Inhoud presentatie 17/11/2016. Kruiscontaminatie van varkensvoeder met antibiotica en de mogelijke effecten op resistentieselectie

Transcriptie

1 Kruiscontaminatie van varkensvoeder met antibiotica en de mogelijke effecten op resistentieselectie Laura Peeters BAPCOC Symposium Inhoud presentatie 1. Algemene inleiding 2. Voorstelling van een aantal resultaten uit het onderzoek voor project Crosscontam 2. In vitro proeven 3. Ex vivo proeven 3. Conclusies 1

2 INLEIDING Antibiotica in de varkensindustrie één van de belangrijkste verbruikers van antibiotica onder de voedselproducerende dieren Hoge infectiedruk Risico uitbraken - Frequente toepassing groepsmedicatie - Profylactisch, metafylactisch en therapeutisch - Meestal via voedermedicatie premix oraal poeder 2

3 Kruiscontaminatie van varkensvoeder Figuur Stolker et al., 2010 SPOELVOEDERS: Versleping van antibiotica van gemedicineerde batches naar niet-gemedicineerde batches Kruiscontaminatie van varkensvoeder Maximum toegelaten verslepingsniveaus 1. Europese wetgeving coccidiostatica en histomonostatica (Commission Directive 2009/8/EC) : max 3% van de maximaal toegelaten dosering 2. Convenant Verbanning hoofdmenger vanaf 1 januari Richtwaarden toegelaten verslepingsniveau s voor antibiotica: max 1% van de minimaal toegelaten dosering 3

4 Kruiscontaminatie van varkensvoeder Filippitzi et al., 2016 Antibioticaresistentie: resistentieselectie 4

5 Wanneer treedt resistentieselectie op? Klassieke hypothese Figuur uit Gullberg et al., 2011 Bij concentraties tussen de MIC van de gevoelige populatie en de MIC van de resistente populatie MIC = Minimum Inhibitorische Concentratie Wanneer treedt resistentieselectie op? Recente hypothese: Minimum Selectieve Concentratie De laagste concentratie antibiotica die nodig is om de lagere fitheid ten gevolge van de resistentie te neutraliseren 5

6 Project CROSSCONTAM RT 12/03 Onderzoeksvraag Wat is het effect van kruiscontaminatie van varkensvoeder met antibiotica (3% van de aanbevolen dosis) op de resistentieselectie en transfer in de intestinale microbiota van varkens? 3%? 12 6

7 Onderzoeksvraag 1. Welke antimicrobiële concentraties komen in de darm terecht? In vivo proef met 24 biggen 2. Wat is het effect van deze antimicrobiële concentraties op resistentieselectieen transfer? 1. In vitro proeven met pure culturen E. coli 2. Proeven met simulatiemodel van het varkenscecum KEUZE VAN DE ANTIMICROBIËLE MIDDELEN: 1. Doxycycline 2. Chloortetracycline 3. Sulfadiazine-trimethoprim Selectiecriteria: 1. Frequent gebruik onder vorm van premix 2. Verschillen in orale biologische beschikbaarheid 7

8 KEUZE VAN DE ANTIMICROBIËLE MIDDELEN: 1. Frequent gebruik onder de vorm van premix: KEUZE VAN DE ANTIMICROBIËLE MIDDELEN: 2. Orale biologische beschikbaarheid (BB) bij varken (Baert et al.) Sulfadiazine-trimethoprim: sulfadiazine BB = % trimethoprim BB = 60-80% Tetracyclines: Doxycycline BB = 20% Chloortetracycline BB = 6% 8

9 24 biggen (+/- 25 kg) 1.Doxycycline 2. Sulfa-trim 3. Chloortetracycline 4. Controle Experimenteel voeder met 3% van de aanbevolen dosis van het antibioticum Blanco voeder Proefopzet: D1 t.e.m. D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 Acclimatisatie (7d) Proefperiode = staalname mest = euthanasie en staalname caecum- en coloninhoud 9

10 antimicrobial concentration (mg/kg) 17/11/2016 ANALYSE - Effectieve concentraties van de antibiotica in de experimentele voeders werden nagegaan - 6 meststalen per dier - 4 stalen per dier van darminhoud: caecum en begin, midden en einde van colon. - Techniek: In-house LC-MS/MS methodes (UGent en ILVO) RESULTATEN (mest) Day 0 Day 2 Day 4 Day 6 Day 8 Day 10 Chloortetracycline (10 mg/kg) Doxycycline (4 mg/kg) Sulfadiazine (0,5 mg/kg) Trimethoprim: waarden onder detectielimiet 10

11 RESULTATEN (caecum en coloninhoud) Transfer ratio s (TR)voor de verschillende antibiotica en vergelijking met orale biologische beschikbaarheid (BB): TR Caecum-/coloninhoud TR Mest BB Chloortetracycline 82% 92% 6% Doxycycline 39% 52% 20-50% Sulfadiazine 4,1% 4,5% % Trimethoprim ND ND 60-80% Transfer ratio = Gemiddelde concentratie in de mest/darminhoud Gemiddelde concentratie in voeder 11

12 Publicatie over deze studie: Peeters LE, Daeseleire E, Devreese M, Rasschaert G, Smet A, Dewulf J, et al. Residues of chlortetracycline, doxycycline and sulfadiazine-trimethoprim in intestinal content and feces of pigs due to cross-contamination of feed. Bmc Vet Res. 2016;12: In vitro proeven DOELSTELLING: Bepalen of een kiem (E. coli) die drager is van een resistentiegen (teta) uitgeselecteerd wordt bij 4 µg/ml en 1 µg/ml doxycycline Competitie-experimenten tussen doxycycline resistente en gevoelige E. coli in vitro in drie verschillende milieus: 4 µg/ml doxycycline, 1 µg/ml doxycycline en blanco 12

13 2. In vitro proeven Selectie van E. coli stammen: Uit bestaande FAVV collectie (monitoring antibioticaresistentie) Commensalen geïsoleerd uit varkensfeces 3 doxycycline resistente stammen Herkenbaar als witte kolonies 4 stammen gevoelig aan een panel van 14 antibiotica Herkenbaar als rode kolonies 2. In vitro proeven Lac - Lac + Resistente stam Tetracycline resistent en Lac - Mix: blanco/ + doxycycline Gevoelige stam Lac+ Luria Bertani bouillon Uitplatingen op selectieve platen: tellen resistente en gevoelige bacteriën 13

14 2. In vitro proeven ANALYSE VAN DE TELRESULTATEN Het selectief effect van het milieu op de resistente bacteriën werd berekend als de verhouding van het aantal resistente bacteriën op het aantal gevoelige bacteriën Selectief effect = 2. In vitro proeven RESULTATEN 14

15 log(r)/log(s) 17/11/ In vitro proeven A EC 400 EC 400RIF EC 298 EC 588RIF 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, h 48h 2. In vitro proeven Conclusie 1 en 4 mg/l doxycycline hadden beiden een significant hoger selectief effect op de alle resistente stammen dan het blanco milieu. Er werd geen verschil in effect gevonden tussen 1 en 4 mg/l doxycycline. 15

16 2. In vitro proeven 3. Ex vivo proeven DOELSTELLING: Groei opvolgen van een donorstam resistent aan DOX (EC 682) in een gesimuleerde microbiota van het varkenscaecum onder verschillende condities: 1. Continue aanwezigheid van 1 µg/ml DOX 2. Continue aanwezigheid van 4 µg/ml DOX 3. Blanco controle 2. In vitro proeven 3. Ex vivo proeven Inoculum: DONOR STAM: Lactose negatieve mutant van DOX resistente E. coli EC 682 Cecuminhoud van biologische varkens Medium: + 0 µg/ml DOX(= BLANCO) + 1 µg/ml DOX elk 3 herhalingen + 4 µg/ml DOX + 0 µg/ml DOX zonder donorstam: 1x 16

17 2. In vitro proeven 3. Ex vivo proeven Dagelijks staal reactorinhoud Opgroeien op selectieve agarplaten voor resistente coliformen (MacConkey n mg/l DOX) Lac - Tellen van de gekende resistente E.coli donorstam EC 682 (witte kolonies) 2. In vitro proeven 3. Ex vivo proeven RESULTATEN 17

18 cfu/ml 17/11/ In vitro proeven 3. Ex vivo proeven 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 DOX BLANK 1 µg/ml DOX 4 µg/ml DOX Time (days) 1. In vivo proef 2. In vitro proeven 3. Ex vivo proeven Conclusie SAMENGEVAT 1. Kruiscontaminatie van varkensvoeder met antibiotica (tetracyclines) kan leiden tot belangrijke residuele concentraties van dit antibioticum ter hoogte van de intestinale microbiota! 2. De residuele intestinale concentraties van doxycycline ten gevolge van 1 en 3% kruiscontaminatie kunnen een aanrijking van resistente bacteriën ter hoogte van de intestinale microbiota veroorzaken 18

19 1. In vivo proef 2. In vitro proeven 3. Ex vivo proeven Conclusie TAKE HOME MESSAGE Behandeling groep varkens met therapeutische dosis antibiotica Spoelvoeders toegediend aan andere groepen varkens Resistentieselectie ter hoogte van de intestinale microbiota Varkensvlees besmet met resistente bacteriën Resistente bacteriën via feces in omgeving Besmetting van mens en dier met resistente bacteriën Bedankt Partners: CODA-CERVA, Faculteit Diergeneeskunde UGent, ILVO, FOD Volksgezondheid, Veiligheid van de Voedselketen en Leefmilieu Promotoren: Patrick Butaye, Siska Croubels, Jeroen Dewulf, Els Daeseleire, Freddy Haesebrouck, Hein Imberechts, Marc Heyndrickx, Geertrui Rasschaert, Annemieke Smet, Els Van Coillie 19

20 Bedankt voor uw aandacht Nog vragen? 20