De bijdrage van M-FISH aan de moleculaire diagnostiek in de hemato-oncologie

Transcriptie

1 De bijdrage van M-FISH aan de moleculaire diagnostiek in de hemato-oncologie Auteurs Trefwoorden B. Poppe, N. Van Roy, N. Yigit, A. De Paepe en F. Speleman hematologie, M-FISH, multiplex-fish, oncologie Samenvatting Multiplex-FISH (M-FISH) is één van de belangrijkste bijdragen aan de moleculaire cytogenetica in de laatste jaren. Het toepassingsgebied van M- FISH omvat vooral het ontrafelen van complexe chromosomale afwijkingen en de identificatie van cryptische herschikkingen in normale karyotypes. Hoewel M-FISH in het wetenschappelijk onderzoek een belangrijke bijdrage levert, blijft de bijdrage in de routinediagnostiek beperkt. De vraag blijft welke plaats M-FISH in zal nemen ten opzichte van nieuwere technologieën die het mogelijk maken genetische afwijkingen nauwkeuriger te beschrijven. (Ned Tijdschr Hematol 2007;4:251-5) Inleiding Conventioneel cytogenetisch onderzoek of karyotypering is van belangrijke waarde in de hematologie en wordt ook aangewend in de studie van bepaalde tumorentiteiten. Het vaststellen van een specifiek chromosomaal defect kan een bijdrage leveren aan een accurate diagnostiek en laat toe de prognose van een bepaalde aandoening beter in te schatten. De geschiedenis van het Philadelphiachromosoom heeft bovendien aangetoond dat cytogenetisch onderzoek een uitgangspunt kan vormen voor het ontwikkelen van nieuwe, gerichte behandelingsvormen. Karyotypering is in essentie een analyse van het aantal en de structuur van de chromosomen van een bepaald celtype. Cellen worden hiervoor in cultuur gebracht en geoogst en chromosomen worden hierna gevisualiseerd met een van de bestaande banderingstechnieken. Karyotypering laat een globale evaluatie van het onderzochte genoom toe, maar heeft ook belangrijke beperkingen. Compactie van het chromatine in het metafase stadium beperkt de resolutie van conventioneel cytogenetisch onderzoek tot de detectie van herschikkingen van minstens verschillende megabasen groot. Verder zijn voor het opstellen van een karyotype vitale, delende cellen nodig. Daarnaast is het volledige karyotyperingsproces arbeidsintensief. In het geval van complexe chromosomale herschikkingen is het bovendien vaak moeilijk of soms onmogelijk te bepalen welke chromosomen in de herschikkingen betrokken zijn. De cryptische herschikkingen zijn een laatste beperking van karyotypering. Deze ontstaan uit de uitwisseling van kleine of sterk gelijkende chromosoomfragmenten en worden per definitie gemist door karyotypering. Om deze redenen werden een aantal moleculair cytogenetische technieken ontwikkeld die de tekortkomingen van karyotypering ten minste gedeeltelijk moeten verhelpen. Fluorescentie-in-situhybridisatie Fluorescentie-in-situhybridisatie (FISH) vormt nog steeds één van de belangrijkste aanvullingen op conventioneel cytogenetisch onderzoek. FISH is gebaseerd op de intrinsieke eigenschap van DNAmoleculen of probes om te binden aan complementaire sequenties die aanwezig zijn in het onderzochte genoom (zie Figuur 1). Microscopische detectie van de probes gebeurt door fluorescente moleculen die rechtstreeks gebonden zijn aan het probe-dna of v o l. 4 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

2 opgroeien probe labeling denaturatie, hybridisatie en tegenkleuring Figuur 1. Het principe van fluorescentie-in-sityhybridisatie. Genomische kloons worden geïsoleerd uit een getransfecteerde E. coli-cultuur na alkalische lysis en acetaatprecipitatie. De probe wordt gelabeld: ofwel direct door incorporatie van een fluorochroom, ofwel met een hapteen voor indirecte detectie. De gelabelde kloons worden daarna gehybridiseerd op metafase chromosomen of interfase nucleï en gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop. gekoppeld zijn aan antilichamen die hapteengemodificeerde probes binden. FISH laat toe om specifieke herschikkingen in metafase, maar ook in interfase kernen, te detecteren, waardoor delende cellen of vitaal weefsel niet meer nodig zijn. Met de afronding van de sequentiebepaling van het humane genoom kwam een toenemend aantal probes, specifiek voor een chromosomale regio of voor een bepaald gen, beschikbaar. Probes voor de regio of het gen van interesse kunnen eenvoudig geselecteerd worden in een van de verschillende genoombrowsers ( edu en Momenteel kan met FISH een herschikking van een gen bij een bepaalde aandoening met een grote gevoeligheid en specificiteit onderzocht worden. De introductie van een toenemend aantal krachtige fluorochromen, de ontwikkeling van specifieke chromosoombanken of libraries, technologische ontwikkelingen in de fluorescentiemicroscopie en beeldanalysesoftware leidden uiteindelijk tot de introducie van multiplex-fish (M-FISH). M-FISH: methodologie De specificiteit van FISH vormt een nadeel wanneer het aankomt op het analyseren van complexe chromosoomherschikkingen. Verschillende technieken, waaronder M-FISH, spectral karyotyping (SKY) en COmbined Binary Ratio Labeling (COBRA) trachten hierop een antwoord te formuleren en combineren de voordelen van FISH en karyotypering. 1-3 Elk van deze technieken laat toe om aan ieder afzonderlijk chromosoom een specifieke kleur toe te kennen. In essentie is de gebruikte technologie in elk van deze onderzoekstechnieken gelijkwaardig. Alle maken gebruik van een probeset die bestaat uit verschillend gemerkte chromosoombanken, die worden gehybridiseerd op metafase chromosomen. Alleen het opnemen en analyseren van de hybridisatiepatronen vereist een verschillende infrastructuur. De M-FISH-techniek werd beschreven door Michael Speicher en is gebaseerd op het onderscheid van 5 fluorochromen met evenveel optische filters met een beperkte spectrale bandbreedte. M-FISH steunt op combinatielabeling voor de detectie van de 24 humane chromosomen. De 5 verschillende fluorochromen (en een 6 e fluorochroom voor tegenkleuring) worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Met behulp van een charged coupled device (CCD)-camera worden sequentieel beelden opgenomen van de 6 verschillende fluorochromen en met specifieke computersoftware (bijvoorbeeld ISIS, MetaSystems, Altlussheim, Duitsland) omgezet tot een 24-kleurenbeeld. Hierbij wordt elke kleurencombinatie geassocieerd met een vooraf gedefinieerd chromosoom (zie Figuur 2 op pagina 253). Naast chromosoombanken werden ook andere probesets geïntroduceerd. Alternatieve multikleurtoepassingen zoals M-TEL (12-kleuren-FISH-toepassing van subtelomeerprobes) en mband (multikleurtoepassing met regiospecifieke probes) kwamen hierdoor beschikbaar. 4,5 Toepassingen van M-FISH De toepassingen van M-FISH zijn in eerste instantie gericht op de detectie en identificatie van chromosomale herschikkingen die met conventioneel cytogenetisch onderzoek moeilijk onderzocht kunnen worden. De prestaties van M-FISH werden daarom in belangrijke mate geëvalueerd in de studie van complexe chromosomale afwijkingen en in het identificeren van cryptische herschikkingen. M-FISH bleek zijn volledige potentieel te kunnen ontplooien in het snel en nauwkeurig beschrijven van complexe chromosomale afwijkingen in hematologische maligniteiten, solide tumoren en cellijnen. Wij voerden als eersten een uitgebreide studie uit bij acute myeloïde leukemie (AML) en myelodysplastisch syndroom (MDS) met complexe chromosomale afwijkingen. 6 In de complexiteit van de n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 4 n r

3 Figuur 2. Multiplex-FISH. Chromosoombanken (vaak verkregen door degenerate oligonucleotide primed (DOP)-PCR-geamplificeerde, gemicrodissecteerde chromosomen) worden combinatorisch gelabeld met verschillende fluorochromen of haptenen en gehybridiseerd op metafase chromosomen. Sequentiële opnames en analyse maken het mogelijk een afzonderlijke kleur toe te kennen aan elk afzonderlijk chromosoom, wat het beschrijven van complexe chromosomale afwijkingen sterk vergemakkelijkt. karyotypes werd een beperkt aantal terugkerende herschikkingen geïndentificeerd: volledig of partieel chromosoom 5- of 7-verlies, 3q26-herschikkingen en MLL-amplificatie. Bovendien werd aangetoond dat chromosoomafwijkingen die cytogenetisch als deleties beschreven werden, eigenlijk cryptische ongebalanceerde translocaties zijn. In hieropvolgende studies werden deze bevindingen onafhankelijk bevestigd door andere onderzoeksgroepen. Cytogenetische informatie is een van de voornaamste prognostische indicatoren bij hematologische maligniteiten. Een belangrijk aantal leukemieën vertoont bij conventioneel cytogenetisch onderzoek een normaal karyotype: de prognose van deze aandoeningen is daarom meestal onduidelijk. Bij leukemieën met een normaal karyotype werden daarom M-FISH-studies gestart met het oog op het identificeren van cryptische herschikkingen. Standaard-M-FISH-onderzoek bleek hierin relatief teleurstellend: slechts een beperkt aantal terugkerende chromosomale herschikking werd gedetecteerd in de meeste studies, zowel bij AML, MDS en acute lymfatische leukemie (ALL). In een M-FISH-screening op ALL bij kinderen werd evenwel een cryptische t(7;11)(q35;q24) geïdentificeerd, met betrokkenheid van de TCRB-locus. 7 Deze observatie vormde het uitgangspunt voor het beschrijven van een nieuwe recurrente herschikking in T-ALL, de inv(7)(p15q35), geassocieerd aan ectopische HOXAgenexpressie. 8 Licht gemodificeerde onderzoekstechnieken kenden eveneens resultaat. Met M-TEL werd bij AML bij kinderen de t(5;11)(q35;p15.5) geïdentificeerd, die resulteert in de NUP98/NSD1-fusie. 9 Met een aangepaste M-FISH-techniek ( interspersed polymerase chain reaction multiplex (IPM)-FISH), die subtelomerische herschikkingen gevoeliger kan detecteren, werd een nieuwe recurrente cryptische t(5;14)(q35;32) in T-ALL beschreven. 10 Deze herschikking geeft aanleiding tot ectopische HOX11L2-expressie en blijkt één van de meest voorkomende genetische defecten in T-ALL, voornamelijk bij kinderen, en is geassocieerd met een intermediaire prognose. 11,12 Bovenal hebben M-FISH-technieken hun dienst bewezen in het wetenschappelijk onderzoek. Snel na hun introductie eigenden deze technieken zich snel een plaats toe naast de andere courante moleculair cytogenetische onderzoeksmethodes. M-FISH bleek bijzonder goed presterend en waardevol in de studie van de chromosoomafwijkingen in cellijnen, en was in staat de chromosomale basis van met andere technieken beschreven genetische afwijkingen te verklaren. In de routinediagnostiek is de waarde van M-FISH veel beperkter. Het identificeren van een complex karyotype op zich is reeds prognostisch informatief. Dit is mogelijk met een conventioneel cytogenetisch onderzoek, alhoewel de betrokken chromosomen op die manier niet geïdentificeerd kunnen worden. De rol van M-FISH is hierin dus per definitie gering. Enkel wanneer het vermoeden van een recurrente herschikking binnen een complex karyotype bestaat, kan v o l. 4 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e

4 Aanwijzingen voor de praktijk 1. Multiplex-FISH is momenteel de krachtigste techniek om complexe chromosomale afwijkingen te beschrijven. 2. Afgeleide multikleurtoepassingen identificeerden cryptische herschikkingen: de inv(7)(p15q35) met HOXA-overexpressie in T-ALL, de t(5;11)(q35;p15.5) resulterend in de NUP98/NSD1-fusie in AML bij kinderen en de t(5;14)(q35;32) die geassocieerd is met ectopische HOX11L2-expressie in T-ALL. 3. De waarde van multiplex-fish is essentieel voor de wetenschap. Voor de routine hemato-oncologische kliniek is gerichte FISH diagnostisch en prognostisch informatiever. M-FISH een waarde hebben in het routineonderzoek. Vaak is gerichte FISH in deze context bovendien prognostisch en diagnostisch informatiever. Beperkingen van M-FISH De kwaliteit en gevoeligheid van een M-FISHexperiment zijn sterk afhankelijk van de onderzochte metafase preparaten. Vaak zijn metafasen die verkregen zijn uit vaste tumoren en hematologische maligniteiten van mindere kwaliteit en in sommige gevallen kunnen zelfs helemaal geen mitosen verkregen worden. Verder dienen de individuele chromosomen goed gespreid te zijn, aangezien de juiste chromosomale oorsprong van overlappende stukken chromosoommateriaal moeilijk of niet bepaald kan worden. Intrachromosomale herschikkingen (inversies, deleties of duplicaties van chromosoomsegmenten) kunnen niet of slechts moeilijk met 24-kleuren-FISH opgespoord worden, omdat deze herschikkingen geen verandering in het chromosomale kleurenpatroon teweegbrengen. Ook de interpretatie ter hoogte van translocatiebreukpunten kan problemen opleveren ten gevolge van doorstraling van de fluorochromen van beide chromosomen die betrokken zijn in de herschikking. Daarom is het vaak aangewezen om de verkegen resultaten te verifiëren met chromosoomspecifieke banken of regiospecifieke probes. M-FISH vergt daarnaast een specifieke expertise en is relatief arbeidsintensief. M-FISH is bovendien relatief duur: de kostprijs van 1 enkel M-FISH-experiment wordt geschat op 250. Voor de technologische implementatie (aanpassingen aan epifluorescentiemicroscoop, aankoop van aangepaste filtersets en software) moet al gauw worden gerekend op Toekomst van M-FISH Verschillende studies hebben aangetoond dat M- FISH sterk complementair is aan andere moleculair cytogenetische onderzoekstechnieken, zoals vergelijkende chromosoomhybridisatie ( comparative genomic hybridisation ; CGH). 13,14 Waar CGH zeer geschikt is om chromosomale winst of verlies aan te tonen, kan M-FISH een structurele verklaring bieden voor het ontstaan van deze chromosomale afwijkingen. M-FISH heeft daarboven het voordeel niet afhankelijk te zijn van tumorheterogeniteit of bijmenging van normale cellen. Momenteel worden nieuwere technieken (zoals array-cgh, single nucleotide polymorphism (SNP)- arrays en multiplex ligation-dependent probe amplification ; MLPA) in het laboratorium geïntroduceerd die het aantal kopieën sneller en gevoeliger kunnen evalueren. Het blijft de vraag hoe M-FISH zich zal positioneren tegenover deze technieken en welke van deze analyses geïmplementeerd zullen worden in de routinediagnostiek. 15 Conclusie M-FISH is op dit moment één van de krachtigste onderzoeksmiddelen om complexe chromosomale afwijkingen te beschrijven. De bijdrage van M- FISH is vooral belangrijk in het wetenschappelijk onderzoek: de detectie en de karakterisering van complexe en cryptische chromosomale herschikkingen. In de routine moleculair cytogenetische diagnostiek is de waarde van M-FISH beperkt: de huidige diagnostische en prognostische stratificatie is gebaseerd op genspecifieke afwijkingen en daarvoor is gerichte FISH veel geschikter. De vraag is n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e v o l. 4 n r

5 in hoeverre M-FISH in de toekomst een relevante onderzoekstechniek zal blijven. Deze tekst presenteert onderzoeksresultaten van het Federale Programma van Interuniversitaire Attractiepolen van de Belgische Federale Overheid. Dit artikel vormt een gedeeltelijke samenvatting van de doctoraatsthesis van dr. B. Poppe. Een elektronische versie hiervan is beschikbaar op de website Referenties 1. Schrock E, du Manoir S, Veldman T, Schoell B, Wienberg J, Ferguson-Smith MA, et al. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 1996;273: Speicher MR, Gwyn Ballard S, Ward DC. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nat Genet 1996;12: Szuhai K, Bezrookove V, Wiegant J, Vrolijk J, Dirks RW, Rosenberg C, et al. Simultaneous molecular karyotyping and mapping of viral DNA integration sites by 25-color COBRA- FISH. Genes Chromosomes Cancer 2000;28: Brown J, Saracoglu K, Uhrig S, Speicher MR, Eils R, Kearney L. Subtelomeric chromosome rearrangements are detected using an innovative 12-color FISH assay (M-TEL). Nat Med 2001;7: Chudoba I, Hickmann G, Friedrich T, Jauch A, Kozlowski P, Senger G. mband: a high resolution multicolor banding technique for the detection of complex intrachromosomal aberrations. Cytogenet Genome Res 2004;104: Van Limbergen H, Poppe B, Michaux L, Herens C, Brown J, Noens L, et al. Identification of cytogenetic subclasses and recurring chromosomal aberrations in AML and MDS with complex karyotypes using M-FISH. Genes Chromosomes Cancer 2002;33: Poppe B, Cauwelier B, Van Limbergen H, Yigit N, Philippe J, Verhasselt B, et al. Novel cryptic chromosomal rearrangements in childhood acute lymphoblastic leukemia detected by multiple color fluorescent in situ hybridization. Haematologica 2005;90: Speleman F, Cauwelier B, Dastugue N, Cools J, Verhasselt B, Poppe B, et al. A new recurrent inversion, inv(7)(p15q34), leads to transcriptional activation of HOXA10 and HOXA11 in a subset of T-cell acute lymphoblastic leukemias. Leukemia 2005;19: Brown J, Jawad M, Twigg SR, Saracoglu K, Sauerbrey A, Thomas AE, et al. A cryptic t(5;11)(q35;p15.5) in 2 children with acute myeloid leukemia with apparently normal karyotypes, identified by a multiplex fluorescence in situ hybridization telomere assay. Blood 2002;99: Helias C, Leymarie V, Entz-Werle N, Falkenrodt A, Eyer D, Costa JA, et al. Translocation t(5;14)(q35;q32) in three cases of childhood T cell acute lymphoblastic leukemia: a new recurring and cryptic abnormality. Leukemia 2002;16: Cave H, Suciu S, Preudhomme C, Poppe B, Robert A, Uyttebroeck A, et al. Clinical significance of HOX11L2 expression linked to t(5;14)(q35;q32), of HOX11 expression, and of SIL-TAL fusion in childhood T-cell malignancies: results of EORTC studies and Blood 2004;103: Berger R, Dastugue N, Busson M, Van Den Akker J, Perot C, Ballerini P, et al. t(5;14)/hox11l2-positive T-cell acute lymphoblastic leukemia. A collaborative study of the Groupe Francais de Cytogenetique Hematologique (GFCH). Leukemia 2003;17: Van Gele M, Leonard JH, Van Roy N, Van Limbergen H, Van Belle S, Cocquyt V, et al. Combined karyotyping, CGH and M-FISH analysis allows detailed characterization of unidentified chromosomal rearrangements in Merkel cell carcinoma. Int J Cancer 2002;101: Van Roy N, Van Limbergen H, Vandesompele J, Van Gele M, Poppe B, Salwen H, et al. Combined M-FISH and CGH analysis allows comprehensive description of genetic alterations in neuroblastoma cell lines. Genes Chromosomes Cancer 2001;32: Speicher MR, Carter NP. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat Rev Genet 2005;6: Ontvangen 12 december 2006, geaccepteerd 20 maart C o r r e s p o n d e n t i e a d r e s Dr. B. Poppe, fundamenteel klinisch onderzoeker Mw. dr. N. Van Roy, postdoctoraal onderzoeker Mw. N. Yigit, laborante Mw. prof. dr. A. De Paepe, diensthoofd Prof. dr. F. Speleman, onderzoeksprofessor Universitair Ziekenhuis Gent Centrum Medische Genetica De Pintelaan 185 B-9000 Gent België adres: bruce.poppe@ugent.be Correspondentie graag richten aan de eerste auteur. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: dr. B. Poppe wordt gesteund door een fundamenteel klinisch mandaat en mw. dr. N. Van Roy is postdoctoraal onderzoeker bij het FWO - Vlaanderen. Het onderzoek werd ondersteund door het FWO - Vlaanderen (G en G ) v o l. 4 n r n e d e r l a n d s t i j d s c h r i f t v o o r H E M a t o l o g i e