oppervlakten van medische hulpmiddelen te hechten, te koloniseren en biofilms te vormen. De anti-biofilm activiteit van essentiële oliën werd bevestigd door confocale laser scanning microscopie analyse, samen met een dood/levende kleuring om dode en levende cellen te monitoren. Essentiele olie van C. burmanii en M. aromatica lieten 50% remming bij een concentratie van 0.25% v/v zien van P. aeruginosa PAO1 en S. aureus Cowan I planktonische groei (PMIC 50 ). Tevens werd aangetoond dat essentiële olie van C. burmanii en M. aromatica 50% inhibitie laat zien op de (MBIC 50 ) biofilm- 207

4 vorming van P. aeruginosa PAO1 en S. aureus Cowan bij een concentratie 0.03 % v/v, terwijl een hogere concentratie (0.12 % v/v) nodig was van beide oliën om 50% van de reeds gevormde biofilms van P. aeruginosa PAO1 en S. aureus Cowan I af te breken. De essentiele olie van C. burmanii, M. aromatica, Ocimum basillicum en Litsea cubeba (zaden) lieten een duidelijke anti-schimmel activiteit zien tegen de planktonische groei van C. albicans. Deze zelfde olie veroorzaakt ook remming van de vorming van C. albicans biofilm gedurende de drie verschillende stadia van biofilm ontwikkeling (sub-pmic concentratie). Gevonden werd dat de remming van initiële biofilm vorming door deze essentiële oliën concentratie afhankelijk is. In de aanwezigheid van de geteste oliën, wordt een significante afname van biofilm biomassa gevonden vergeleken met de negatieve controle (biofilm cellen zonder toevoeging van essentiële oliën die duidelijk dicht op elkaar gelegen lagen van cellen lieten zien). Door GC-MS zijn ook de belangrijkste componenten die aanwezig zijn in cinnamomum oil en massoia olie geïdentificeerd. Cinnamic aldehyde (92.0 %) is de meest aanwezige component in C. burmanii essentiële olie, en Massoialactone (92.1 %) is de hoofdcomponent van M. aromatica essentiële olie. De resultaten verkregen in deze studie laten duidelijk zien dat de olie van C. burmanii en M. aromatica een interessante bron zijn voor mogelijke anti-biofilm verbindingen waarmee strategieën kunnen worden ontwikkeld om infecties veroorzaakt door P. aeruginosa, S. aureus end C. albicans biofilms te bestrijden. In hoofstuk 5 is de screening van de 54 ethanol extract en 29 essentiële oliën van Indonesische medicinale planten beschreven op mogelijke remming van het microbiële quorum sensing mechanisme met behulp van de quorum sensing biosensor Chromobacterium violaceum ATCC (wild type stam) en C. violaceum CV026 mutant stam (maakt geen signaal moleculen). Ook is het effect van de extracten en essentiële oliën op de beweeglijkheid van de pathogene P. aeruginosa PAO1 stam geanalyseerd, omdat is aangetoond dat beweeglijkheid geassocieerd is met de virulentie van deze stam en dat bewegelijkheid nodig is voor biofilm vorming. Van de 54 gescreende planten ethanol extracten en 29 planten essentiële oliën vertoonde N. nouchali ethanol extract, Syzygium aromaticum essentiële olie en M. aromatica essentiële olie een variërend remmend niveau van violacein-productie. Een significante reductie in quorum sensing, gerelateerd aan beweeglijkheid van P. aeruginosa PAO1 ten opzichte van de controle, werd ook gevonden. Deze planten extracten en essentiële oliën kunnen gebruikt worden voor fractionering, identificatie en karakterisering van de actieve verbinding(en). 208

5 Gebaseerd op het onderzoek beschreven in hoofdstuk 3, 4 en 5 waarin de activiteit van M. aromatica essentiële olie om zowel biofilm vorming van P. aeruginosa, S. aureus en C. albicans, te remmen als de violacein productie van C. violaceum en ook de beweeglijkheid- gerelateerde quorum sensing activiteit van P. aeruginosa te verminderen, is de actieve verbinding uit dit planten preparaat geïsoleerd en dit staat beschreven in hoofdstuk 6. Preparatie van dunne laag chromatografie tezamen met GC-MS en 1 H-NMR werden gebruikt om de actieve verbinding te isoleren en te identificeren. De resultaten van bioautografie analyse lieten zien dat massoia lactone (synonym: 5- Hydroxy-2-Decenoic Acid Lactone; 2H-Pyrane-2-one, 5,6-dihydro-6-penthyl-) de actieve component is in massoia oil. De microtiter broth methode werd uitgevoerd om zowel de anti-schimmel, antibacteriële activiteit en de anti-biofilm activiteit van massoia lactone te bepalen. Ook werden deze activiteiten in combinatie met standaard anti-bacteriële en anti-schimmel verbindingen (antibiotica) bepaald. Massoia lactone vertoont anti-biofilm activiteit tegen C. albicans ATCC bij een concentratie of 25 µg/ml. Biofilm vorming van P. aeruginosa PAO1 en S. aureus Cowan I wordt ook gedeeltelijk geremd door massoia lactone bij concentraties van 50 en 100 µg/ml. De anti-biofilm activiteit van massoia lactone is drie tot vier keer groter in combinatie met antibiotica. Ook werd een initiële toxiciteit studie met massoia lactone d.m.v. een hemolysis assay met humane rode bloedcellen uitgevoerd. Bij de hoogste concentratie (100 µg/ml), veroorzaakt massoia lactone bij 12.4±0.9 % menselijke bloedcellen, hemolyse t.o.v. Triton X-100 dat 100% hemolyse gaf. Dit resultaat laat zien dat in de range concentraties die getest zijn, massoia lactone minder toxisch is voor human erythrocyten. De resultaten die in dit proefschrift beschreven zijn laten zien dat massoia lactone een duidelijke activiteit heeft tegen microbiële biofilms in vitro en daarom een duidelijke potentie heeft als therapeuticum voor biofilm-geassocieerde microbiële infecties. In hoofdstuk proefschrift. 7 staat een korte discussie over de samengevatte resultaten behaald in dit 209

6 210