UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar ANTIMICROBIELE RESISTENTIE BIJ ZEUGEN EN BIGGEN TIJDENS DE KRAAMSTALPERIODE door Delphine Françoys Promotoren: Prof. D. Maes, Dierenarts B. Callens, Dierenarts E. de Jong Studieproject in het kader van de Masterproef

2 De auteur en de promotoren geven de toelating deze studie als geheel voor consultatie beschikbaar te stellen voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van gegevens uit deze studie. Het auteursrecht betreffende de gegevens vermeld in deze studie berust bij de promotoren. Het auteursrecht beperkt zich tot de wijze waarop de auteur de problematiek van het onderwerp heeft benaderd en neergeschreven. De auteur respecteert daarbij het oorspronkelijke auteursrecht van de individueel geciteerde studies en eventueel bijhorende documentatie, zoals tabellen en figuren. De auteur en de promotoren zijn niet verantwoordelijk voor de behandelingen en eventuele doseringen die in deze studie geciteerd en beschreven zijn.

3 VOORWOORD Eerst en vooral wil ik mijn promotor, Prof. D. Maes, hartelijk bedanken voor de tijd en de inspanningen die hij in mijn studieproject gestoken heeft. Verder wil ik ook speciale aandacht schenken aan mijn promotoren: dierenarts B. Callens en dierenarts E. de Jong. Ook zij hebben echt hun uiterste best gedaan om mij te helpen. Zowel bij het verbeteren van de tekst als bij de statistische verwerking waren zij voor mij steeds onmisbaar. Graag wil ik ook de veehouders van de drie bedrijven hartelijk bedanken voor de fijne samenwerking en de terbeschikkingstelling van hun dieren. Ook aan de mensen van het laboratorium voor bacteriologie en mycologie van de huisdieren wil ik zeker mijn dank betuigen. Zij waren steeds paraat om mij bij te staan met raad en daad. Tenslotte wil ik mijn verloofde Michael Borms bedanken voor het nalezen van de tekst, de hulp bij het computerwerk en de liefdevolle steun.

4 INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING INLEIDING LITERATUURSTUDIE Definitie van antimicrobiële resistentie De genetische basis van verworven antimicrobiële resistentie Mutatie Overdraagbare resistentie De mechanismen van verworven antimicrobiële resistentie Het bepalen van antimicrobiële resistentie Het gebruik van antimicrobiële middelen in de diergeneeskunde Antimicrobiële resistentie in diergeassocieerde bacteriën in relatie tot de volksgezondheid Antimicrobiële resistentie bij varkens ONDERZOEK Materiaal en methoden Materiaal Karakteristieken van de bedrijven opgenomen in de studie Staalname Verzamelen van gegevens over het gebruik van antimicrobiële middelen Methoden Resistentie onderzoek De antimicrobial resistance index (ARI) De behandelingsincidentie (BI) Statistische analyse Resultaten Discussie Globale conclusie LITERATUURLIJST... 42

5 SAMENVATTING Dit werk beschrijft een studie die opgezet werd om te onderzoeken in welke mate antimicrobiële resistentie voorkomt bij zeugen en biggen in de kraamstal. Tevens werd nagegaan in welke mate er bij jonge zeugen meer of minder resistente Escherichia coli bacteriën in de feces aanwezig zijn in vergelijking met oudere zeugen. Tenslotte werd de rol van de zeug en de omgeving op het voorkomen van resistentie bij zuigende biggen onderzocht. Op 3 bedrijven (>200 zeugen) werden telkens 20 zeugen van verschillende pariteit ad random geselecteerd en bemonsterd. Hiertoe werd een fecesstaal genomen 3 tot 5 dagen voor het werpen, net na werpen en op de dag van spenen. Van 3 biggen per zeug werd eveneens rectaal mest genomen kort na de geboorte, op een leeftijd van 14 dagen en bij spenen. Tevens werden omgevingsstalen genomen van de kraamstallen voor het werpen en 14 dagen na het werpen. Op elk bedrijf werd van alle bemonsterde dieren nagegaan welke antimicrobiële middelen zij individueel of in groep toegediend kregen. Het voorkomen van antimicrobiële resistentie werd onderzocht voor Escherichia coli, die internationaal aanvaard wordt als indicator bacterie, d.m.v. de kwalitatieve agar diffusietest of Kirby-Bauer methode. De resistentiepercentages voor de zeugen en de biggen waren zeer laag voor amoxicillineclavulaanzuur (4,9% van de isolaten van de zeugen, 0,4% van de isolaten van de biggen), cefquinome (2,3% en 1,5%) en enrofloxacine (6,6% en 8,5%). Voor ampicilline (50,9% en 50,8%), streptomycine (63,5% en 53,5%), trimethoprim-sulfadiazine (19,4% en 22,7%) en tetracycline (40,0% en 36,5%) waren er matige tot hoge resistentiepercentages voor de zeugen en de biggen. De meeste antibiotic resistance indexes (ARI s) bedroegen ongeveer 20,0%. Bij de zeugen was er bij bedrijf 1 en 2 een daling van de ARI s tussen voor werpen, bij werpen en bij spenen, terwijl er bij bedrijf 3 een stijging was tussen deze tijdstippen. Bij de biggen was er voor de drie bedrijven een stijging van de ARI s tussen bij werpen en 14 dagen leeftijd en een daling van de ARI s tussen 14 dagen leeftijd en spenen. Het tijdstip, het soort staal en de behandelingsincidentie (BI) hadden een invloed op het verloop van de ARI s van de zeugen en de biggen. Er kon niet éénduidig besloten worden of er meer resistentie voorkomt bij oudere zeugen dan bij jongere zeugen of vice-versa. Er werden slechts lage correlaties gevonden (gemiddelde 0,11; standaard deviatie 0,37) tussen de ARI s van de zeugen, de biggen en de omgeving op de verschillende tijdstippen. Dit betekent dat er wellicht nog andere factoren, die voorwerp kunnen uitmaken van verder onderzoek, de antimicrobiële resistentie bij zeugen en biggen in de kraamstal kunnen beïnvloeden.

6 1. INLEIDING 1.1. PROBLEEMSTELLING Zeugen krijgen vaak antimicrobiële middelen toegediend rond de periode van het werpen. Enerzijds om mogelijke ziekten bij de zeug te voorkomen en anderzijds om overdracht van infecties naar de biggen te verlagen. Men kan zich de vraag stellen wat de invloed hiervan is op het voorkomen van antimicrobiële resistentie bij de zeug alsook bij de biggen tijdens hun eerste levensdagen. De invloed van antimicrobiële behandelingen op de gastro-intestinale flora van de zeug is nog niet in detail beschreven. Tevens is het niet duidelijk of er meer resistentie voorkomt bij oudere zeugen dan bij jongere zeugen of vice-versa. Men zou ervan kunnen uitgaan dat er meer resistente bacteriën voorkomen bij oudere zeugen, omdat aan deze dieren tijdens hun langere levensduur reeds meer antimicrobiële middelen werden toegediend, dan aan jongere zeugen. Anderzijds worden jonge zeugen meestal frequenter behandeld, of werden ze recenter behandeld met antimicrobiële middelen. Oudere zeugen hebben immers doorgaans een betere immuniteit tegen de meeste infectieziekten waardoor ze minder ziek zijn. Tevens is, zowel voor de mens als verschillende diersoorten, in de literatuur beschreven dat het resistentie niveau gemiddeld afneemt met stijgende leeftijd. Voor varkens werd dit aangetoond bij vleesvarkens (Langlois et al., 1988; Dewulf et al., 2007; Stannarius et al., 2009). Het effect van het toedienen van antimicrobiële middelen bij de zeug op het voorkomen van resistentie bij de biggen is niet duidelijk. Reeds van bij de geboorte worden biggen in de kraamstal blootgesteld aan een rijke flora. Zowel de flora van de zeug, als de flora, die zich gehandhaafd heeft in de omgeving, zullen een rol spelen bij de ontwikkeling van de lichaamseigen commensale flora van de big. Volgens Mathew et al. (2005) blijkt het toedienen van antimicrobiële middelen bij de zeug -voor werpen- een invloed te hebben op het voorkomen van antimicrobiële resistentie bij de biggen. Voornamelijk bij Escherichia Coli, die geïsoleerd wordt gedurende de kraamstalperiode, alsook na het spenen. Het opvolgen van het gebruik van antimicrobiële middelen bij zeugen is daarom interessant om te koppelen aan verschillen in antimicrobiële resistentie bij de biggen DOEL VAN HET ONDERZOEK In deze studie wordt onderzocht in welke mate antimicrobiële resistentie voorkomt bij zeugen en biggen in de kraamstal. Tevens wordt onderzocht in welke mate jonge zeugen meer of minder resistente Escherichia coli hebben dan oudere zeugen, en in welke mate de zeug en de omgeving een rol spelen in het voorkomen van resistentie bij zuigende biggen. Delphine Françoys 2

7 2. LITERATUURSTUDIE 2.1. DEFINITIE VAN ANTIMICROBIËLE RESISTENTIE De begrippen antimicrobiële gevoeligheid en antimicrobiële resistentie van bacteriën zijn niet eenvoudig te definiëren. Er dient een onderscheid gemaakt te worden tussen natuurlijke ongevoeligheid en verworven antimicrobiële resistentie (Guardabassi en Courvalin, 2006; Haesebrouck, 2006). Natuurlijke resistentie is een kenmerk van een bacteriesoort of -groep. Het betekent dat de kiem of de groep kiemen van nature uit niet gevoelig zijn aan een bepaalde klasse van antimicrobiële middelen of zelfs aan meerdere klassen, indien deze laatste eenzelfde werkingsmechanisme hebben. Zo zijn Mycoplasmen bijvoorbeeld ongevoelig voor beta-lactam antimicrobiële middelen omdat ze geen celwand hebben en deze antimicrobiële middelen daarop inwerken (Haesebrouck, 2006). Verworven resistentie houdt in dat binnen een bacteriële species, die normaal gevoelig is aan een antimicrobieel middel, een ongevoelige bacteriepopulatie ontstaat. Verworven antimicrobiële resistentie kan tot stand komen door een wijziging van het genetisch materiaal van de kiem. Door deze wijziging in het bacteriële genoom, kunnen er verschillende mechanismen ontstaan waardoor een antimicrobieel middel haar werking vermindert of verliest tegen de oorspronkelijk gevoelige kiem (Haesebrouck, 2006). In de volgende hoofdstukken zullen de verschillende manieren waarop het genoom van een bacterie resistentiegenen kan verwerven en de verschillende mechanismen waardoor een antimicrobieel middel geen werking meer heeft tegen kiemen, besproken worden. Verworven resistentie kan beschouwd worden als een middel om te overleven in gastheer gebonden omstandigheden en zich aan te passen aan veranderingen in het milieu (Clarke, 2006). Door intensief gebruik van antimicrobiële middelen kan er selectie plaatsvinden, waardoor een enorme toename van de resistente populatie kan ontstaan (Guardabassi en Courvalin, 2006). Soms wordt er bij verworven resistentie gesproken over kruisresistentie en multipele resistentie (Guardabassi en Courvalin, 2006; Haesebrouck, 2006). Kruisresistentie is het fenomeen waarbij een bacterie verworven resistentie vertoont tegen alle antimicrobiële middelen die behoren tot dezelfde scheikundige familie of die op eenzelfde doelwit binden. Bij de interpretatie van de resultaten van een antibiogram dient er rekening gehouden te worden met het bestaan van kruisresistentie. Wanneer een kiem bijvoorbeeld verworven resistentie vertoont tegen ampicilline, dan weet men dat er automatisch kruisresistentie is met amoxicilline (Haesebrouck, 2006). Multipele resistentie is het verschijnsel waarbij een bacterie resistent wordt tegen verschillende antimicrobiële middelen waartussen géén kruisresistentie is. Dit is mogelijk door co-resistentie : genen die coderen voor resistentie tegen verschillende klassen van antimicrobiële middelen kunnen gelinkt voorkomen op het genoom van een bacterie en daardoor samen doorgegeven worden aan de volgende generaties (Guardabassi en Courvalin, 2006). Delphine Françoys 3

8 Volgens Haesebrouck (2006) en Guardabassi en Courvalin (2006) zijn er vier criteria om aan te duiden of een bacterie resistent of gevoelig is: een (micro)biologisch, een genetisch, een farmacologisch en een klinisch criterium. Bij het microbiologisch criterium gaat men er van uit dat elke soort bacterie (species) een eigen intrinsieke resistentie heeft. Een bacteriestam met dezelfde gevoeligheid aan een antimicrobieel middel als de normale populatie van dit species wordt hierbij aangeduid als gevoelig. Een bacteriestam die minder gevoelig is dan de normale populatie van dit species is resistent. Bacteriën die resistentie vertonen volgens het microbiologisch criterium, zijn daarom in de praktijk (in vivo) nog niet resistent. Het is afhankelijk van de graad van de in vitro resistentie. Dit criterium is goed bruikbaar om verworven resistentie op te sporen. Bij het genetisch criterium wordt de gevoeligheid van de bacterie voor een antimicrobieel middel gedefinieerd door de aan- of afwezigheid van resistentiegenen of mutaties. Bacteriën die zulke genen of mutaties bevatten, worden als resistent aangeduid. Hiervoor dienen wel de resistentiegenen en de soorten mutaties gekend te zijn. Wanneer er resistentie is volgens dit criterium, zijn de antimicrobiële middelen meestal in de praktijk (in vivo) ook al niet meer werkzaam, tenzij de resistentiegenen niet tot expressie worden gebracht. In het farmacologisch criterium worden de bloedspiegels van een antimicrobieel middel vergeleken met het gevoeligheidsniveau van de bacteriestam. Een bacteriestam die gevoelig is aan een concentratie van antimicrobiële middelen die lager is dan de bloedspiegel is gevoelig. Een stam die slechts gevoelig is aan een hogere concentratie, is resistent. Tenslotte is er ook nog het klinisch criterium. Hierbij wordt de bacterie als gevoelig beschouwd als een bacteriële infectie goed reageert op een antimicrobiële behandeling en wordt de bacterie als resistent aanzien als de behandeling niet aanslaat. Dit criterium is zeer belangrijk in de praktijk DE GENETISCHE BASIS VAN VERWORVEN ANTIMICROBIËLE RESISTENTIE De verwerving van antimicrobiële resistentie van een kiem kan gebeuren door mutatie of door overdracht van resistentiegenen (Catry et al., 2003; Guardabassi en Courvalin, 2006; Haesebrouck, 2006) Mutatie Het genetisch materiaal van een bacterie bestaat uit een chromosoom, een autonoom extrachromosomaal desoxyribonucleïnezuur (plasmide) en genetische elementen met een zekere autonomie die zich bevinden op het chromosoom of op een plasmide (zoals transposons). Mutatie kan optreden in de chromosomale genen, maar ook in genen gelokaliseerd op plasmiden of transposons. In de meeste gevallen gebeurt mutatie in het chromosoom. Het is belangrijk om te weten dat de toediening van antimicrobiële middelen zelf geen mutaties induceert. Mutaties ontstaan spontaan bij de replicatie van het bacteriële chromosoom (Catry et al., 2003; Haesebrouck, 2006). Antimicrobiële middelen hebben wel een selectieve rol. In aanwezigheid van een antimicrobieel middel zullen enkel Delphine Françoys 4

9 of vooral de vooraf bestaande of toevallig ontstane dragers van genetische informatie, die onder meer antimicrobiële resistentie omvatten, kunnen vermenigvuldigen. Hierdoor kan een nieuwe populatie van kiemen ontstaan die minder gevoelig is dan de oorspronkelijke populatie (Guardabassi en Courvalin, 2006; Haesebrouck, 2006). Soms is er maar één mutatie nodig in één gen om tot een sterk toegenomen resistentie te leiden ( single step resistance ). Er kunnen echter ook meerdere mutaties in hetzelfde gen nodig zijn om tot een sterk resistente kiem te komen ( multiple step resistance ) (Haesebrouck, 2006). Voor sommige antimicrobiële middelen werd aangetoond dat resistentie door mutatie niet zeer stabiel is en de tendens heeft om te verdwijnen wanneer het antimicrobieel middel niet meer gebruikt wordt en de selectiedruk verdwijnt (Haesebrouck, 2006). Chromosomale mutaties worden meestal enkel verticaal doorgegeven tijdens de replicatie van de kiem. Niet-chromosomale mutaties kunnen, zoals hieronder beschreven wordt, zowel verticaal als horizontaal worden doorgegeven (Haesebrouck, 2006) Overdraagbare resistentie Overdracht van resistentiegenen betekent dat er genen, die ondermeer de informatie van antimicrobiële resistentie bevatten, van een resistente donorbacterie geïncorporeerd worden in het genoom van een acceptorbacterie, die oorspronkelijk nog niet resistent was. Deze overdracht van resistentiegenen kan gebeuren via conjugatie, transformatie of transductie (Catry et al., 2003; Haesebrouck, 2006). Fig. 1: De drie transfermechanismen: conjugatie, transformatie en transductie (Haesebrouck, 2006) Delphine Françoys 5

10 1. Conjugatie Bij conjugatie wordt een stukje donor desoxyribonucleïnezuur (DNA), bijvoorbeeld een mobiel DNA element zoals een plasmide of een transposon, via een proteïne tunnel naar een acceptorbacterie gebracht. Dit kan zowel bij gram-positieve als bij gram-negatieve bacteriën gebeuren. Bij gramnegatieve bacteriën beschikt de donorbacterie over genen die coderen voor conjugatie, namelijk tra(nsfer)-genen. Deze genen coderen voor sekspili. Deze sekspili kunnen zich vasthechten aan andere bacteriën die geschikte receptoren bevatten. Wanneer beide bacteriën contact hebben met elkaar, trekken de pili zich samen en komen de bacteriën dichter bij elkaar. Dan wordt er een proteïne tunnel gevormd die een verbinding vormt tussen de twee bacteriën. Door deze tunnel migreert één streng van een stukje donor DNA van de donorbacterie naar de acceptorbacterie. Tenslotte worden er complementaire strengen gesynthetiseerd in de twee bacteriën, zodat ze beide over hetzelfde dubbelstrengig stuk DNA beschikken. Bij de gram-positieve bacteriën kan er ook conjugatie plaatsvinden, maar hierbij worden er meestal geen sekspili gevormd. De verbinding tussen de bacteriën kan hier gebeuren door middel van een kleefstof (Haesebrouck, 2006). Conjugatie is het belangrijkste transfermechanisme (Catry et al., 2003). Naar schatting zijn er 85% van de gevallen van therapiefalen van Staphylokokken (beta-lactam antimicrobiële middelen), Enterobacteriaceae (ampicilline, sulfa/trimethoprim, gentamicine, chlooramfenicol) en enterokokken (vancomycine) te wijten aan conjugatie geïnduceerde antimicrobiële resistentie (Berends et al., 2001). Fig. 2: Schematische voorstelling van conjugatie bij gram-negatieve bacteriën (Haesebrouck, 2006) 2. Transformatie Bij transformatie wordt een naakt liggend stukje DNA van een donorbacterie opgenomen door een acceptorbacterie en in het DNA gerecombineerd. Dit kan gebeuren als volgt: wanneer een bacteriecel lyseert, kan het bacterieel DNA uit elkaar vallen in kleine stukken. Sommige competente bacteriën zijn in staat om zulke stukjes DNA op te nemen in hun protoplasma. Als er voldoende verwantschap bestaat tussen de donor- en de acceptorbacterie, is het mogelijk dat een stuk DNA van de acceptorbacterie vervangen wordt door deze nieuwe stukjes DNA (Haesebrouck, 2006). Delphine Françoys 6

11 Fig. 3: Schematische voorstelling van transformatie (Haesebrouck, 2006) 3. Transductie Bij transductie wordt er bacterieel DNA uitgewisseld tussen twee bacteriën via bacteriofagen. Bacteriofagen zijn virussen die bacteriën parasiteren. Ze binden aan het oppervlak van de bacterie en doorboren de celwand om het faag-dna in te spuiten en te laten repliceren in die bacterie. Door dit proces kan de bacterie lyseren, waardoor het bacterieel DNA uit elkaar valt in kleine stukjes in het protoplasma. Hierbij kunnen enkele fagen toevallig bacterieel DNA in plaats van faag-dna omkapselen met faag proteïnen. Fig. 4: Twee bacteriofagen op het Transductie treedt dus alleen maar op als er een fout gebeurt bij de oppervlak van een bacterie replicatie van de bacteriofagen. Na lyse van de geïnfecteerde (Haesebrouck, 2006) bacterie komen er dan naast vele normale fagen ook enkele transducerende vrij. Deze kunnen dan het bacterieel DNA van de donorbacterie overbrengen naar een acceptorbacterie (Haesebrouck, 2006). De processen conjugatie, transformatie en transductie zijn drie vormen van horizontale genen transfer (Catry et al. 2003). Maar de genetische informatie kan verder ook verticaal worden doorgegeven. Bovendien gebeurt de overdracht van deze resistentiegenen niet alleen tussen verschillende kiemen onderling, maar kan er bijvoorbeeld ook een uitwisseling zijn van bacteriële flora van dier naar mens (van den Bogaard en Stobberingh, 2000). De grote spreiding van de resistentie is te wijten aan het bestaan van deze transfermechanismen en aan de selectie door het intensieve gebruik van antimicrobiële middelen in de praktijk (Catry et al., 2003) DE MECHANISMEN VAN VERWORVEN ANTIMICROBIËLE RESISTENTIE In de vorige paragraaf werd beschreven op welke manier een kiem resistentiegenen zou kunnen verwerven. Wanneer zulke genen tot expressie komen, kunnen er verschillende mechanismen ontstaan waardoor een antimicrobieel middel niet meer werkt tegen bepaalde kiemen (Hawkey, 1998; Clarke, 2006; Guardabassi en Courvalin, 2006; Haesebrouck, 2006). Delphine Françoys 7

12 1. Structurele verandering van het doelwit Wanneer het bacterieel doelwit van een antimicrobieel middel gewijzigd wordt, kan het zijn dat de kiem niet meer gevoelig is aan dat antimicrobieel middel (Fig. 5 links bovenaan). Aminoglycosiden hebben bijvoorbeeld het bacterieel ribosoom als doelwit. Door methylatie van de bindingsplaats verandert deze van structuur, waardoor de aminoglycosiden niet meer kunnen binden en hun werking verliezen (Guardabassi en Courvalin, 2006). 2. Reductie van accumulatie van het antimicrobieel middel in de bacterie: selectieve belemmering van de opname Bij gram-negatieve bacteriën komen de hydrofiele geneesmiddelen binnen doorheen poriën terwijl hydrofobe geneesmiddelen doorheen de fosfolipidemembraan diffunderen. Mutaties die leiden tot verlies of verminderde expressie van poriën, veroorzaken een verminderde opname van antimicrobiële middelen in de bacterie en daardoor een verminderde gevoeligheid van de bacterie aan het antimicrobieel middel (Fig. 5 rechts bovenaan). Reductie van de expressie van het OmpF porine kan bijvoorbeeld zorgen voor een verminderde gevoeligheid van E. coli tegen quinolones, beta-lactam antimicrobiële middelen, tetracyclines en chlooramfenicol (Guardabassi en Courvalin, 2006). 3. Reductie van accumulatie van het antimicrobieel middel in de bacterie: verhoogde excretie Er bestaan efflux-systemen die antimicrobiële middelen uit de bacterie pompen, zodat er geen hoge concentraties van antimicrobiële middelen in de cel bereikt worden (Fig. 5 rechts bovenaan). Er bestaan bijvoorbeeld specifieke efflux-pompen die tetracyclines uit de bacterie pompen, waardoor er een verminderde gevoeligheid tegen tetracyclines ontstaat (Guardabassi en Courvalin, 2006). 4. Adaptatie van de bacterie door ontwikkeling van een alternatief doelwit of een alternatieve metabole stap Hierbij wordt er een alternatief doelwit geproduceerd, meestal een enzyme, dat resistent is aan de inhibitie door het antimicrobieel middel, terwijl de productie van het oorspronkelijke gevoelige doelwit gewoon blijft doorgaan (Fig. 5 links onderaan). Een voorbeeld hiervan is het alternatieve penicilline bindend proteïne dat geproduceerd wordt naast het gewone penicilline bindende proteïne door MRSA (Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus) (Hawkey, 1998). De bacterie kan ook een alternatieve metabole stap ontwikkelen, waardoor de inhibitie van de oorspronkelijke metabole stap door het antimicrobieel middel geen effect meer heeft. Resistentie tegen sulfonamiden kan bijvoorbeeld ondermeer ontstaan doordat de bacteriën een manier ontwikkelen om gepreformeerd foliumzuur te gebruiken uit het milieu, zodat de interferentie van de sulfonamiden met de synthese van het bacteriële foliumzuur geen effect meer heeft (Haesebrouck, 2006). Delphine Françoys 8

13 5. Productie van enzymes die het antimicrobieel middel of chemotherapeuticum inactiveren Hierbij worden de antimicrobiële middelen of chemotherapeutica afgebroken of geïnactiveerd (Fig. 5 rechts onderaan). Dit mechanisme veroorzaakt onder andere resistentie tegen de beta-lactam antimicrobiële middelen en de aminoglycosiden (Guardabassi en Courvalin, 2006). De betalactamasen, die ondermeer geproduceerd worden door resistente stafylokokken en Enterobacteriaceae, inactiveren bijvoorbeeld de beta-lactamase gevoelige beta-lactam antimicrobiële middelen (ondermeer penicilline, ampicilline en amoxycilline). 6. Verhoogde synthese van het doelwit Wanneer er een verhoogde synthese is van het doelwit van het antimicrobieel middel, volstaat de opgenomen hoeveelheid antimicrobieel middel niet meer om de bacteriële groei te inhiberen. Chromosomale mutaties die bijvoorbeeld een overproductie van het doelwit, dihydropteroïnezuursynthetase, van sulfonamiden teweegbrengen, zorgen ervoor dat het aantal opgenomen sulfonamide molecules te gering is om alle dihydropteroïnezuursynthetases te bezetten. Zo zijn er nog een aantal enzymes vrij waarop het para-aminobenzoëzuur, waarmee de sulfonamiden normaal in competitie gaan, kunnen binden (Guardabassi en Courvalin, 2006). 7. Inhibitie van de activatie van antimicrobiële middelen of chemotherapeutica Dit kan ontstaan wanneer chemotherapeutica eerst enzymatisch gereduceerd moeten worden door de bacterie vooraleer ze actief zijn. Dit is bijvoorbeeld voor de nitrofuranen het geval (Haesebrouck, 2006). Fig. 5: De 4 belangrijkste resistentie mechanismen (Hawkey, 1998) Delphine Françoys 9

14 2.4. HET BEPALEN VAN ANTIMICROBIËLE RESISTENTIE Alvorens de methoden voor de bepaling van antimicrobiële resistentie te bespreken, worden er enkele begrippen aangehaald. De MIC waarde is de minimale inhibitorische concentratie, uitgedrukt in µg/ml. Het is de laagste concentratie van een antimicrobieel middel waarbij de kiemgroei totaal of vrijwel totaal onderdrukt wordt in vitro. In dit geval heeft het antimicrobieel middel een bacteriostatisch effect. Wanneer een antimicrobieel middel bacteriostatisch werkt, wordt de kiemgroei geremd en is er dus selectiedruk mogelijk. Indien het antimicrobieel middel een bacteriociede werking heeft, worden alle kiemen afgedood (Haesebrouck, 2006). Er bestaan verschillende soorten testen om antimicrobiële resistentie te bepalen. Men kan zowel fenotypische als genotypische testen uitvoeren. Bij de fenotypische testen bestaan er twee methodes: de dilutiemethode en de diffusiemethode. Bij de kwantitatieve dilutiemethode wordt er met vloeibare voedingsbodems of agars gewerkt. Er worden verschillende 2-voudige verdunningen van een antimicrobieel middel gemaakt. Aan elk van deze verdunningen wordt er een standaard aantal levende kiemen toegevoegd. Aan de hand hiervan kan men de MIC waarde van een bacteriestam bepalen. De MIC waarden voor elke bacteriestam dienen apart bepaald te worden (Haesebrouck, 2006). Bij de diffusiemethode kan men ofwel een kwalitatieve test doen met behulp van een antibiogram ofwel een kwantitatieve test (E-test). De kwalitatieve agar diffusie test of Kirby-Bauer methode is één van de eenvoudigste en meest gebruikte gevoeligheidstesten in bacteriologische laboratoria. Hierbij wordt een agarmedium geïnoculeerd met een gestandaardiseerde hoeveelheid micro-organismen (een reincultuur). Op het medium worden verschillende antimicrobiële middelen, onder de vorm van tabletten, aangebracht. Het antimicrobieel middel kan diffunderen in de agar. Het micro-organisme wordt dan blootgesteld aan een continue gradiënt van antimicrobiële concentraties, waarbij de concentratie vermindert naarmate de afstand tot het reservoir van het antimicrobieel middel toeneemt. Zo kan er een groei-inhibitiezone ontstaan rond dit reservoir. Na incubatie kan men de inhibitiezones aflezen. De diffusiesnelheid van het antimicrobieel middel, de samenstelling en de dikte van het medium, de incubatieomstandigheden (atmosfeer en temperatuur), de groeisnelheid van de kiem en de dichtheid van het inoculum beïnvloeden allen de groei-inhibitiezone. Het is dus van belang om op een gestandaardiseerde manier te werken. Er zijn verschillende organisaties over de ganse wereld die gestandaardiseerde methodes beschrijven voor gevoeligheidstesten, onder andere EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) en CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (Watts en Lindeman, 2006). Ook bij de E-test wordt een agarmedium geïnoculeerd met een gestandaardiseerde hoeveelheid micro-organismen (een reincultuur), maar hierop wordt een concentratiegradiënt strip aangebracht. Deze strip bevat over de gehele lengte een vastgestelde continue concentratiegradiënt van een antimicrobieel middel en is voorzien van een concentratieschaal om de MIC waarde te kunnen bepalen. Een continue concentratiegradiënt van een antimicrobieel middel diffundeert dus vanuit de strip in het agarmedium. Na incubatie kan men de MIC bepalen door de concentratie af te lezen op de plaats waar de inhibitiezone de strip raakt (Foto 1) (Haesebrouck, 2006). Delphine Françoys 10

15 Foto 1: Een geënte E-test na incubatie (Haesebrouck, 2006) Er kunnen ook genotypische testen uitgevoerd worden. Hierbij gaat men na of er resistentiegenen of genetische veranderingen aanwezig zijn, die geassocieerd worden met verworven resistentie. Dit kan door middel van moleculair genetisch onderzoek, bijvoorbeeld met behulp van polymerase chain reaction (PCR) (Haesebrouck, 2006). In deze studie zal gebruik gemaakt worden van de kwalitatieve diffusietest HET GEBRUIK VAN ANTIMICROBIËLE MIDDELEN IN DE DIERGENEESKUNDE Verschillende bronnen zijn het erover eens dat het gebruik van antimicrobiële middelen bijdraagt tot de selectie en de verspreiding van antimicrobiële resistentie (Dunlop et al., 1998; Aarestrup, 1999 en Aarestrup et al., 2008). In de diergeneeskunde kunnen grote economische verliezen en problemen van dierenwelzijn ontstaan door antimicrobiële resistentie (Catry et al., 2003). Daarenboven bestaat de vrees voor de overdracht van resistente kiemen van dieren op de mens (zie verder). Door de groeiende problematiek van antimicrobiële resistentie is er kennis nodig over de prevalentie en de ontwikkeling van antimicrobiële resistentie in zowel de humane als de diergeneeskunde. Kennis van het gebruik van antimicrobiële middelen speelt hierin een centrale rol. Verschillende Europese landen beschikken over monitoringssystemen om het diergeneeskundig gebruik van antimicrobiële middelen te registreren en te controleren. Tevens worden hierbij gegevens over resistentie in nationale databanken bijgehouden. Voorbeelden zijn het MARAN rapport (Monitoring of Antimicrobial Resistance and Antibiotic Usage in Animals in The Netherlands) in Nederland en het Deense DANMAP rapport (Danish Integrated Antimicrobial resistance Monitoring and Research Programme), welke jaarlijks verschijnen. België heeft nog geen dergelijk monitoringssysteem. Recent werd wel het BelVetSac (Belgian Veterinary Surveillance of Antimicrobial Consumption) opgericht, een consortium verantwoordelijk voor de inzameling en analyse van gegevens over de verkoop van veterinaire antimicrobiële middelen. Delphine Françoys 11

16 Wereldwijd zijn talrijke studies gepubliceerd over de prevalentie van antimicrobiële resistentie en het gebruik van antimicrobiële middelen bij vleesvarkens (Hendriksen et al., 2008, Leigh et al., 2008), dit in tegenstelling tot publicaties over zeugen en biggen gedurende de kraamstalperiode. In de praktijk wordt er echter tijdens deze eerste productiefase vaak gebruik gemaakt van antimicrobiële middelen. Momenteel zijn de meest voorkomende indicaties voor antimicrobiële behandeling bij zeugen: aandoeningen aan het urogenitaalstelsel en de uier (mastitis), gevolgd door problemen met gewrichten, beenwerk, huid en ademhalingsaandoeningen (Aarestrup et al., 2008). De zeugen kunnen ook behandeld worden om de eventuele overdracht van pathogenen naar de biggen te verlagen. Bij biggen in de kraamstal zijn vooral infecties met Streptococcus suis, Clostridium perfringens en Escherichia coli de meest voorkomende redenen van antimicrobiële therapie (Aarestrup et al., 2008). Daarom is het belangrijk om het gebruik van antimicrobiële middelen en de prevalentie van antimicrobiële resistentie bij zeugen en bij zuigende biggen na te gaan. Niet alleen het gebruik zelf, ook de manier waarop men een antimicrobieel middel toedient, kan van belang zijn bij antimicrobiële resistentie. Naast het normale therapeutische gebruik worden antimicrobiële middelen in de intensieve veehouderij ook vaak profylactisch of metafylactisch gebruikt (Guardabassi en Courvalin, 2006). Metafylactisch behandelen betekent dat wanneer één of een paar dieren ziekte vertonen, het hele hok behandeld wordt. Profylactisch behandelen betekent dat er een behandeling ingesteld wordt vooraleer er ziektetekens vastgesteld worden. Bepaalde handelingen, zoals verhokken van dieren of castratie, zorgen vaak voor stress en immuniteitsdaling, waardoor profylactisch gebruik van antimicrobiële middelen economisch gezien een begrijpelijke handeling is. McEwen en Fedorka-Cray (2002) wijzen er echter op dat sommige manieren om antimicrobiële middelen toe te dienen, echter meer resistentie in de hand werken dan andere. Het toepassen van groepsmedicatie kan bijvoorbeeld leiden tot (te) lage of sterk variërende concentraties van antimicrobiële middelen in de behandelde dieren. Antimicrobiële middelen werden vroeger ook gebruikt als groeibevorderaars. Sinds eind jaren 90 werd dit geleidelijk afgebouwd en in januari 2006 is het gebruik van antimicrobiële groeipromotoren in de EU definitief verboden. Volgens Arnold et al. (2004) zorgde het verbod op de groeibevorderaars niet voor een stijging van de hoeveelheid therapeutisch gebruikte antimicrobiële middelen. Andere bronnen spreken dit tegen. Uit de jaarlijkse MARAN-rapportage in Nederland blijkt dat er een duidelijk verband te zien is tussen het gebruik van antimicrobiële middelen en prevalenties van antimicrobiële resistentie en dat deze beide jaarlijks toenemen. Behalve een jaarlijkse toename van resistentie, is er de laatste jaren ook sprake van een toename van multiresistente bacteriën. Een minimaal en verantwoord gebruik van antimicrobiële middelen moet aangemoedigd worden in de diergeneeskunde (Catry et al., 2003). Daarbij kan men in acht nemen dat het controleren van ziekte niet enkel gaat om gebruik van antimicrobiële middelen. Ook andere factoren zoals bedrijfsmanagement, huisvesting, omgeving en immuniteit spelen een belangrijke rol (Aarestrup et al., 2008). Alternatieven zoals bioveiligheid, vaccinatie, immunomodulatie en pre- en probiotica moeten Delphine Françoys 12

17 eveneens in overweging genomen worden. Het is echter onwaarschijnlijk dat deze voldoende zullen zijn om het gebruik van antimicrobiële middelen te vervangen (Schwarz et al., 2001) ANTIMICROBIËLE RESISTENTIE IN DIERGEASSOCIEERDE BACTERIËN IN RELATIE TOT DE VOLKSGEZONDHEID Door het gevaar voor overdracht van resistente kiemen van dieren op de mens heeft de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) in 2007 een lijst ontwikkeld met de belangrijkste kritieke antimicrobiële middelen voor de humane geneeskunde. Het is aanbevolen het gebruik van deze agentia voor voedselproducerende dieren zo veel mogelijk te beperken (Aarestrup et al., 2008). Het veterinair gebruik van antimicrobiële middelen heeft dier pathogenen als doelgroep. Dit gebruik oefent echter gelijktijdig een selectiedruk uit op de commensale flora van het dier, alsook op organismen die kunnen overgaan van dier op mens en daar eventueel ziekte veroorzaken, namelijk de zoönotische bacteriën. De gastro-intestinale flora bij dieren fungeert als reservoir voor resistentiegenen (van den Boogaard en Stobberingh, 1999). Dierlijke commensalen kunnen door direct contact, tussen mensen en dieren, of indirect contact, via de voedselketen, het menselijke spijsverteringsstelsel (tijdelijk) koloniseren en daar resistentiegenen doorgeven aan zowel humane commensalen als humane pathogenen. Er dient opgemerkt te worden dat ook het omgekeerde kan plaatsvinden. Intensief contact tussen mens en dier kan uitwisseling van humane en dierlijke bacteriën in beide richtingen bevorderen. Het is dus duidelijk dat bij het verwerven van antimicrobiële resistentie in één van deze pools, alle andere reservoirs ook beïnvloed kunnen worden. Bovendien kunnen de antimicrobiële middelen via residuen in het vlees bij de mens terechtkomen. Het is duidelijk dat het gebruik van antimicrobiële middelen in de humane geneeskunde eveneens van belang is bij selectie van antimicrobiële resistentie van pathogenen en commensalen van humane oorsprong. Figuur 6 is een eenvoudige weergave van enerzijds de verschillende reservoirs van bacteriën bij mens en dier en anderzijds de mogelijke wegen van transmissie van resistentiegenen tussen beiden. Delphine Françoys 13

18 Antibiotica bij dieren Dier commensalen Dier pathogenen Zoönotische organismen Residu in vlees Humane commensalen Humane pathogenen Antibiotica bij mensen Fig. 6: Schematische voorstelling van verschillende reservoirs van bacteriën en mogelijke transmissiewegen van resistentiegenen (van den Boogaard en Stobberingh, 1999) In de kraamstal is er een zeer nauw contact tussen de veehouder enerzijds en de zeugen en de biggen anderzijds. Bij een moeilijke partus wordt er dikwijls verloskundige hulp geboden waarbij er intens contact is tussen de veehouder en de zeug. De biggen in de kraamstal worden vaak gemanipuleerd voor onder andere castratie, vaccinatie, ijzertoediening en toediening van het officiële identificatie nummer. Ook hier is er intens contact tussen de veehouder en de biggen. Tijdens de kraamstalperiode is de kans op uitwisseling van bacteriën tussen humane en dierlijke reservoirs zeer groot en dit kan eventueel leiden tot een vergroot risico op resistentieoverdracht. Het is dus zeer nuttig om de antimicrobiële resistentie in de kraamstal na te gaan ANTIMICROBIËLE RESISTENTIE BIJ VARKENS Wereldwijd zijn talrijke studies gepubliceerd over antimicrobiële resistentie bij vleesvarkens (Hendriksen et al., 2008, Leigh et al., 2008). Bij zeugen en zuigende biggen is er echter zeer weinig informatie. Stannarius et al. (2009) publiceerden een studie over antimicrobiële resistentie in Escherichia coli isolaten bij gespeende biggen en zeugen. Hierin werd besloten dat 22,5% van de E. coli isolaten van de zeugen gevoelig waren aan alle geteste antimicrobiële middelen. Een lage prevalentie van antimicrobiële resistentie bij de zeugen werd gezien voor amoxicilline (7,4% van de isolaten van de zeugen), amoxicilline/clavulaanzuur (1,4%), ampicilline (5,8%), cefquinome (0,5%), ciprofloxacine Delphine Françoys 14

19 (1,4%), colistine (3,5%), florfenicol (0,5%) en gentamicine (0,7%). De meeste resistentie werd gezien bij streptomycine (64,3%), sulfonamiden (26,9%), tetracyclines (22,0%) en trimethoprim (11,1%). Met uitzondering van colistine, werd er meest resistentie vastgesteld tegen de antimicrobiële middelen die meest frequent gebruikt werden op de onderzochte bedrijven. Verder is de invloed van antimicrobiële behandelingen op de gastro-intestinale flora van de zeug nog niet in detail beschreven. In de literatuur is voor zowel de mens als verschillende diersoorten beschreven dat het resistentie niveau gemiddeld afneemt met stijgende leeftijd. Voor varkens werd dit reeds beschreven bij vleesvarkens (Langlois et al., 1988; Dewulf et al., 2007; Stannarius et al., 2009). Het is echter niet duidelijk of er meer resistentie voorkomt bij oudere zeugen dan bij jongere zeugen of vice-versa. Ook het effect van het toedienen van antimicrobiële middelen bij de zeug op het voorkomen van resistentie bij de biggen is niet duidelijk. Volgens Mathew et al. (2005) blijkt het toedienen van antimicrobiële middelen bij de zeug -voor werpen- een invloed te hebben op het voorkomen van antimicrobiële resistentie bij de biggen. Voornamelijk bij Escherichia Coli, die geïsoleerd wordt gedurende de kraamstalperiode, alsook na het spenen. Biggen kunnen op verschillende manieren blootgesteld worden aan antimicrobiële middelen, toegediend aan de zeugen. Volgens Mathew et al. (2005) zouden tetracyclines die toegediend worden aan de zeug (voor werpen) doorheen de placenta in de foetale circulatie terecht kunnen komen. Zuigende biggen kunnen residuen van antimicrobiële middelen via de melk opnemen. Biggen kunnen eveneens blootgesteld worden aan antimicrobiële middelen door contact met de feces van de zeug in het kraamhok. Verder onderzoek naar antimicrobiële resistentie bij zeugen en biggen in de kraamstal is dus nodig. Delphine Françoys 15

20 3. ONDERZOEK 3.1. MATERIAAL EN METHODEN Materiaal Karakteristieken van de bedrijven opgenomen in de studie Er werden 3 bedrijven met meer dan 200 zeugen geselecteerd voor het onderzoek. Beschrijvende gegevens van de bedrijven worden in tabel 1 weergegeven. Tabel 1: Karakteristieken van de 3 bedrijven opgenomen in de studie Parameters Bedrijf 1 Bedrijf 2 Bedrijf 3 Algemeen Type bedrijf gesloten, soms verkoop van biggen gesloten met aankoop van zeugen, alle biggen worden afgemest (multi-site) gesloten met opfok eigen zeugen, alle biggen worden afgemest (multi-site) Aantal zeugen Ras zeugen Engels x LW ook BN en BL Topigs 20 rotatiekruising minstens 4 rassen Productiesysteem voor 1 week 3 weken 5 weken zeugen Speenleeftijd (weken) Productiegetal 27,0 28,7 26,0 Worpindex 2,1 2,4 2,4 Zeugen Aantal dagen voor werpen overbrengen naar kraamstal Voederbeurten per dag 1 keer (handmatig) 3 keer (automatisch) 2 keer (handmatig) in kraamstal Drinkwater ad lib ad lib ad lib Groepsbehandelingen geen geen lincomycine/ spectinomycine (2 dagen voor werpen tot 4 dagen na werpen) Biggen Groepsbehandelingen bij geboorte geen ceftiofur geen Delphine Françoys 16

21 Groepsbehandelingen amoxicilline (voeder), amoxicilline (voeder), colistine en bij spenen promycine (voeder) promycine (drinkwater) trimethoprimsulfadiazine Omgeving Reiniging en -mest weg -mest weg -mest weg Ontsmetting -inspuiten met Biogel -nat spuiten -nat spuiten (alkalisch -inweken met -reinigen inweekmiddel) inweekmiddel -niet ontsmetten maar -10 min inweken -reinigen gebruik van enzymes -uitspuiten met hoge -ontsmetten met en probiotica druk Megades -ontsmetten met Virocid Leegstand kraamstal 24u tot 1 week 6u (1 voormiddag) 5 dagen (meestal ongeveer 2 dagen) Type vloer beton en metalen beton en kunststof beton en metalen roosters roosters Staalname Op de 3 bedrijven werden telkens 20 zeugen van verschillende pariteit (pariteit 1-8) ad random geselecteerd en bemonsterd. Hiertoe werd een fecesstaal genomen (uit het rectum) 3 tot 5 dagen voor het werpen, net na werpen en op de dag van spenen. Van 3 biggen per zeug werd eveneens rectaal mest genomen. Dit gebeurde telkens door middel van rectale swabs (Plastic Stick Swab, Meus, Piove di Sacco, Italië), kort na de geboorte (vóór de eerste toediening van antimicrobiële middelen), op een leeftijd van 14 dagen en bij het spenen van de biggen. Bij de geboorte kregen de biggen een Sanitel nummer zodat ze individueel konden opgevolgd worden tot bij het spenen. Tevens werden omgevingsstalen genomen van de kraamstallen voor het werpen en 14 dagen na het werpen. Hiervoor werden eveneens swabs (Plastic Stick Swab, Meus, Piove di Sacco, Italië) gebruikt. Er werden 3 stalen per hok per tijdstip genomen en dit op een gestandaardiseerde manier. Per staal werd er een oppervlakte van 100 cm² op een zichtbaar propere plaats geswabd. Het eerste omgevingsstaal werd telkens genomen van de muur aan de kant van de zeug, 0,5 meter boven de grond en 1 meter van de hoek met de achterste muur. Het tweede staal werd genomen van de muur ter hoogte van het biggennest, 0,5 meter boven de grond. Voor het derde staal werd de vloer thv. het biggennest geswabd. De fecesstalen per zeug werden bewaard in een afsluitbaar recipiënt, de rectale swabs van de biggen en de omgevingsswabs werden elk bewaard in een bijhorend transportmedium. De stalen werden binnen de 24u na de staalname verwerkt in het laboratorium. Delphine Françoys 17

22 Tabel 2: Schematische voorstelling van de staalname Vóór werpen Bij werpen 14 dagen na werpen Bij spenen Zeugen X X X Biggen X X X Omgeving X X Verzamelen van gegevens over het gebruik van antimicrobiële middelen Op elk bedrijf werd van alle bemonsterde dieren nagegaan welke antimicrobiële middelen zij individueel of in groep toegediend kregen. Bij de zeugen waren dit alle gestandaardiseerde groeps- en individuele behandelingen tijdens de laatste weken voorafgaand aan de partus en na de geboorte. Bij de biggen werd het gebruik prospectief bijgehouden. Hierbij werd zowel aandacht besteed aan de kwantitatieve (dosis, duur) als de kwalitatieve (productnaam, indicatie, toedieningswijze, leeftijd) aspecten van het gebruik van antimicrobiële middelen Methoden Resistentie onderzoek De verwerking van de stalen gebeurde in het laboratorium voor Bacteriologie en Mycologie van de Huisdieren aan de Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent. Dit laboratorium heeft een inperkingsniveau L2 (Foto 2). Alle vereiste procedures om in deze omgeving te werken, werden gevolgd. Alle handelingen werden uitgevoerd onder een trekkast en er werden handschoenen en een labojas gedragen. Foto 2: Het laboratorium voor bacteriologie en mycologie van de huisdieren aan de Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Gent heeft een inperkingsniveau L2 Delphine Françoys 18

23 Isolatie van Escherichia coli Voor de detectie van antimicrobiële resistentie werd gekozen voor Escherichia coli. E. coli wordt internationaal aanvaard als indicator bacterie. De fecesstalen van de zeugen werden met swabs (Cotton-tipped Applicator, Biolab Inc., Boedapest, Hongarije) uit de recipiënten gehaald. Zowel de swabs van de zeugen (Cotton-tipped Applicator, Biolab Inc., Boedapest, Hongarije) als de swabs van de biggen en de omgeving (Plastic Stick Swab, Meus, Piove di Sacco, Italië) werden geënt op McConkey agar platen (MacConkey Agar No.3, Oxoid LTD., Hampshire, Engeland) met als doel E. coli te isoleren. Hierbij werd elke swab op één plaats van een plaat uitgestreken en werd er vervolgens met een entoog van 1 µl (Microloops, Biosigma SRL., Cona, Italië) in twee andere richtingen nog eens uitgeënt. De geënte McConkey agar platen werden geïncubeerd gedurende 24u in een broedkast van 37 C onder aërobe omstandigheden. Na de incubatie werden de E. coli reinculturen geïdentificeerd als rood-roze lactose positieve kolonies. Foto 3: Meststaal van een zeug Foto 4: Meststaal van een big of van de omgeving Foto 5: Enting met swab op McConckey agar plaat Foto 6: Enting met entoog op McConckey agar plaat Delphine Françoys 19

24 Foto 7: Geënte McConckey agar plaat vóór incubatie Foto 8: Geënte McConckey agar plaat na incubatie Identificatie van Escherichia coli Bereiding van de biochemische testen Voor de identificatie van Escherichia coli werden er drie biochemische testen uitgevoerd. De media (het Kligler Iron medium, de Gal Esculine Azide agar en de Peptone oplossing) voor deze drie testen werden telkens zelf bereid. Voor de bereiding van het Kligler Iron medium werd er 55 gram van het Kligler Iron Agar poeder (Kligler Iron Agar, Oxoid LTD., Hampshire, Engeland) afgewogen met een gestandaardiseerde weegschaal en in een kolf met 1 liter gedestilleerd water gebracht. De oplossing werd zachtjes opgekookt om de vermenging te bevorderen en om stolling te verkrijgen na het afkoelen. Hierna werden er glazen proefbuizen (Test Tubes Soda Glass, VWR International GmbH, Darmstadt, Duitsland) door middel van een mechanische pipet (Celstar Serological Pipettes, Greiner Bio-one, Wemmel, België) gevuld met elk 5 ml van het medium. De gevulde proefbuizen werden geautoclaveerd gedurende 15 minuten aan 121 C. Na het autoclaveren werden de proefbuizen schuin gelegd zodat het medium schuin kon stollen. Er is namelijk een schuine kant nodig aan het medium voor de enting van de kiem. De Gal Esculine Azide agar werd op een gelijkaardige manier bereid als het Kligler Iron medium. Alleen werd er in het begin 44,5 gram van een Gal Esculine Azide Agar poeder (Gal Esculine Azide Agar, Oxoid LTD., Hampshire, Engeland) afgewogen en in 1 liter gedestilleerde water gebracht. Voor de bereiding van de Peptone oplossing werd er telkens 3 gram Peptone Water poeder (Peptone Water, Oxoid LTD., Hampshire, Engeland) en 1 gram Tryptone poeder (Tryptone, Oxoid LTD., Hampshire, Engeland) afgewogen met een gestandaardiseerde weegschaal en in een kolf met 200 ml gedestilleerd water gebracht. Deze oplossing diende niet opgekookt te worden, omdat ze niet hoefde te stollen na afkoelen. Glazen proefbuizen werden door middel van een mechanische pipet gevuld met elk 5 ml van de oplossing. De gevulde proefbuizen werden geautoclaveerd gedurende 15 minuten aan 121 C. Deze proefbuizen dienden niet schuin gelegd te worden want de Peptone oplossing is een vloeistof. Ook het Kovacs reagens dat bij deze laatste test gebruikt wordt, werd zelf bereid. Hierbij Delphine Françoys 20

25 diende men 5 gram 4-dimethylamino benzaldehyde poeder (4-Dimethylamino Benzaldehyde, Sigma- Aldrich, Bornem, België) en 75 ml butylalcohol (Butylalcohol, Merck, Darmstadt, Duitsland) op te lossen en traag zoutzuur (Hydrochloric Acid, Sigma-Aldrich, Bornem, België) bij te voegen. Het droge 4-dimethylamino benzaldehyde poeder diende licht van kleur te zijn, de bekomen oplossing mocht niet diep bruin van kleur zijn. Het Kovacs reagens werd bewaard in een donkere fles om oxidatie tegen te gaan. De eigenlijke identificatie Per geënte McConkey agar plaat (dus per staal) werden twee isolaten onderworpen aan de drie biochemische testen. Elk isolaat werd opgenomen met een entnaald (Microloops, Biosigma SRL., Cona, Italië) en geënt op het Kligler Iron medium en op de Gal Esculine Azide agar door middel van een steekenting tot in de stomp van het medium en een zigzagenting op de tong. Vervolgens werd de entnaald in de Peptone oplossing gestoken om indolproductie na te gaan. De drie testen werden afgelezen na 24u incubatie bij 37 C onder aërobe omstandigheden. Isolaten die glucose en lactose konden fermenteren (geelverkleuring van het Kligler Iron medium), gas produceerden (gasvorming in het Kligler Iron medium), aesculine/gal en H2S negatief waren (geen verkleuring van de Gal Esculine Azide agar) en indol positief waren (roodverkleuring bij toevoeging van het Kovacs reagens), werden beschouwd als E. coli stammen. Foto 9: De drie biochemische testen vóór enting en incubatie, van links naar rechts: Kligler Iron medium, Gal Esculine Azide agar, Peptone oplossing Foto 10: De drie biochemische testen na enting en incubatie, van links naar rechts: Kligler Iron medium, Gal Esculine Azide agar, Peptone oplossing Delphine Françoys 21

26 Resistentiebepaling De antimicrobiële gevoeligheidstesten op de E. coli isolaten gebeurden aan de hand van agar disk diffusietesten, beschreven door Bauer en Kirby. De geteste kiemen werden met een swab (Cottontipped Applicator, Biolab Inc., Boedapest, Hongarije) van de Gal Esculine Azide agar genomen en in een fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS oplossing) gebracht om een verdunning van 0,5 McFarland te verkrijgen. Deze verdunning werd door middel van een tweede swab in twee richtingen uitgeënt op een Iso sensitest agarplaat (Oxoid LTD., Hampshire, Engeland). Per plaat werden 7 verschillende antimicrobiële middelen tabletten (Neo-Sensitabs, Rosco Diagnostica A/S, Taastrup, Denemarken) aangebracht met een dispenser. De 7 geteste antimicrobiële middelen waren: ampicilline 33 µg, amoxicilline/clavulaanzuur µg, cefquinome 30 µg, tetracycline 80 µg, trimethoprim/sulfadiazine 5,2+240 µg, enrofloxacine 10 µg en streptomycine 100 µg. De platen werden geïncubeerd gedurende 24u bij 37 C onder aërobe omstandigheden. Na de incubatieperiode werden de inhibitiezones afgelezen en in een Microsoft Excel werkblad opgeslagen. De zone diameters werden omgezet naar S, I of R; respectievelijk gevoelig (Susceptible), intermediair (Intermediate) of resistent (Resistant). Deze omzetting gebeurde op basis van de zone diameters volgens de CLSI richtlijnen (Clinical and Laboratory Standards Institute, het voormalige NCCLS of National Committee for Clinical Laboratory Standards), vermeld in Neo-Sensitabs User s Guide, Susceptibility testing (2009). Voor de weergave en de verwerking van de resultaten werd beslist om de kiemen die intermediair resistent waren, als gevoelig te beschouwen. Tabel 3: De 7 geteste antimicrobiële middelen met bijhorende zone diameters volgens de CLSI richtlijnen Antimicrobieel middel Zone diameter in mm S 1 I 2 R 3 amoxicilline/clavulaanzuur µg ampicilline 33 µg cefquinome 30 µg <20 tetracycline 80 µg <19 trimethoprim/sulfadiazine <19 5,2+240 µg enrofloxacine 10 µg streptomycine 100 µg S = gevoelig (Susceptible) 2 I = intermediair (Intermediate) 3 R = resistent (Resistant) Delphine Françoys 22

27 Foto 11: Kiemen op de geënte Gal Esculine Azide agar Foto 12: Kiemen worden in een PBS oplossing gebracht Foto 13: Er wordt een verdunning van 0,5 McFarland bekomen Foto 14: Dispenser met 7 verschillende antimicrobiële middelen tabletten Foto 15: De tabletten worden met de dispenser op de geënte Iso sensitest agarplaat aangebracht Delphine Françoys 23

28 Foto 16: Een geënte Iso sensitest agarplaat na incubatie De antimicrobial resistance index (ARI) Aan de hand van de gegevens (S, I, R) in het Microsoft Excel werkblad werd de antimicrobial resistance index (ARI) berekend van alle stalen. De ARI is de verhouding tussen het aantal geteste antimicrobiële middelen waartegen E. coli resistentie vertoont en het totale aantal geteste antimicrobiële middelen. De ARI kan variëren van 0 tot 1 of van 0% tot 100%. Een ARI gelijk aan 0 of 0% betekent dat E. coli tegen geen enkel getest antimicrobieel middel resistentie vertoont. Een ARI gelijk aan 1 of 100% betekent dat E. coli resistent is tegen alle geteste antimicrobiële middelen De behandelingsincidentie (BI) De werkelijk toegediende dosis van een antimicrobieel middel werd berekend op basis van het gemiddelde gewicht van het behandelde dier op het moment van therapie. Op basis van deze gegevens kon de behandelingsincidentie (BI) van de werkelijk toegediende dosis (BI UDD ) en van de aanbevolen dosis (BI ADD ) berekend worden. De BI geeft ons een idee over het aantal dieren per 1000 dat dagelijks met één dosis antimicrobieel middel behandeld wordt (Timmerman et al., 2006). In tabel 4 worden de formules voor de berekening van de BI gegeven. Om de correctheid van doseren na te gaan, werd de ratio van de UDD (werkelijk toegediende dosis in mg/kg levend gewicht op moment van therapie) en de ADD (aanbevolen dosis in mg/kg levend gewicht aangegeven op de bijsluiter) berekend. Een ratio gelijk aan 1 betekende een correcte dosering. Een foutmarge tussen 0,8 en 1,2 werd toegestaan. Een ratio lager dan 0,8 betekende een onderdosering van het product, terwijl een ratio boven 1,2 een overdosering aangaf. Delphine Françoys 24