Automatisatie van immunofluorescentie. op paraffinecoupes en vriescoupes van nierbiopten. met de Benchmark XT

Transcriptie

1 Woord vooraf Dit eindwerk kadert in het behalen van het bachelordiploma biomedische laboratoriumtechnologie afstudeerrichting medische laboratoriumtechnologie. Hierbij kreeg ik de kans om mijn eindwerkstage te volgen op de dienst pathologische anatomie van het AZ Sint-Jan ziekenhuis te Brugge. Eerste en vooral wil ik mijn mentors bedanken, Dr. P. De Paepe en de heer T. Pont. Dr. P. De Paepe gaf mij de kans om te schrijven over een boeiend onderwerp en stond in voor de opvolging van mijn eindwerk. De heer T. Pont voor de hulp bij de praktische uitvoering en begeleiding van mijn eindwerk. Ook zou ik graag de laboranten van de dienst pathologische anatomie bedanken voor de goeie zorgen en leuke stageperiode. Mijn dank gaat ook uit naar Mevr. L. Baillieu die mij vaak heeft geholpen bij de praktische uitvoering van mijn eindwerk. Mevrouw N. Kellner, mijn stagebegeleidster, zou ik willen bedanken voor het verbeterwerk en de hulp bij verdere vragen. Ook gaat mijn dank uit naar alle lectoren voor de drie leerrijke jaren. Tot slot wil ik mijn ouders en vriend bedanken voor hun steun. 1

2 Samenvatting Dit eindwerk handelt over de automatisatie van immunofluorescentie op paraffinecoupes en vriescoupes van nierbiopten met het toestel de Benchmark XT. Het theoretisch deel omvat de belangrijkste vormen van glomerulonefritis en de specifieke immuuncomplexen zoals IgA, IgG, IgM, C3, C1q, kappa en lambda die men kan terugvinden bij deze vormen. De immuuncomplexen worden opgespoord met immunofluorescentie. De apparatuur die hierbij gebruikt wordt zijn de immunofluorescentiemicroscoop, de Benchmark XT en de vriesmicrotoom. Daarna wordt in het hoofdstuk materiaal en methode, de verschillende technieken voor zowel de fluorescentie kleuring op vriescoupes als op paraffinecoupes beschreven. De coupes worden beoordeeld naargelang de kleurintensiteit van de deposities. Om te eindigen wordt enerzijds de immunofluorescentie kleuring op vriescoupes vergeleken met paraffinecoupes en anderzijds wordt de manuele methode vergeleken met de geautomatiseerde methode op de Benchmark XT. 2

3 Lijst met afkortingen en symbolen ASF Al Automatische fluidica module. Antilichaam. CC1 Cell conditioner 1. CC2 Cell conditioner 2. C H C L DAB Fab Fc FISH FITC GBM IF IHC Ig ISH kd LCS MAC MPGN PBS Constant domein van de zware keten. Constant domein van de lichte keten. 3,3 diaminobenzidine tetrahydrochloride. Antigeen bindend fragment. Kristalliseerbaar fragment. Fluorescentie in situ hybridisatie. Fluoresceïne isothiocyanaat. Glomerulaire basale membraan. Immunofluorescentie. Immunohistochemisch. Immunoglobuline. In situ hybridisatie. Kilo Dalton. Liquid coverslip. Membraan aanvallend complex. Membranoproliferatieve glomerulonefritis. Phosphate buffered saline. 3

4 SISH SLE SSC V H V L Silver in situ hybridisatie. Systemische lupus erytromatosus. Sodium chloride sodium citraat buffer. Variabel deel van de zware keten. Variabel deel van de lichte keten. 4

5 Verklarende woordenlijst Amyloïd Betahemolytische streptokokken Diffuus Depositie Endocarditis Exces Fibrillaire glomerulonefritis Focaal Granulair Globaal Glomerulonefritis Hematurie Amyloïd, extracellulaire fibrillaire eiwitten die worden afgezet in de glomerulaire basale membraan en in het mesangium. Deze bacteriën produceren hemolysines die de rode bloedcellen volledig lyseren. Patroon van een glomerulaire aandoening waarbij alle glomeruli in beide nieren worden aangetast. Afzetting van een welbepaalde stof in een weefsel. Ontsteking van het endocard, de binnenbekleding van het hart. overvloed, teveel. Een vorm van glomerulonefritis die gekenmerkt wordt door de aanwezigheid van een fibrillaire neerslag. Patroon van een glomerulaire aandoening waarbij sommige glomeruli worden aangetast. Korrelig. Patroon van een glomerulaire aandoening waarbij gans de glomerulus in dezelfde mate wordt aangetast. Verzamelnaam voor een groep ziekten waarbij de primaire afwijking een bepaalde zichtbare afwijking in de glomerulus is. De aanwezigheid van rode bloedcellen in de urine. Idiopatisch Zonder bekende oorzaak. 5

6 Isotypes Mesangium Myeloom Mercaptanen Nefritisch syndroom Nefrotisch syndroom Percutaan Proliferatie Proteïnurie Podocyten Polyanionische lading Polymerisatie Subepitheliaal Segmentaal Verschillen tussen de genen van de constante domeinen. Bindweefsel tussen de bloedvaten van de glomeruli. Bestaat uit mesangiale cellen die kunnen fagocyteren en de mesangiale matrix. Kankercel. Breken disulfidebruggen. Ontstaat door proliferatie van endotheel of mesangiumcellen die gepaard gaat met hematurie. Ontstaat door een zichtbare verandering in de glomerulaire basale membraan of afzetting van een overmatige hoeveelheid mesangiale matrix wat leidt tot een abnormaal verlies van eiwit in de urine. Door de huid heen. Vermeerdering van cellen. De aanwezigheid van eiwitten in de urine. Endotheelcellen van het glomerulaire haarvatennewerk in de nier. Bevindt zich op het buitenoppervlak van de basale membraan en houden in normale omstandigheden de eiwitten tegen zodat ze niet in de urine terechtkomen. Samenvoegen van kleine ketens koolwaterstoffen tot een lange keten. Een laagje weefsel vlak onder de epitheelcellen. Patroon van een glomerulaire aandoening waarbij een deel van de glomerulus wordt aangetast. 6

7 Retroperitoneum Vasculitis Achter het buikvlies, peritoneum. Beschadiging van de vaatwand. 7

8 Lijst van tabellen en figuren Figuur 2.1: Doorsnede van de nier. (4) 13 Figuur 2.2: Bouw van een nefron. (4) 14 Figuur 2.3: De glomerulaire filter. (5) 15 Figuur 2.4: Acute diffuse proliferatieve glomerulonefritis. (5) 16 Figuur 2.5: Membraneuze glomerulopathie. (5) 17 Figuur 2.6: Type I en II membranoproliferatieve glomerulonefritis. (5) 18 Figuur 2.7: Focale segmentale glomerulonefritis (IgA-nefropathie). (5) 19 Figuur 2.8: Minimale change glomerulopathie. (5) 20 Figuur 2.9: Structuur Immunoglobuline. (9) 21 Figuur 2.10: Structuur IgG. 22 Figuur 2.11: Structuur IgM. 23 Figuur 2.12: Structuur IgA. 24 Figuur 2.13: Complement activatie. (8) 25 Figuur 2.14: Principe van fluorescentie. (10) 27 Figuur 2.15: Principe van de fluorescentiemicroscoop. (11) 28 Figuur 2.16: Benchmark XT. (12) 29 Figuur 2.17: Reagens tray met dispensers voor FITC kleuring. 30 Figuur 2.18: Staining module. 30 Figuur 2.19: Opengetrokken glaasjescarrousel. 30 Figuur 2.20: Automatische fluidica module (ASF). 31 Figuur 2.21: Directe immunofluorescentie. 31 8

9 Tabel 3.1: Benodigdheden. 34 Tabel 3.2: Heamatoxyline-eosine kleuring op vriescoupes. 36 Tabel 3.3: Verdunningen van de DakoCytomation primaire FITC gelabelde antilichamen. 37 Tabel 3.4: Aangepaste incubatietijden voor de verschillende VENTANA FITC gelabelde primaire antilichamen. 38 Tabel 3.5: Producten gebruikt bij FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT op vriescoupes. 39 Tabel 3.6: Producten gebruikt bij FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT op paraffinecoupes. 43 Figuur 4.1: Deposities van IgA. 45 Figuur 4.2: Deposities van C3. 46 Figuur 4.3: Deposities van IgM. 48 Figuur 4.4: Deposities van C1q. 49 9

10 Inhoudsopgave Woord vooraf... 1 Samenvatting... 2 Lijst met afkortingen en symbolen... 3 Verklarende woordenlijst... 5 Lijst van tabellen en figuren... 8 Inhoudsopgave Inleiding, situatieschets en probleemstelling Literatuurstudie De nier Pathologie: Glomerulonefritis Acute diffuse proliferatieve glomerulonefritis Membraneuze glomerulopathie Membranoproliferatieve glomerulonefritis (MPGN) Focale segmentale proliferatieve glomerulonefritis Minimal change glomerulopathie Systemische lupus erytromatosus (SLE) Antilichamen Algemeen Kappa en lambda IgG IgM IgA Het complement C C1q

11 2.5 Immunofluorescentie De fluorescentiemicroscoop Benchmark XT Algemene werking van de Benchmark XT Principe van de FITC kleuring De vriesmicrotoom Materiaal en methode Staalcollectie Benodigdheden Immunofluorescentie op vriescoupes Verwerking vers nierbiopt Procedure FITC kleuring Immunofluorescentie op paraffinecoupes Verwerking gefixeerd nierbiopt Procedure FITC kleuring Beoordeling van de preparaten Resultaten Discussie Conclusie...52 Literatuurlijst...53 Bijlagen...55 Voor akkoord verklaring

12 Literatuurstudie 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling Op de dienst pathologische anatomie van het AZ Sint-Jan Ziekenhuis te Brugge wordt immunofluorescentie voor de diagnose van functionele nierpathologie toegepast. De immunofluorescentie wordt manueel uitgevoerd op vriescoupes van nierbiopten. Bij deze techniek wordt gebruik gemaakt van fluorescent gelabelde antilichamen die gaan binden met weefselantigenen. De coupes worden afgelezen met de fluorescentiemicroscoop door de anatoompatholoog. Het doel van dit eindwerk is enerzijds de immunofluorescentie kleuring op vriescoupes te vergelijken met paraffinecoupes en anderzijds om de manuele methode te vergelijken met de geautomatiseerde methode op de Benchmark XT. De Benchmark XT is een toestel dat gebruikt wordt voor het uitvoeren van immunohistochemische kleuringen, in situ hybridisatie (ISH) kleurprocessen, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en zilver in situ hybridisatie (SISH) kleuringen. Door het aanmaken van het juiste protocol zal ook een fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) kleuring mogelijk zijn op de Benchmark XT. 12

13 Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 De nier De nieren zijn roodbruine boonvormige organen van ongeveer twaalf centimeter lang en liggen achter in het retroperitoneum vlak onder het middenrif, aan weerszijden van de wervelkolom. De bloedtoevoer naar de nieren gebeurt via de nierslagader en de bloedafvoer via de nierader. Het nierweefsel bestaat uit twee lagen: de schors en het merg. De schors (de buitenste zachte laag die veel glomeruli bevat) en het merg (de binnenste laag) zijn opgebouwd uit nierpiramiden die uitmonden in de nierkelken. Dit wordt getoond in figuur 2.1. De nieren zorgen voor de filtratie van het bloed en handhaven de homeostase van water en elektrolyten. Samen met de longen regelen de nieren ook de zuurtegraad van het bloed. Figuur 2.1: Doorsnede van de nier.(4) 13

14 Literatuurstudie De belangrijkste functionele eenheid van de nier is het nefron ( zie fig. 2.2). Een nier bevat ongeveer een miljoen nefronen. Elk nefron is net een zeefje dat is opgebouwd uit een glomerulus en een nierbuisje, tubulus genaamd. Figuur 2.2: Bouw van een nefron. 1 = glomerulus, 2 = slagadertje, 3 = kapsel van Bowman, 4 = tubulus, 5 = ader waarin de haarvaten rond een nefron uitkomen, 6 = lis van Henle, 7 = Verzamelbuis.(4) De glomerulus (zie figuur 2.3) is een capillair systeem waar het bloed wordt gefiltreerd. Door de bouw en de ionenlading van het glomerulaire basale membraan gebeurt de filtratie selectief. Na filtratie blijven eiwitten en bloedcellen achter. Het filtraat dat wordt verzameld in het kapsel van Bowman bevat veel water, zouten en andere opgeloste stoffen zoals glucose, kreatinine en ureum. Het kapsel van Bowman geeft het fitraat door naar het tubulussysteem dat bestaat uit een proximale tubulus, lis van Henle, distale tubulus en een verzamelbuis. In de proximale tubulus gebeurt een selectieve resorptie van verschillende nog bruikbare bestanddelen uit 14

15 Literatuurstudie het glomerulaire filtraat. De lis van Henle, de distale tubulus en de verzamelbuis zorgen voor resorptie van water en ionen. De gevormde urine is nu een mengsel van afvalstoffen en overgebleven water en zouten die het lichaam niet meer kan gebruiken. Figuur 2.3: De Glomerulaire filter.(5) 2.2 Pathologie: Glomerulonefritis Bij glomerulaire aandoeningen kan men verschillende patronen terugvinden. Bij een globale aantasting is de ganse glomeruli in dezelfde mate aangetast. Bij Segmentaal gaat het slechts over een deel van de glomerulus die aangetast is. Diffuus tast alle glomeruli aan in beide nieren en dit in tegenstelling tot focaal waar het enkel gaat over sommige glomeruli die aangetast zijn. 15

16 Literatuurstudie Acute diffuse proliferatieve glomerulonefritis Een keelontsteking met betahemolytische streptokokken is de meest voorkomende oorzaak van een acute diffuse proliferatieve glomerulonefritis. Ook pneumokokken, stafylokokken en virussen kunnen de mogelijke oorzaak zijn. Na infectie worden immuuncomplexen gevormd die in het bloed circuleren en blijven hangen in de glomerulaire filter. Acute diffuse proliferatieve glomerulonefritis veroorzaakt het nefritisch syndroom met proliferatie van endotheel en mesangium en aantrekking van neutrofielen (zie fig. 2.4). Bij immunofluorescentie kan men een granulaire afzetting van IgG en C3 aantonen in de glomerulaire basale membraan en het mesangium. Figuur2.4: Acute diffuse proliferatieve glomerulonefritis.1 = proliferatie van endotheel met neutrofielen, 2 = subepitheliale immuuncomplexen, 3 = een te celrijk mesangium. (5) 16

17 Literatuurstudie Membraneuze glomerulopathie Membraneuze glomerulopathie ook wel membraneuze glomerulonefritis genoemd wordt gekenmerkt door de vorming van immuuncomplexen op het subepitheliale oppervlak van de basale membraan. De afzetting van de immuuncomplexen verdwijnt na een tijdje waarna een verdikte basale membraan met kantachtige holten achterblijft (zie fig. 2.5). De basale membraan wordt zo zeer doorlaatbaar en er is verlies aan polyanionische lading, die in normale omstandigheden eiwitten tegenhouden. Bij immunofluorescentie is er een granulaire neerslag te zien bestaande uit IgG en een kleine hoeveelheid complement. Membraneuze glomerulopathie is een van de belangrijkste oorzaken van het nefrotisch syndroom bij volwassenen. In 80% van de gevallen is de ziekte idiopathisch en gaat soms gepaard met systeemziekten of het gebruik van bepaalde geneesmiddelen. Bij ongeveer 50% van de patiënten ontwikkelt zich na jaren een chronische nierinsufficiëntie. Figuur 2.5: Membraneuze glomerulopathie. 1 = elektronendichte afzettingen, 2 = lichte toename van het mesangium, 3 = na opruimen van afzettingen blijven kantachtige holten achter in het membraan, 4= afzetting van mesangiale matrix. (5) 17

18 Literatuurstudie Membranoproliferatieve glomerulonefritis (MPGN) Membranoproliferatieve glomerulonefritis ook wel mesangiocapillaire glomerulonefritis genoemd wordt gekenmerkt door veranderingen in de basale membraan en proliferatie van mesangiale en glomerulaire cellen (zie fig. 2.6). Het is het gevolg van complementafwijkingen. De verdikking van het basale membraan veroorzaakt proteïnurie of een nefrotisch syndroom. Proliferatie van de glomerulaire cellen kan hematurie of een nefritisch syndroom ontwikkelen. Bij sommige patiënten ziet men een gemengd nefritisch/nefrotisch syndroom. Er zijn drie idiopatische subtypen bekend van MPGN, elk met een eigen pathogenese. Type I MPGN komt voor bij 90% van de gevallen en meestal bij adolescenten en jongvolwassenen. Bij het type I MPGM is er niet alleen complementafzetting maar ook immuuncomplexafzetting in het glomerulaire basale membraan (GBM). De complementfactor die het meest voorkomt in de glomerulaire afzetting is C3 en de immunoglobulinen IgG, IgM en soms IgA. De verdikking van het GBM wordt ook veroorzaakt door ingroei van cytoplasma uitlopers van mesangiale cellen tussen het endotheel en de basale membraan. Zo krijgt men een verdubbeld of tramrail membraan. Figuur 2.6: Type I en II membranoproliferatieve glomerulonefritis. 1 = mesangiale proliferatie, 2 = ingroei van mesangiaal cytoplasma, 3 = complementafzetting. (5) Type II MPGN komt voor bij 10% van de patiënten die vooral kinderen en jongvolwassenen zijn. Bij type II MPGN zijn er geen immuuncomplexafzettingen aanwezig. Enkel C3 is 18

19 Literatuurstudie terug te vinden in de basale membraan door een abnormale activatie van het complementsysteem. De GBM heeft een uitgesproken verdikking, maar de mesangiale proliferatie is minder opvallend dan bij type I MPGN. Door de aanwezigheid van een verdubbeld of tramrail membraan wordt de aandoening ook wel nog dense deposit disease genoemd. Type II heeft een slechte prognose, wat een chronische nierinsufficiëntie als gevolg heeft Focale segmentale proliferatieve glomerulonefritis Focale segmentale proliferatieve glomerulonefritis heeft verschillende oorzaken die in twee groepen kunnen worden verdeeld: primaire vormen en secundaire vormen. Van de primaire vormen is IgA nefropathie (ziekte van Berger) de meest voorkomende oorzaak van glomerulonefritis bij volwassenen (zie fig. 2.7). Hematurie of proteïnurie zijn karakteristiek voor deze ziekte. Er is een segmentale en focale proliferatie van de glomerulaire vaatkluwens. Immunofluorescentie toont aan dat de afzetting in het mesangium en bij de overgang van het mesangium en de basale membraan IgA is. Figuur 2.7: Focale segmentale proliferatieve glomerulonefritis (IgA nefropathie). (5) Secundaire oorzaken zijn vaak infectieuze endocarditis, vasculitis en bindweefselziekten als SLE. 19

20 Literatuurstudie Minimal change glomerulopathie Minimal change glomerulopathie komt meestal voor bij kinderen en veroorzaakt proteïnurie en het nefrotisch syndroom. Lichtmicroscopisch zijn er geen afwijkingen te zien. Electronenmicroscopisch kan men een fusie tussen de voetjes van de podocyten waarnemen (zie fig. 2.8). Het basale membraan verliest zijn polyanionische lading waardoor eiwitten in de urine terecht komen. Immuuncomplexen of afzettingen worden niet teruggevonden. Figuur 2.8: Minimal change glomerulopathie. (5) Systemische lupus erytromatosus (SLE) SLE is een systemische bindweefselziekte waarbij de glomerulus op verschillende manieren wordt aangetast. Men krijgt bij SLE vaak diffuse membraneuze glomerulonefritis te zien met als kenmerk de aanwezigheid van IgG, IgM, IgA, C3 en C1q beter bekend als een full house. Ook membranoproliferatieve glomerulonefritis en focale segmentale proliferatieve glomerulonefritis zijn het gevolg van SLE. 20

21 Literatuurstudie 2.3 Antilichamen Veel glomerulusaandoeningen zijn het gevolg van immunologische beschadiging. Zo gaat men immuuncomplexen van IgG, IgM, IgA, C3, C1q, kappa en lambda opsporen met immunofluorescentie Algemeen Antilichamen, ook wel immunoglobulinen (Ig) genoemd behoren tot een groep van proteïnen die deel uitmaken van het afweersysteem. De algemene structuur van een immunoglobuline (Ig) is opgebouwd uit twee identieke zware ketens (H-ketens) en twee identieke lichte ketens (L-ketens) (zie fig. 2.9). De immunoglobulinen worden onderverdeeld in vijf klassen: IgG, IgM, IgA, IgE en IgD, afhankelijk van het type zware keten. De Immunoglobulinen IgG, IgM en IgA worden opgespoord bij immunofluorescentie en zullen verder besproken worden. Figuur 2.9: Structuur Immunoglobuline. 1 = Fab gedeelte, 2 = Fc gedeelte, 3 = H -keten met één variabel domein (V H) gevolgd door één constant domein (C H1), een scharniergedeelte en nog twee constante domeinen (C H2 en C H3), 4 = L -keten met één variabel domein (V L) en één constant domein (C L), 5 = Antigeen bindingsplaats, 6 = scharnier gedeelte. (9) 21

22 Literatuurstudie Kappa en lambda Er bestaan twee soorten lichte ketens: kappa (κ ) en lambda ( λ ). De verhouding van antilichamen met een kappa en of lambda keten geeft een verschil bij verschillende species. Afwijkingen van deze verhouding wijzen op abnormaliteiten in het immuunsysteem. De normale verhouding bij de mens van kappa/lambda bedraagt 1,6 2,6 in serum. Bij een monoklonale gammapathie wordt één type lichte keten in exces geproduceerd wat te wijten is aan een onderliggende plasmaceltumor of proliferatie. Indien meer dan 20% monoklonale plasmacellen aanwezig in het beenmerg wijst dit op een myeloom. Plasmacelproliferaties en myelomen kunnen gepaard gaan met een amyloïd of lichte keten depositie in de nieren. Ten gevolge van hun licht moleculair gewicht, worden lichte ketens normaal gefilterd door glomeruli en geresorbeerd door proximale tubulaire cellen. Daarom worden ze regelmatig teruggevonden in het cytoplasma van deze cellen IgG Immunoglobuline G is een monomeer opgebouwd uit twee lichte ketens van het kappa en of lambda type en twee zware ketens (γ ) (zie fig. 2.10). IgG is kwantitatief de meest belangrijke onder de antistoffen. Er zijn vier subklassen van IgG gekend: IgG 1, IgG 2, IgG 3 en IgG 4. De biologische functies van de vier subklassen zijn verschillend. IgG isotypes worden geassocieerd met complement fixatie, opsonisatie, fixatie van macrofagen en membraan transport. Figuur 2.10: Structuur IgG 22

23 Literatuurstudie IgG komt het meest voor in de immuuncomplexen bij idiopatische membraneuze nefropathie en bij ziekte van het antiglomerulair basaal membraan. Bij interstiële nefritis kan IgG terug gevonden worden als een granulair of lineair patroon in het basale membraan van de tubuli of in de peritubulaire capillairen en als granules in de interstitiële ruimten. Granulair IgG kan te zien zijn in het cytoplasma van de proximale tubulaire cellen. Dit komt frequent voor bij patiënten met glomerulonefritis en proteïnurie als gevolg van reabsorptie door de tubulaire cellen van ultragefiltreerde proteïnen IgM Immunoglobuline M heeft een pentamere structuur en is opgebouwd uit vijf subeenheden van elk 180 kd (zie fig. 2.11). De subeenheden bestaan elk uit twee zware ketens (µ) en twee lichte ketens van het kappa en of lambda type. De µ-keten bevat één constant domein meer dan de andere immunoglobulinen. Door mercaptanen wordt de pentamere structuur van IgM verbroken. IgM als dimeer bezit een extra peptidenketen, de J-keten. De J-keten helpt bij de polymerisatie tot het pentameer die een grote flexibiliteit vertoont zonder scharniergedeelte. Figuur 2.11: IgM als pentameer. IgM is een zeer grote molecule om door het basale membraan te passeren wat vaak zorgt voor een afzetting van IgM op het BM. Zo is IgM het meest voorkomende antigeen bij focale segmentale glomerulosclerose (FSGS). 23

24 Literatuurstudie FSCS wordt gekenmerkt door sclerose die zich slechts in een paar glomeruli voordoet. Alleen sommige delen van de glomeruli worden aangetast IgA Immunoglobuline A die voornamelijk aanwezig is in secreties is opgebouwd uit twee lichte ketens van het kappa en of lambda type en twee zware ketens (α 1 of α 2 ) (zie fig. 2.12). Er zijn twee subklassen van IgA gekend : IgA 1 en IgA 2. IgA komt zowel in een monomere vorm als in een dimere vorm voor. Het antilichaam is in serum aanwezig in de monomere vorm met een moleculair gewicht van 160 kd. De dimere vorm komt voor in secreties en heeft een moleculair gewicht van 390 kd. IgA als dimeer bezit net zoals IgM een extra peptiden keten de J-keten. Figuur 2.12: IgA als dimeer IgA domineert als antigeen bij IgA-nefropathie. IgA-nefropathie is wereldwijd de meest voorkomende ziekte van de glomeruli. Het belangrijkste kenmerk van deze ziekte is de neerslag van IgA in het mesangium. 24

25 Literatuurstudie 2.4 Het complement Het complement is een groep proteïnen in het bloed en in andere lichaamsvloeistoffen die een grote rol spelen in de humorale immuniteit. Wanneer het complement geactiveerd wordt door antigeenantilichaam complexen of door andere agentia zoals bijvoorbeeld proteolytische enzymen doodt het bacteriën en andere micro-organismen. Complement activatie resulteert in de vrijzetting van peptiden die de vasculaire permeabiliteit verhogen, vrijzetting van histamine en aantrekken van witte bloedcellen. De belangrijkste stap in het complementsysteem is de activatie van C3. Het component C3 is in grote hoeveelheid aanwezig in het bloed. Er zijn twee mogelijkheden voor de activatie van C3, via de klassieke route of via de alternatieve route (zie fig. 2.13). Figuur 2.13: Complement activatie (8) 25

26 Literatuurstudie De klassieke route heeft calcium nodig en wordt geactiveerd wanneer de C1q component bindt met de immunoglobulinen IgG of IgM. De alternatieve route heeft magnesium nodig en is niet afhankelijk van antilichamen. De activatie van C3 door beide routes resulteert in een deling van de component in twee fragmenten, een klein fragment C3a en een groot fragment C3b. Het grotere fragment bindt aan een bimoleculair enzym en zo wordt een nieuw trimoleculair complex gevormd. Dit nieuwe complex start de deling van C5 tot een klein fragment C5a en een groot fragment C5b. Door het ontstaan van het C5b fragment uit vorige stap leidt dit tot de samenstelling van het membraan aanvallend complex (MAC). Het MAC bestaat uit één molecuul C5b, C6, C7, C8 en 10 tot 16 moleculen van C9. C7 en C8 ondergaan een structurele verandering zodat de hydrofobe domeinen van deze moleculen in de membraan gebracht worden. Dit veroorzaakt reeds een kleine membraanbeschadiging en dient ook om de polymerisatie te induceren van C9. Er zijn ongeveer 10 tot 16 moleculen van C9 nodig om één MAC te vormen. Zo wordt er een kanaal van ongeveer 10 nm diameter gemaakt. Dit kanaal vernietigt het buitenmembraan van de doelwitcel, wat leidt tot de dood van de cel C3 C3 komt het meest voor in de immuuncomplexen bij acute postinfectueuze glomerulonefritis, maar ook bij type I en type II mesangiocapillaire glomerulonefritis. Bovendien komt het ook heel frequent voor in IgA nefropathie, membraneuze glomerulopathie, lupus glomerulonefritis en fibrillaire glomerulonefritis. Bij sommige types van interstitiële nefritis is C3 terug te vinden langs het basale membraan van de tubuli en peritubulaire capillairen, alsook in het interstitium C1q C1q komt het meest voor in de immuuncomplexen bij proliferatieve lupus glomerulonefritis, vooral in actieve vorm, die men kan terugvinden in zowel de glomeruli en langs de tubulaire en de vasculaire basale membranen. C1q is ook frequent in type I mesangioca- 26

27 Literatuurstudie pillaire glomerulonefritis. C1q nefropathie wordt beschouwd als een subvorm FSGS met predominante C1q depositie. 2.5 Immunofluorescentie Bij immunofluorescentie maakt men gebruik van een fluorochroom, een fluorescerende stof zoals fluoresceïne isothiocynaat (FITC). Als deze stof bestraald wordt door licht met een korte golflengte gaat ze licht uitzenden met een langere golflengte. Dus als FITC bestraald wordt door blauw licht met een golflengte tussen nm dan zendt het een groen licht uit met een golflengte tussen nm (zie fig. 2.14). Figuur 2.14: Principe van fluorescentie. 1= het atoom absorbeert energie die wordt geëxciteerd, 2= het elektron springt naar een hoger energieniveau, 3= het elektron valt terug naar zijn grondtoestand en zendt licht uit. (10) De fluorescentiemicroscoop Een fluorescentiemicroscoop is voorzien van een episcopische belichting, d.w.z. dat het licht valt van boven doorheen het objectief op het staal. De emissie wordt op zijn beurt doorheen hetzelfde objectief teruggestuurd. Het centrale element, verantwoordelijk voor de epifluorescentie, is de fluorescentietubus. Deze is opgebouwd uit een excitatiefilter, een emissiefilter en een dichromatische spiegel. Licht afkomstig van de kwiklamp wordt door de excitatiefilter zodanig gefiltreerd dat enkel licht met een specifieke golflengte wordt doorgelaten. Dit gefiltreerde licht wordt door de 27

28 Literatuurstudie dichromatische spiegel doorheen het objectief op het staal gericht. Specifiek aan de dichromatische spiegel is de eigenschap om licht van een bepaalde golflengte tegen te houden, terwijl licht met een andere golflengte doorgelaten wordt. In de epifluorescentie wordt het exciterende licht tegengehouden, terwijl het fluorescerende licht doorgelaten wordt. De emissiefilter filtreert op zijn beurt het fluorescerende licht zodat enkel licht van een specifieke golflengte via het oculair zichtbaar wordt. Figuur 2.15: Principe van de fluorescentiemicroscoop. (11) 28

29 Literatuurstudie 2.6 Benchmark XT De Benchmark XT is een toestel dat gebruikt wordt voor het uitvoeren van verschillende kleurprocessen zoals IHC-, ISH-, FISH-, SISH- en FITC-kleuring (zie fig. 2.16). Figuur 2.16: Benchmark XT. (12) Algemene werking van de Benchmark XT De Benchmark XT automatiseert verschillende kleurprocessen. Als voorbereidend werk moet op elk objectglaasje een barcode aangebracht worden. Elke barcode geeft een protocol aan die moet worden uitgevoerd op de weefselcoupe. Na het laden van de glaasjes in het toestel en het plaatsen van de nodige reagentia op het toestel kan de procedure gestart worden via de software die met het toestel verbonden is. De Benchmark XT bestaat uit vier hoofdcomponenten, modules die elk een specifieke taak uitvoeren. De eerste module is de computer met software die verbonden is met het toestel. De staining module is de plaats waar de objectglaasjes bewerkt worden (zie fig. 2.18). De belangrijkste onderdelen van de staining module zijn een reagentia-carrousel, motoren, individuele ThermoPads, een dispensermechanisme, een microcomputer en twee barcodelezers. De reagentia-carrousel heeft plaats voor 35 reagensdispensers (zie fig. 2.17). 29

30 Literatuurstudie Figuur 2.17: Reagens tray met dispensers voor FITC kleuring. De carrousel draait boven de glaasjescarrousel (zie fig. 2.19) die voorzien is van 30 plaatsen en de barcode van de reagentiadispenser geeft aan welk reagens of welk antilichaam er in de dispenser zit. Elke glaasjespositie heeft een ThermoPad die onafhankelijk door software en gebruikersprotocol wordt bestuurd. De ThermoPads bevinden zich onder de glaasjes en worden bestuurd via een in elk ThermoPad ingebed microcircuit. Figuur 2.18: Staining module. Figuur 2.19: Opengetrokken glaasjescarrousel. De luchtcompressor in de automatische fluidica module (ASF) (zie fig. 2.20) voert via plastic slangetjes perslucht en bulkvloeistoffen naar de staining module. De bulkvloeistoffen zijn zes reagentia (Enzym (EZ) Prep, liquid coverslip (LCS), sodium chloride sodium citraat buffer oplossing (SSC), reactie buffer, cel conditioner 1 (CC1) en cel conditioner 2 (CC2)) die steeds op de Benchmark XT aanwezig zijn. 30

31 Literatuurstudie Figuur 2.20: Automatische fluidica module (ASF). Als laatste is er de afval module deze bevat twee 20 liter afvalvaten waarin afvalvloeistoffen terechtkomen via een afvoeraansluiting op de staining module Principe van de FITC kleuring In deze studie is de FITC kleuring gebaseerd op de directe immunofluorescentietechniek. Deze techniek is een éénstapsmethode waarbij men gebruik maakt van een fluorescentgelabeld primair antilichaam, die gaat binden met het weefsel antigeen. Figuur 2.21: Directe immunofluorescentie. 31

32 Literatuurstudie 2.7 De vriesmicrotoom Voor het maken van vriescoupes gebruikt men in het AZ Sint-Jan ziekenhuis te Brugge de cryostaat HM 500-OM van MICROM met een snijtemperatuur tot 40 C. De cryostaat bevat een koelsysteem met temperatuurregeling om de werkruimte met rotatiemicrotoom en meshouder te koelen. Zo kan ook de temperatuur geregeld worden voor het snelvriesstation die zich aan de binnenwand van de werkruimte bevindt. In het snelvriesstation wordt de objecttafel geplaatst met daarop het weefsel en een inbedmiddel die in een minimum van tijd aan elkaar bevriezen. Door het omschakelen op regelkoeling kan zeer snel een gewenste snijtemperatuur bereikt worden en dit is onafhankelijk van de temperatuur van de microtoomkamer op dat moment. De optimale snijtemperatuur is afhankelijk van bepaalde kenmerken van het weefsel. Zo ligt de optimale snijtemperatuur voor nierweefsel tussen -10 tot -20 C. Om de coupes te snijden dient men de gewenste sectiedikte in te stellen op het bedieningspaneel. Vriescoupes worden meestal op 7 tot 8 µm gesneden. Op het mesje is een antirolplaatje voorzien zo gaat de coupe niet meteen oprollen na het snijden. Het antirolplaatje wordt na het snijden omhooggeklapt en het objectglaasje wordt tot tegen de coupe gebracht. De coupe kleeft dan op het objectglaasje. 32

33 Materiaal en methode 3 Materiaal en methode 3.1 Staalcollectie Door een percutane naaldbiopsie verkrijgt men een nierbiopt. De biopsie wordt onder röntgenologische geleiding bij lokale verdoving uitgevoerd. Hierbij wordt een cilinder nierweefsel van 1 à 2 cm lang en 0,2 cm breed weggenomen. De stalen die worden gebruikt voor de immunofluorescentie kleuring zijn stalen met een gekend resultaat. De stalen zijn 07B 3915, 08B 1345, 08B 3740 en 08B Benodigdheden Tabel 3.1: Benodigdheden Benodigdheden Producent Type FITC kleurtoestel Microtoom Vriesmicrotoom Mesjes microtoom Draagglaasjes Dekglaasjes Verwarmplaat Fluorescentiemicroscoop Gaaskompressen Ventana Microm Microm Thermo Electron Corporation Menzel-gläser Menzel-gläser Kunz Instruments ZEISS Hartmann Benchmark XT HM 340E HM 500 Shandon MX 35 Premier + (35 /80 mm) Superfrost plus (25 x 75 x1,0 mm) 100 Deckgläser (24 x 50 mm) HP-3 Axioplan 2 Imaging Sterilux ES ( 7.5 cm x 7.5 cm) 33

34 Materiaal en methode Detergent Aceton PBS VIP Inbedtoestel Bioptie zakjes Oven Xyleen Ethanol Tris-buffer Gebufferde glycerol FITC Anti-Kappa FITC Anti-Lambda FITC Anti-C3 FITC Anti-C1q FITC Anti-IgA FITC Anti-IgG FITC Anti-IgM FITC Anti-Kappa FITC Anti-Lambda FITC Anti-C3 FITC Anti-C1q FITC Anti-IgA FITC Anti-IgG FITC Anti-IgM Baktdin VWR J.T.Baker Tissue -Tek Medite Medizintechnik Bio Optica Elexrolux Fiers Certa DakoCytomation J.T.Baker Ventana Ventana Ventana Ventana Ventana Ventana Ventana DakoCytomation DakoCytomation DakoCytomation DakoCytomation DakoCytomation DakoCytomation DakoCytomation Basic pure 0.05% Sodium zuur, ph 7.2 VIP TBS 88 Paraffin Embedding System Biopsy bags (30 x 45 mm) Ethanol 70%, 94%, 90% en 75% 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl ph 7,6 1ml PBS + 9ml glycerol, ph 7,2 Polyklonale schapen Al Polyklonale schapen Al Polyklonale schapen Al Polyklonale schapen Al Polyklonale schapen Al Polyklonale schapen Al Polyklonale schapen Al Polyklonale konijnen Al Polyklonale konijnen Al Polyklonale konijnen Al Polyklonale konijnen Al Polyklonale konijnen Al Polyklonale konijnen Al Polyklonale konijnen Al 34

35 Materiaal en methode 3.3 Immunofluorescentie op vriescoupes Verwerking vers nierbiopt De verse niercilinder wordt ingevroren en aangesneden met de vriesmicrotoom. Eerst wordt gecontroleerd of er glomeruli aanwezigheid zijn. Dit gebeurt door een hematoxyline - eosine kleuring ( zie tabel 3.2). Bij afwezigheid van glomeruli moet de coupe dieper worden aangesneden. Als er nog steeds geen glomeruli aanwezig zijn na het dieper aansnijden dan wordt de procedure stopgezet. Bij aanwezigheid van glomeruli worden zeven vriescoupes gesneden voor de immunofluorescentie kleuringen. Bij de fluorescentie kleuring wordt gebruik gemaakt van FITC gelabelde antilichamen gericht tegen respectievelijk C1q, C3, IgA, IgG, IgM, kappa en lambda (zie tabel 3.1). Voor elk van deze antilichamen is één vriescoupe voorzien. Na een korte voorbehandeling volgt de immunofluorescentie kleuring. Aflezen en interpretatie van de kleuring gebeurt door de patholoog. 35

36 Materiaal en methode Tabel 3.2: Heamatoxyline-eosine kleuring op vriescoupes. Reagens Fixeren in methanol Water Kleuren in heamatoxyline Water Dompelen in verdund HCl Water Dompelen in LiCO 3 Water Kleuren met eosine Methanol Methanol Xyleen Xyleen Tijd 5 seconden Spoelen 15 seconden Spoelen 1 seconde Spoelen 2 seconden Spoelen 10 seconden Spoelen Spoelen Spoelen Spoelen Procedure FITC kleuring Manuele FITC kleuring A. Voorbereiding Snijden van 8 vriescoupes waaronder één coupe zal gebruikt worden als negatieve controle. De coupes 10 minuten laten fixeren in aceton bij 4 C en daarna wassen in PBS bij 4 C. Als voorbereiding worden de verdunningen van de antilichamen aangemaakt in PBS met 100 µl Human albumine (zie tabel 3.3). Bij de manuele methode wordt gewerkt met FITCgeconjugeerde konijnen antilichamen gericht tegen humane antilichamen. 36

37 Materiaal en methode Tabel 3.3: Verdunningen van de DakoCytomation primair FITC gelabelde antilichamen. Primaire antilichamen Anti-Kappa Anti-Lambda Anti-IgA Anti-IgM Anti-IgG Anti-C3 Anti-C1q Verdunning 1/10 1/20 1/20 1/20 1/10 1/20 1/20 B. FITC kleuring De verdunningen van de antilichamen worden aangebracht op de draagglaasjes met daarop de coupe van de niercilinder. De antilichamen moeten 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Na 20 minuten wordt met behulp van een spuitfles gevuld met PBS de overtollige antilichamen afgespoeld. Het wassen van de coupes gebeurt twee maal in PBS voor 10 minuten bij 4 C. De laatste stap is het monteren met ge bufferde glycerol. Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA BenchMark XT A. Voorbereiding De net gesneden coupes met de cryostaat 10 minuten laten fixeren in aceton bij 4 C en de coupes 15 minuten laten drogen aan de lucht. Opnieuw 10 minuten fixeren in aceton bij 4 C en daarna 10 minuten laten drogen aan de lu cht. De barcodes kunnen nu op de draagglaasjes worden aangebracht. De coupes moeten nu eerst rehydrateren voor 5 minuten in AD. Na het rehydrateren de glaasjes enkele minuten in de VENTANA reaction buffer plaatsen. 37

38 Materiaal en methode De draagglaasjes met daar op de coupes van het nierweefsel worden in het toestel geladen. Op de reagenscarrousel zijn de reagensdispensers aanwezig die de nodige antilichamen bevatten voor de FITC kleuring. Het toestel wordt door de bijhorende software en computer gestart. De 5 ml dispensers met de primair FITC gelabelde antilichamen zijn goed voor 50 tests. B. FITC kleuring Bij de eerste stap van de directe IF kleuring worden de glaasjes opgewarmd tot 37 C. Tussen iedere stap wordt er gespoeld met reaction buffer, een op TRIS gebaseerde buffer ph 7,6. Na het spoelen wordt één druppel van het fluorescente antilichaam toegevoegd en ook een laagje LCS (liquid coverslip). De incubatie tijd is afhankelijk van het soort antilichaam (zie tabel 3.4). LCS zorgt er voor dat er geen verdamping van het antilichaam gebeurt en creëert een stabiele, waterige omgeving rond de coupe. Tabel 3.4: Aangepaste Incubatietijden van de verschillende VENTANA FITC gelabelde primaire antilichamen. Primaire Antilichamen Anti-C1q Anti-C3 Anti-IgA Anti-IgG Anti-IgM Anti-Kappa Anti-lambda Incubatie tijd 16 minuten 16 minuten 16 minuten 2 minuten 16 minuten 12 minuten 12 minuten Na de kleuring geeft het toestel een signaal. De draagglaasjes worden uit het toestel gehaald en in warm water met detergent geplaatst. Het laagje LCS wordt zo weggewassen. Nu wordt nog twee maal met PBS gewassen bij 4 C voo r 10 minuten. De laatste stap is het monteren en dit gebeurt met gebufferde glycerol. De laatste 2 stappen gebeuren in een donkere ruimte om de fluorescente kleur te behouden. 38

39 Materiaal en methode Tabel 3.5: Producten gebruikt bij FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT op vriescoupes. Product Lotnummer Referentienummer Houdbaarheid LCS H Reaction buffer H Anti-C1q Anti-C Anti-IgA Anti-IgG Anti-IgM Anti-kappa Anti-lambda Immunofluorescentie op paraffinecoupes Verwerking gefixeerd nierbiopt Een verse niercilinder wordt ontvangen in gebufferde formol 4%. Op het aanvraagformulier worden alle afmetingen en gegevens genoteerd. Daarna wordt de niercilinder overgebracht in een biopsie zakje dat dan in een roze cassette wordt gestoken. Daarna wordt de cassette in het Tissue Tek VIP toestel gebracht voor verdere verwerking. Het biopt wordt ingebed in de paraffine en gesneden met de microtoom op 2µm. A. Doorvoeren van de niercilinder Om de niercilinder te kunnen aansnijden moet deze nog een gans proces doorlopen. Dit proces wordt het doorvoeren genoemd. Tijdens het proces wordt het water uit het weefsel vervangen door paraffine. Paraffine is niet mengbaar met het water in het weefsel zo zijn enkele bewerkingen nodig. 39

40 Materiaal en methode Het doorvoeren gebeurt automatisch met de Tissue Tek VIP. Dit toestel zorgt ervoor dat het doorvoeren snel en efficiënt gebeurt. De eerste stap is de fixatie. De cilinder wordt gefixeerd in gebufferde formol 4%. Door het weefsel te gaan fixeren worden alle dynamische processen stil gelegd in de cel. Zo kan de oorspronkelijke structuur behouden worden. Een volgende stap is de dehydratatie. Het watervrij maken van het weefsel gebeurt met behulp van een alcoholreeks. Het weefsel wordt ondergedompeld in vier opeenvolgende baden van methanol. Nu is het water vervangen door methanol, maar paraffine is ook niet oplosbaar in methanol. Dus men moet een solvent toevoegen dat mengbaar is met alcohol en paraffine. Men gebruikt hiervoor xyleen dit is de clarificatie stap. De laatste stap in het doorvoeren is de infiltratie. De xyleen moet uit het weefsel en het weefsel wordt doordrongen met vloeibare paraffine. B. Inbedden De niercilinder wordt nu in vloeibare paraffine gelegd en op de koude plaat van het inbedtoestel geplaatst waar het gaat stollen. Na het verwijder van het inbedplaatje bekom je een paraffineblokje waarvan men gemakkelijk coupes kan snijden. C. Snijden De te onderzoeken niercilinder zit ingebed in paraffine. Nu kunnen van de paraffineblok dunne coupes worden gesneden. Voor nierweefsel wordt gesneden op 2µm. Het snijden van de coupes gebeurt op een rotatiemicrotoom ( Het mes staat vast en het paraffineblokje beweegt op en neer). De coupe wordt overgebracht op een positief geladen draagglaasje met daarop een laagje gedemineraliseerd water. De draagglaasjes zijn positief geladen dit trekt de negatieve ionen in het weefsel aan. Na het afgieten van het water moet de coupe nog minimum één uur drogen op de verwarmplaat bij 41 C. 40

41 Materiaal en methode Procedure FITC kleuring Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA BenchMark XT methode 1 A. Voorbereiding De draagglaasjes met daarop de coupes worden eerst voorzien van een barcode. De eerste stap is het deparaffineren van de coupes in de oven gedurende 10 minuten. Eenmaal uit de oven worden de coupes in 3 baden xyleen onderdompeld en 3 baden solaetyl. Spoelen gebeurt onder stromend water waarna ze in de reactie buffer worden geplaatst voor enkele minuten en vervolgens op het toestel worden geladen. B. FITC kleuring De Procedure voor de FITC kleuring op paraffinecoupes is idem als die op de vriescoupes (zie p33-34). Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA BenchMark XT methode 2 A. Voorbereiding De draagglaasjes met daarop de coupes worden eerst voorzien van een barcode. De eerste stap is het deparaffineren van de coupes in de oven gedurende 10 minuten. De paraffine wordt verwijderd door de coupes twee maal onder te dompelen in xyleen voor telkens vijf minuten. Daarna doorlopen de coupes een alcoholreeks van 4 baden voor telkens vijf minuten. Alcoholreeks: 100 % alcohol, 94 % alcohol, 90% alcohol en 75 % alcohol. Na de alcoholreeks worden de coupes vlug gewassen in A.D. en gewassen in Tris-buffer gedurende 30 minuten bij 37 C in een warmwaterbad. Het enzym pronase wordt nu toegevoegd en moet incuberen voor één uur bij 37 C. De enzymatische werking wordt daarna stopgezet door de coupes onder te dompelen in Tris-buffer voor één uur bij 4 C waarna ze gewassen worden in PBS voor 10 minuten bij 4 C. Het weefsel is hersteld en kan nu gaan binden met de FITC gelabelde antilichamen. 41

42 Materiaal en methode De draagglaasjes met daar op de coupes van het nierweefsel worden in het toestel geladen. Op de reagenscarrousel zijn de reagensdispensers aanwezig die de nodige antilichamen bevatten voor de FITC kleuring. Het toestel wordt door de bijhorende software en computer gestart. Enkel het aantal glaasjes aanwezig in het toestel moeten ingegeven worden. B. FITC kleuring De Procedure voor de FITC kleuring op paraffinecoupes is idem als die op de vriescoupes (zie p33-34). Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA BenchMark XT methode 3 A. Voorbereiding De draagglaasjes met daar op de coupes worden eerst voorzien van een barcode en worden daarna geladen in het toestel. Op de reagenscarrousel zijn de reagensdispensers aanwezig die nodig zijn voor het geselecteerde protocol op paraffinecoupes. De antilichamen worden doormiddel van een titratie aangebracht op de coupes. B. FITC kleuring De eerste stap is het deparafineren van de coupes, hiervoor wordt de EZ Prep, een deparafinerende oplossing gebruikt. De glaasjes worden opgewarmd tot 75 C voor vier minuten. Het spoelen van de glaasjes gebeurt na elke stap en LCS wordt toegevoegd om uitdroging van het weefsel tegen te gaan. Opeenvolgend worden volgende reagentia toegevoegd: - Cell Conditioner - 1 druppel I-Vieuw Inhibitor - 1 druppel Protease 1 - Handmatige toediening van 1 druppel van het fluorochroom gelabeld antilichaam - 1 druppel I-Vieuw Biotin Ig - 1 druppel I-Vieuw SA-HRP (Streptavidine- Horseradisch Peroxidase) 42

43 Materiaal en methode - 1 druppel I-Vieuw DAB + 1 druppel I-Vieuw H 2 O 2 (Substraat) - 1 druppel I-Vieuw Copper Na de kleuring wordt dezelfde procedure uitgevoerd als voor vriescoupes (zie p34). Tabel 3.6: Producten gebruikt bij FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT op paraffinecoupes. Product Lotnummer Referentienummer Houdbaarheid EZ Prep H IVieuw Inhibitor ID IVieuw Biotinyladed Ig BD IVieuw Avidin HRPO SD IVieuw DAB DD IVieuw H 2O HD IVieuw Copper CD Cell Conditioner H / Beoordeling van de preparaten De beoordeling van de fluorescent gekleurde preparaten gebeurt met de fluorescentiemicroscoop door de patholoog. De patholoog geeft een beoordeling van 1+ tot 4+ naar gelang de kleurintensiteit van de deposities. 43

44 Resultaten 4 Resultaten Om enerzijds het verschil tussen de immunofluorescentie van paraffinecoupes en vriescoupes te gaan vergelijken en anderzijds het verschil tussen de manuele en geautomatiseerde methode wordt gebruik gemaakt van stalen met een gekend resultaat voor immunofluorescentie. Staal: 07B 3915 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: IgA nefropathie. IgA IgG IgM C3 C1q Kappa/Lambda Oplichtende cilinders in de tubuli Negatief Oplichtende cilinders in de tubuli Vas afferens vertoont een granulaire oplichting Negatief Polyklonale oplichting in de tubuli B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: IgA Granulaire neerslag 1+ IgG Niet te beoordelen IgM Granulaire neerslag 1+ C3 Granulaire neerslag t.h.v. capillaire wand 1+ C1q Niet te beoordelen Kappa/Lambda Niet te beoordelen C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes met de VENTANA Benchmark XT: De IF kleuring kan niet beoordeeld worden omwille van teveel achtergrondkleuring. De incubatietijden moeten nog worden aangepast. 44

45 Resultaten D. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: De IF kleuring kan niet beoordeeld worden omwille van teveel achtergrondkleuring. Figuur 4.1: Depositie van IgA. Staal: 08B 1345 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: Diffuse glomerulonefritis met tekens van focale sclerose. IgA Granulaire neerslag t.h.v. mesangium 2+ en capillaire wand 1+ IgG Negatief IgM Discrete mesangiale granulaire neerslag 1+ C3 Granulaire neerslag t.h.v. glomeruli en capillaire wand 2+ C1q Negatief Kappa/Lambda Negatief 45

46 Resultaten B. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes met de VENTANA Benchmark XT: IgA Granulaire neerslag 1+ IgG Niet te beoordelen IgM Granulaire neerslag 1+ C3 Granulaire neerslag 2+ C1q Negatief Kappa/Lambda Negatief C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1 en 2: De IF kleuring kan niet beoordeeld worden omwille van teveel achtergrondkleuring. Figuur 4.2: Depositie van C3. 46

47 Resultaten Staal: 08B 3740 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: Lupusnefritis klasse III tot IV (A/C). IgA IgG IgM C3 C1q Kappa/Lambda Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Polyklonale neerslag B. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes met de VENTANA Benchmark XT: Met aangepaste incubatietijden (zie tabel 3.4). IgA Granulaire neerslag 2+ IgG Niet te beoordelen IgM Granulaire neerslag 2+ C3 Granulaire neerslag 2+ C1q Granulaire neerslag 2+ Kappa/Lambda Polyklonale neerslag 1+ C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: De IF kleuring kan niet beoordeeld worden omwille van teveel achtergrondkleuring. 47

48 Resultaten Figuur 4.3: Depositie van IgM. Staal: 08B 4258 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: Gekende SLE klasse IIIC. IgA IgG IgM C3 C1q Kappa/Lambda Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand Polyklonale neerslag B. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes met de VENTANA Benchmark XT: Met aangepaste incubatietijden (zie tabel 3.4). IgA Granulaire neerslag 2+ IgG Niet te beoordelen IgM Granulaire neerslag 2+ C3 Granulaire neerslag 2+ C1q Granulaire neerslag 2+ Kappa/Lambda Polyklonale neerslag 2+ 48

49 Resultaten C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: De IF kleuring kan niet beoordeeld worden omwille van teveel achtergrondkleuring. Figuur 4.4: Depositie van C1q. 49

50 Discussie 5 Discussie Om de manuele handelingen voor het bekomen van de juiste weefselkleuringen te optimaliseren en voor een groot deel te automatiseren, werden een aantal methoden toegepast. Hierbij was het resultaat van de ene methode al veel doeltreffender dan het resultaat van de andere. De kleuring die bekomen wordt op vriescoupes, na aanpassing van de incubatietijden van de primair fluorescent gelabelde antilichamen, vertoonde het beste resultaat. Op deze coupes kan men waarnemen dat alle deposities in de glomeruli en de bloedvaten juist aangekleurd werden en dat er geen achtergrondkleuring te bespeuren is. Bij het uitvoeren van de manuele immunofluorescentie kleuring op vriescoupes wordt gebruik gemaakt van polyklonaal FITC - gelabelde konijnen antilichamen. Bij het uitvoeren van de geautomatiseerde immunofluorescentie kleuring op vriescoupes wordt gebruik gemaakt van de VENTANA polyklonaal FITC gelabelde schapen antilichamen. Door het gebruik van de FITC gelabelde antilichamen elk van een verschillende product kan er al een verschil in de kleuring optreden. Ook ga je bij de manuele methode de antilichamen gaan verdunnen wat ook een verschil kan geven. Bij de VENTANA FITC gelabelde antilichamen kan enkel de incubatietijd worden aangepast werken met verdunningen gaat niet. Zeer grote verschillen tussen de manuele en de geautomatiseerde directe immunofluorescentie methode voor vriescoupes zijn er niet. Enkel het toevoegen van de fluorescent gelabelde antilichamen gebeurt anders. Het automatiseren van de methode past beter in de huidig trend van automatisatie, standaardisatie en accreditering. De kleuring van de paraffinecoupes geeft in tegenstelling tot de methode van de vriescoupes een minder goed resultaat. Ongeacht de verschillende gebruikte methodes bij de immunofluorescentie kleuring van deze paraffinecoupes werd het geteste weefsel volledig overkleurd of helemaal niet. 50