Moleculaire pathologie: kruispunt van morfologie, biochemie en genetica

Transcriptie

1 Capita selecta Moleculaire pathologie: kruispunt van morfologie, biochemie en genetica f.t.bosman Het is opmerkelijk dat de methoden die door Rudolph Virchow 150 jaar geleden werden gebruikt om de conceptuele basis van de pathologie, de cel als zetel en spiegel van ziekte, te ontwikkelen en met waarnemingen te staven, nog steeds de belangrijkste basis vormen van de pathologie anno Zien is weten. Het herkennen van de normale structuur van cellen en weefsels en het kunnen onderkennen van de veranderingen in die cellen en weefsels in geval van ziekte, zijn nog steeds de uitgangspunten voor pathologische diagnostiek. Dat herkennen is vooral een kwestie van patroonherkenning, te vergelijken met de klinische blik in de praktische geneeskunde. Zoals tegenwoordig minder op de klinische blik wordt gevaren, zo wordt ook in de pathologie een diagnose minder gesteld op basis van het beeld, maar meer op grond van scherp omschreven criteria. Bij die criteria wordt in toenemende mate gebruikgemaakt van moleculaire analysen van cellen en weefsels. In dit artikel bespreek ik deze ontwikkeling in vogelvlucht, waarbij aan de orde komen enkele aspecten van de methoden, strategieën voor het ontwikkelen van nieuwe moleculaire variabelen voor pathologische diagnostiek, toepassingen en de toekomst. Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Institut Universitiare de Pathologie, Rue du Bugnon 25, CH-1011 Lausanne, Zwitserland. Prof.dr.F.T.Bosman, patholoog ( samenvatting Moleculaire analyse van cel- en weefselmonsters, als aanvulling op klassiek morfologisch onderzoek, speelt een belangrijke rol in de klinische pathologie. Dat geldt zonder enige reserve voor immunohistochemie, die uit de klinische pathologie niet meer weg te denken is. Pas onlangs is de moleculair-genetische analyse in het pathologisch laboratorium geïntroduceerd en vooral in de diagnostiek van kanker mag verwacht worden dat deze techniek een belangrijke rol zal spelen. Voor hemato-oncologische maligniteiten en wekedelensarcomen is dat reeds het geval. Geavanceerde geautomatiseerde analyse met behulp van DNA- arrays zal moleculaire tumoranalyse in een stroomversnelling brengen. Morfologische uitgangspunten zullen nog geruime tijd de basis blijven voor tumorclassificatie, maar op termijn niet zonder belangrijke steun van de moleculaire analyse. nieuwe methoden in de pathologie Met de introductie van moleculaire technieken in de pathologie is het vak principieel van karakter veranderd. Sedert het ontstaan van de pathologie als discipline is morfologische waarneming steeds de basis geweest voor de diagnostiek. Veel van de moleculaire technieken stoelen echter niet op morfologische basis. Daarmee lijkt de patholoog zijn oorspronkelijke handwerk, macro- en microscopische herkenning van pathologische weefselveranderingen, voor een deel te moeten verlaten. Moleculaire analyse op cel- of weefselniveau, de combinatie van morfologie en moleculaire analyse in het microscopische preparaat, bekend als histochemie, slaat de brug tussen morfologie en moleculaire biologie. Histochemische analyse. Het belang van moleculaire analyse van cel- en weefselmonsters in de diagnostische pathologie is al eens eerder in dit tijdschrift uiteengezet. 1 Uitgangspunt van deze technieken is het gebruik van een snuffelmolecuul, in de wandeling een probe genoemd, voor de specifieke detectie van een macromolecuul in het cel- of weefselmonster. De probe kan een immunoglobuline zijn, dat specifiek met een eiwit, hapteen of nucleïnezuur in het weefsel van de coupe reageert, en dat een zodanige markering heeft dat deze microscopisch zichtbaar kan worden gemaakt. Deze immunohistochemie is nu zo n 50 jaar oud, heeft in de diagnostische pathologie een hoge vlucht genomen en is ook toepasbaar voor de analyse van sommige genafwijkingen. Een typisch voorbeeld hiervan is het tumorsuppressoreiwit p53. In een normale cel wordt dit eiwit snel afgebroken. Bij een gemuteerd p53-gen wordt het eiwit niet normaal afgebroken, maar hoopt het zich op in de cel en kan immunohistochemisch worden aangetoond. De aanwezigheid van abnormaal p53 kan een relevant diagnostisch criterium zijn voor sommige gezwelsoorten. 2 Van deze techniek wordt in de diagnostische pathologie veel gebruikgemaakt (figuur 1). Een andere mogelijkheid doet zich voor bij amplificatie van een oncogen, zoals het c-erb-2-gen in borstkanker. Amplificatie van dit gen leidt tot abnormaal hoge eiwitproductie, opnieuw zichtbaar te maken via een immunohistochemische methode. Het omgekeerde is het geval bij puntmutaties in het APC-gen, die verantwoordelijk zijn voor familiaire adenomateuze polyposis coli. Deze puntmutaties blijken nagenoeg zonder uitzondering te leiden tot een abnormaal kort eiwit, dat met een anti-apc-antilichaam juist niet kan worden aangetoond. Hier is afwezigheid van het histochemische reactieproduct dus een aanwijzing voor een mutatie in het gen. De probe kan ook een nucleïnezuurfragment zijn (zowel RNA- als DNA-fragmenten zijn bruikbaar). Deze nucleïnezuurprobes hybridiseren met hun complementaire nucleïnezuurstreng in de coupe en de reactie van een specifieke probe met een cel- of weefselmonster betekent dus dat de gezochte specifieke DNA- of RNAsequentie in het monster aanwezig is. De probe wordt weer gemerkt met een fluorescerende of enzymatische marker die microscopisch kan worden zichtbaar gemaakt. 3 Deze zogenaamde in-situhybridisatiereactie, die het frequentst met een fluorescerende marker wordt uit- Ned Tijdschr Geneeskd november;143(45) 2269

2 menigvuldigd, om daarna onder meer via gelelektroforese, hybridisatiereacties of bepaling van de basenvolgorde, op specifieke eigenschappen te worden geanalyseerd. Voor deze techniek wordt het nucleïnezuur uit het monster geëxtraheerd. De morfologische eigenschappen gaan daarmee dus verloren en dat is een relatief nadeel van de techniek. Microdissectie, al dan niet met speciaal hiervoor ontwikkelde lasermicroscopen, maakt het mogelijk enkele cellen uit een weefselcoupe te isoleren. Betrouwbare amplificatie van nucleïnezuren uit één enkele cel via PCR is goed mogelijk. Aldus kan van morfologische gedefinieerde celmonsters vervolgens specifieke moleculair-genetische informatie worden verkregen. DNA- array -techniek. Voordeel van op PCR gebaseerde moleculair-genetische analyse is dat deze techniek goed is te automatiseren en dan grootschalig kan worden uitgevoerd. Op dit punt is sprake van een explosieve ontwikkeling. Een zogenaamde DNA- array (ook wel chip genoemd) is een glasdrager waarop duizenden microscopisch kleine vlekjes nucleïnezuurfragmenten figuur 1. Immunohistochemische detectie van het p53-eiwit in een adenocarcinoom in een Barrett-oesofagus: de donkergekleurde kernen bevatten het (gemuteerde) p53 (225 maal vergroot). gevoerd en bekend is als de fluorescentie-in-situhybridisatie, kortweg FISH, heeft in de genetische analyse een grote vlucht genomen. Er zijn probes beschikbaar die specifiek reageren met één chromosoomtype of met één gensequentie. Hiermee kunnen chromosomale afwijkingen worden gevisualiseerd in niet-delende interfasecellen (figuur 2) of kunnen op chromosomaal niveau genen worden gelokaliseerd. De techniek kan eveneens worden gebruikt voor de analyse van de expressie van mrna op celniveau. Groot voordeel van deze histochemische technieken is de mogelijkheid moleculaire informatie te combineren met morfologische: de weefselcoupe of het celuitstrijkpreparaat blijft namelijk microscopisch beoordeelbaar. Nadeel is de complexiteit van de techniek; ze is tijdrovend en niet gemakkelijk te automatiseren. Voor grootschalige toepassing is deze techniek, althans in de dagelijkse pathologische diagnostiek, dan ook minder geschikt. Moleculair-genetische analyse. De introductie van de polymerasekettingreactie (PCR) heeft moleculair-genetische analyse bereikbaar gemaakt voor de dagelijkse pathologische diagnostiek. Met deze techniek kunnen uiterst geringe hoeveelheden DNA of RNA worden ver- figuur 2. Visualisering van chromosomen in interfasekernen in een feochromocytoom. Gebruik van een voor chromosoom 7 specifieke probe en een peroxidasetechniek resulteert in donkere puntjes in de celkernen, één per chromosoom. Het merendeel van de kernen heeft meer dan 2 puntjes, hetgeen wijst op aneuploïdie (360 maal vergroot; foto afkomstig van dr. H.van Dekken, Erasmus Universiteit, Rotterdam) Ned Tijdschr Geneeskd november;143(45)

3 met een bekende basenvolgorde zijn aangebracht, op bekende coördinaten. Via PCR geamplificeerd en fluorescerend gemaakt DNA of RNA uit een pathologisch cel- of weefselmonster kan men op zo n DNA-chip brengen, waarna specifieke hybridisatie plaatsvindt; de chip kan automatisch op fluorescentie worden afgelezen, waardoor met één test afwijkingen in of de expressie van duizenden genen in kaart kunnen worden gebracht. 4 5 kern cel tumorcel FasL Fas Bax caspaseactivering + - kerndesintigratie celmembraan death domain FADD FLICE FLIP bcl-2 figuur 3. Schema van de cascade die tot apoptose leidt: Fasligans (FasL; bijvoorbeeld op een tumorcel) bindt aan de Fasreceptor (CD95) op bijvoorbeeld een lymfocyt die in de tumor infiltreert. De Fas-receptor is een transmembraanreceptor waarvan het cytoplasmatische deel (zogenaamd death domain ) wordt geactiveerd na binding met een FasL. Dit activeert achtereenvolgens de eiwitten Fas-associated death domain (FADD)-proteïne, Fas-associated death-domain-like - interleukine-1β-converterend enzym (FLICE) en FLICE-inhiberend proteïne (FLIP), waardoor een groep intracellulaire proteasen, de zogenaamde caspasen, wordt geactiveerd. Het effect hiervan wordt gemoduleerd door het stimulerend-blokkerend evenwicht tussen respectievelijk het Bax-eiwit en het bcl-2-eiwit. Uiteindelijk zijn kerndesintegratie en apoptose van de cel het gevolg. nieuwe diagnostische strategieën Voor de ontwikkeling van in de diagnostiek bruikbare moleculaire criteria wordt meestal gebruikgemaakt van de kennis van biologische regelmechanismen. Ter illustratie geef ik een voorbeeld uit het domein van de pathologie van kanker. Apoptose. De laatste jaren is bekend geworden dat gezwelgroei niet alleen het gevolg is van ongeremde celgroei, maar ook van verminderde fysiologische celdood (apoptose). Onderzoek naar mechanismen van regulatie van apoptose neemt dan ook in fundamenteel kankeronderzoek een belangrijke plaats in en heeft in recente jaren geleid tot het ontrafelen van een aantal cruciale regelmechanismen. Hiervan is de Fas-ligans-receptorcascade, betrokken bij de inductie van apoptose, een fraai voorbeeld (figuur 3). Moleculaire onderdelen van de cascade kunnen immunohistochemisch of met behulp van moleculair-biologische technieken worden aangetoond. Zo is gebleken dat de expressie van Fas-ligans op melanoomcellen een apoptosereactie teweegbrengt in tumorinfiltrerende lymfocyten die de Fas-receptor op hun oppervlak tot expressie brengen; een reactie die leidt tot de destructie van de lymfocyt. De tumorcel is zo in staat de immuunrespons van de gastheer uit te schakelen. 6 Fas-receptor- en Fas-ligansexpressie zijn ook als prognostische graadmeters onderzocht en voor sommige tumoren blijkt de expressie te correleren met bekende prognostische factoren. 7 Het bcl-2-eiwit is een belangrijke remmende regulator van apoptose (zie figuur 3). Overexpressie van het bcl-2-gen is een belangrijk pathogenetisch mechanisme bij de ontwikkeling van sommige maligne lymfomen. Voor veel tumoren is inmiddels de eventuele correlatie van bcl-2-expressie met prognose onderzocht. Voor sommige tumoren is bcl-2- expressie een onafhankelijke prognostische variabele. 8 Voor klinische onderzoeken naar de betekenis van apoptose voor tumorgedrag kan overigens van de mogelijkheid gebruikgemaakt worden apoptose op weefselniveau zichtbaar te maken (figuur 4). Dergelijk onderzoek heeft aangetoond dat in sommige tumoren verminderde apoptotische celactiviteit een onafhankelijke en ongunstige prognostische graadmeter is. 9 Met de ontwikkeling van de DNA-array, die grootschalige analyse van genetische afwijkingen en genexpressie van tumorcellen mogelijk maakt, is er een neiging om, buiten de bekende regelmechanismen om, min of meer willekeurig te zoeken naar correlaties tussen genafwijkingen of -expressiepatronen en tumorclassificatie of -gedrag. Gegeven de beperkte beschikbaarheid van deze techniek staat deze ontwikkeling nog in de kinderschoenen. De voortgang van het humaangenoomproject (waarbij men verwacht dat in 2003 het gehele humane genoom gedecodeerd zal zijn) en de snelle vooruitgang van deze techniek rechtvaardigen echter de verwachting dat dergelijke grootschalige moleculaire analyse in de komende jaren tot nieuwe vondsten en inzichten zal leiden. toepassingen van de nieuwe techniek De toepassingen van moleculaire analyse in de histo- en cytopathologische diagnostiek zijn talloos. Ik beperk mij hier tot de tumorpathologie, waar moleculaire analyse tamelijk gemeengoed is geworden. Moleculaire analyse wordt vrij veel gebruikt om vast te stellen van wie een weefselmonster afkomstig was (in geval van verwisseling bijvoorbeeld). In toenemende mate wordt de methode gebruikt voor het beantwoorden van de vraag of er sprake is van een tumoreuze nieuwvorming of niet, voor de classificatie van tumoren, voor het vaststellen van de uitbreiding van de ziekte en voor het voorspellen van het gedrag van de ziekte. Van deze toepassingen volgen nu enkele voorbeelden. Is er sprake van een kwaadaardig gezwel? Sommige ruimte-innemende afwijkingen zijn volstrekt goedaar- Ned Tijdschr Geneeskd november;143(45) 2271

4 figuur 4. Visualisering van apoptotische celkernen in een coupe van een coloncarcinoom via de zogenaamde TUNEL-techniek (van terminal deoxynucleotidyl-nick-end labeling ), die berust op voor apoptose karakteristieke fragmentatie van DNA. Er zijn twee ongekleurde tumorvelden waarneembaar; de donkere kernen zijn in apoptose (225 maal vergroot). dig, hebben een spontane regressieneiging en zijn hoogst waarschijnlijk reactief, maar kunnen niettemin histologisch verontrustende kenmerken vertonen. Voorbeelden hiervan zijn reactieve lymfklierhyperplasieën of pseudolymfomen, en inflammatoire pseudosarcomen van de weke delen. Ook kan de vraag rijzen of een tumor nog goedaardig is dan wel al maligne progressie vertoont, zoals bij een colorectumadenoom. Dan kan moleculaire analyse belangrijke aanvullende criteria verschaffen. Uitgangspunt voor moleculaire analyse vormen drie eigenschappen van nagenoeg alle tumorcellen: ze zijn monoklonaal, ze hebben een onbeperkte levensduur en ze vertonen min of meer kenmerkende afwijkingen in hun genoom. Klonaliteitsanalyse. Klonaliteitsanalyse wordt het meest toegepast bij de diagnostiek van maligne lymfomen. De eenvoudigste aanpak is (althans voor B-cellymfomen) het immunohistochemisch onderzoek van de expressie van de lichte keten van immunoglobuline: in een (monoklonaal) lymfoom wordt namelijk slechts één lichte keten gemaakt. Deze techniek is ten dele te vervangen door moleculaire analyse. Men bestudeert hiervoor de genherschikking in het variabele deel van het voor de lichte ketens coderende gen. Wordt er in dit onderzoek één genfragment gevonden (één bandje in het elektroforetisch gescheiden PCR-product), dan duidt dit op monoklonaliteit. Dezelfde techniek wordt gebruikt voor T-celproliferaties, maar nu met als doelwitgen de T-celreceptor. Ig- en T-celreceptoranalyse behoren tot de frequentste bepalingen in moleculair-pathologische laboratoria. Inmiddels zijn ook voor andere tumoren markergenen voor klonaliteitsonderzoek beschikbaar Ondanks de grote waarde van de techniek is inmiddels gebleken dat ze niet geheel onfeilbaar is: de regel dat tumoren monoklonaal zijn, blijkt minder universeel dan verwacht. Monoklonaliteit kan dus zeker niet als enig criterium voor maligniteit worden gebruikt. Onbeperkte levensduur van de tumorcel. De laatste jaren is bekend geworden dat voor de beperkte levensduur van normale somatische cellen het verlies van de chromosomale uiteinden, de telomeren, verantwoordelijk is. Bij de DNA-replicatie in de S-fase van de celcyclus wordt steeds een stukje van het telomeer-dna niet gekopieerd. Dit verlies is functioneel niet ernstig omdat het niet-coderende repetitieve sequenties betreft. Teveel telomeerverlies leidt echter tot problemen bij de celdeling en normale cellen verliezen dan ook na zo n 70 delingen hun replicatievermogen. Stamcellen (zoals in het beenmerg en in de testes) hebben een enzym, telomerase, dat de telomeerlengte herstelt. Gebleken is nu dat de meeste maligne tumorcellen activatie van dit telomerase vertonen. 12 Telomeraseactiviteittests hebben laten zien dat in normale somatische cellen telomerase niet actief is. In nagenoeg alle maligne tumoren is de uitslag van de telomeraseactiviteittest echter positief. Deze techniek is niet alleen toepasbaar bij problemen in de histologische diagnostiek, maar ook als screeningstest, bijvoorbeeld voor het opsporen van maligne cellen in lichaamsvochten. Ook deze techniek is echter niet onfeilbaar: sommige prolifererende niet-maligne cellen vertonen ook telomeraseactivatie en er zijn ook maligne tumoren gevonden (vooral sarcomen) waarin telomerase niet is geactiveerd. Accumulatie van genoomafwijkingen. Het klassieke voorbeeld van de accumulatie van afwijkingen in het genoom is de adenoom-carcinoomsequentie in het colon. 13 Progressie van adenoom naar carcinoom vindt stapsgewijs plaats, waarbij elke nieuwe stap het gevolg is van de introductie van een nieuwe genetische afwijking (figuur 5). Analyse van de betrokken genen kan in theorie een hulpmiddel zijn voor het geven van een antwoord op de vraag: gaat het bij de aangetroffen afwijking om autonome neoplasie of niet? De histologische diagnostiek van colontumoren is zo betrouwbaar dat moleculaire analyse daaraan weinig bijdraagt. Voor de diagnostiek van bijvoorbeeld pancreastumoren kan echter het vaststellen van afwijkingen in het p53-tumorsuppressorgen, via moleculaire analyse of via immunohistochemisch onderzoek, van betekenis zijn. 14 Moleculaire tumorclassificatie. Het reeds geschetste principe dat tumorcellen worden gekenmerkt door de accumulatie van (min of meer) specifieke afwijkingen in hun genoom heeft geleid tot hoge verwachtingen ten aanzien van de potentiële rol van moleculair-genetische tumorcelanalyse in de classificatie van tumoren. Op grote schaal wordt momenteel het genoom van allerlei tumoren in kaart gebracht. Gebleken is reeds dat sommige tumoren zeer karakteristieke genetische afwijkingen vertonen die voor de classificatie uitermate bruikbaar 2272 Ned Tijdschr Geneeskd november;143(45)

5 K-ras p16 APC telomerase p53 DCC SMAD4 normale mucosa aberrante cryptefocus laaggradig adenoom hooggradig adenoom carcinoom metastase hmlh1 hmsh2 hmsh6 hpms1 hpms2 figuur 5. Het zogenaamde Vogelstein-model van de moleculaire genese van colorectumcarcinoom. 13 De morfologisch gedefiniëerde stappen gaan gepaard met accumulatie van kenmerkende afwijkingen in het genoom; (+) activatie van oncogenen; ( ) inactivatie van tumorsuppressorgenen. De onder in de figuur opgesomde genen zijn alle betrokken bij DNA-herstel in alle morfologische fasen. kunnen zijn. Sommige lymfomen en leukemieën worden bijvoorbeeld gekenmerkt door specifieke chromosomale translocaties (tabel 1). In de hemato-oncologische diagnostiek is chromosomaal onderzoek dan ook reeds lang gemeengoed en sinds kort ook moleculair-genetisch onderzoek. 15 Een tweede treffende voorbeeld wordt gevonden in de categorie mesenchymale tumoren. 16 Ook hier zijn translocaties gevonden die zo specifiek zijn dat de tumor bijna op grond daarvan kan worden geclassificeerd (tabel 2). De moleculaire diagnostiek is vaak zelfs mogelijk op weefsel dat in paraffine/paraplast ingebed en in formaline gefixeerd is, hetgeen het gebruik van de techniek in de pathologische diagnostiek aanmerkelijk heeft vergemakkelijkt. Verwacht mag worden dat in de komende jaren moleculair-genetische analyse tot meer van dergelijke specifieke genetische markers zal leiden. Behalve de afwijkingen in het genoom van de kankercel kan ook genexpressie, bijvoorbeeld gerelateerd aan een bepaalde differentiatierichting, als diagnostisch criterium worden gebruikt. In de histopathologische diagnostiek is dit heel gebruikelijk via immunohistochemisch onderzoek. 1 Ook op mrna-niveau kan genexpressie worden geanalyseerd via de zogenaamde reverse -transcriptase-pcr (RT-PCR), via in-situhybridisatie of via de cdna-chips. Deze laatste maken het mogelijk in één test de expressie van duizenden genen in een tumor vast te stellen. Het einde van de morfologische tumordiagnostiek? Of moleculair-genetische analyse ooit de morfologische diagnostiek zal kunnen vervangen (wat sommige moleculair-tumorbiologen wel veronderstellen), is nog een open vraag. De huidige kennis berust voornamelijk op door pathologen gedefinieerd tumormateriaal. Uit dat tumormateriaal dient doorgaans normaal celmateriaal (zoals tumorstroma of immuuncompetente cellen) te worden verwijderd (onder histologische controle) om betrouwbare analyse mogelijk te maken. Bovendien, en dat is een belangrijker overweging, zijn tumoren van hetzelfde type niet zelden genetisch nogal heterogeen. Ook tussen primaire tumoren en hun metastasen komt belangrijke heterogeniteit voor. Een laatste kanttekening is dat de morfologische tumordiagnostiek niet alleen gebaseerd is op de morfologische kenmerken van de tumorcellen, maar ook op de reactie van de gastheer. De architectuur van tumoren, die een uiterst belangrijke bijdrage levert aan de histologische criteria, berust voor een groot deel daarop. Dat aspect van tumorgroei blijft bij de moleculair-genetische analyse volstrekt onderbelicht. Hoever heeft de tumor zich uitgebreid? In het onderzoek van resectiepreparaten van tumoren speelt, naast classificatie en gradering van de tumor, de bepaling van de uitbreiding van de tumor een essentiële rol. In concreto betekent dat het onderzoek van de resectieranden en van de in het preparaat aanwezige lymfklieren. Beide vraagstellingen zijn inmiddels ook benaderd met mole- TABEL 1.Kenmerkende genetische afwijkingen bij hematologische maligniteiten aandoening acute lymfatische leukemie chronische myeloïde leukemie acute myeloïde leukemie folliculair lymfoom grootcellig lymfoom t = translocatie.... chromosomale afwijking t(4;11) t(9;22) t(8;21) t(14;18) t(2;5) TABEL 2. Kenmerkende chromosomale afwijkingen bij mesenchymale tumoren tumortype Ewing-sarcoom lipoom liposarcoom synoviaal sarcoom chondrosarcoom rhabdomyosarcoom clear-cell -sarcoom t = translocatie. chromosomale afwijking t(11;22) t(3;12) t(12;16) t(x;18) t(9;22) t(2;13) t(12;22) Ned Tijdschr Geneeskd november;143(45) 2273

6 culaire technieken. Zo heeft men resectieranden van laryngectomiepreparaten onderzocht op het vóórkomen van p53-mutaties die waren vastgesteld in de primaire tumor In een aanzienlijk percentage van de gevallen waarin microscopisch onderzoek van de resectieranden negatief was, werden p53-gemuteerde cellen aangetroffen, hetgeen suggereert dat het moleculaire onderzoek naar tumorcellen gevoeliger is dan het morfologische. Meerdere groepen onderzochten lymfklieren met moleculaire technieken, onder meer bij patiënten met mammacarcinoom, 19 melanoom 20 en coloncarcinoom. 21 Steeds was de uitslag van moleculair onderzoek frequenter positief dan die van het morfologische. Men dient zich af te vragen of in deze gevallen slechts tumorcellen werden aangetoond die de lymfklier passeerden dan wel gevestigde metastasen, dat zijn reeds in de lymfklier uitgegroeide tumorcellen. Er zijn aanwijzingen dat patiënten met lymfklieren die een positieve uitslag geven in moleculair onderzoek, een minder goede prognose hebben dan patiënten met moleculair-pathologisch negatieve lymfklieren. 21 Deze materie is ook daarom in discussie omdat met de uiterst gevoelige PCR-methoden tumorcellen bij veel patiënten in de circulatie kunnen worden aangetoond, ook als er geen metastasen zijn. 22 Het is bekend uit diermodellen dat slechts een klein deel van de circulerende tumorcellen in staat is een metastase te vormen. 23 In hoeverre uiteindelijk moleculaire analyse van de uitbreiding van een tumor aan de keuze van een behandelingsstrategie kan bijdragen, is dus nog een open vraag. Hoe zal de tumor zich gedragen? In klinisch-pathologisch onderzoek van tumoren neemt de speurtocht naar prognostische factoren een belangrijke plaats in. De laatste jaren is veel onderzoek verricht naar de prognostische betekenis van moleculaire markers. Er zijn daarbij belangrijke vondsten gedaan. Amplificatie van het N-myc-gen is bij neuroblastoom een prognostische graadmeter die een rol speelt bij de keuze van de behandeling. 24 Behandeling van patiënten met gemetastaseerd ductaal mammacarcinoom met antilichamen tegen c-erb-2-eiwit is alleen zinvol als de tumor verhoogde expressie van dat eiwit vertoont. 25 Er zijn meer van dergelijke voorbeelden, maar vooralsnog is de betekenis van moleculaire graadmeters voor het bepalen van de behandelingsstrategie beperkt. Er is relatief veel aandacht besteed aan de voorspellende waarde van p53- en bcl-2-afwijkingen voor de te verwachten respons van de tumor op radio- of chemotherapie. Uitgangspunt hierbij is dat tumorcellen op dergelijke therapie reageren via apoptose en dat bij cellen met een p53-genmutatie een belangrijk regelmechanisme van apoptose is verstoord, terwijl verhoogde bcl-2- expressie apoptose blokkeert (zie figuur 3). Hoewel in de literatuur meerdere publicaties suggereren dat deze moleculaire graadmeters inderdaad een voorspellende waarde hebben ten aanzien van de reactie op therapie, is de klinische betekenis ervan twijfelachtig, zoals onlangs overtuigend werd beargumenteerd. 26 Het lijkt er dus op dat moleculair onderzoek in de klinische oncologie slechts een bescheiden rol speelt. Vermoedelijk is de tot nu toe gevolgde aanpak daarbij een belangrijke beperkende factor. De meeste onderzoeken omvatten namelijk niet meer dan één of enkele factoren, terwijl bij gezwelgroei een groot aantal regelmechanismen, alle een hele cascade van genfamilies omvattend, is betrokken. De verwachting is gewettigd dat de DNA-chiptechniek, met de mogelijkheid tot analyse in één test van duizenden bij kanker betrokken genen, hierin snel verandering zal brengen. toekomst Zonder enige twijfel ligt voor de moleculair kankerdiagnostiek een belangrijke rol in het verschiet. Voor de diagnostiek van familiaire vormen van kanker, die het gevolg zijn van mutaties in de kiembaan, is DNAonderzoek alreeds onmisbaar. 27 Moleculair-biologisch onderzoek heeft duidelijk gemaakt dat bij kanker genafwijkingen een centrale rol spelen. Dat inzicht leidt niet meteen tot dramatische veranderingen in de diagnostiek of de behandeling: de kloof tussen laboratoriumtafel en ziekbed is groot. Ten aanzien van de diagnostiek is al aangegeven dat genetische heterogeniteit van tumoren, het grote aantal bij tumorontwikkeling betrokken genen en de onmogelijkheid met de tot nu toe gebruikte technieken meer dan enkele genen per tumor te bestuderen belangrijke beperkende factoren zijn. De verdere ontwikkeling van de DNA-chip zal dat veranderen. Voor de kortere termijn is te verwachten dat moleculaire graadmeters een in gewicht toenemende, maar toch bescheiden rol zullen spelen bij de klinische besluitvorming. Voor de langere termijn, men denke daarbij aan een jaar of 10, is echter te voorzien dat patronen van genafwijkingen en van -expressie een belangrijke rol zullen spelen. Ook in de 21e eeuw zal derhalve de morfologische taxonomie van tumoren stand houden, maar niet dan met aanzienlijke steun van moleculaire criteria. abstract Molecular pathology: cross-roads of morphology, biochemistry and genetics Molecular analysis of samples of cells and tissues plays an important part in clinical pathology, as a supplement to classical morphological examination. This holds true without reserve for immunohistochemistry, by now indispensable for clinical pathology. It was only recently that molecular genetic analysis was introduced into the pathological laboratory and it may be expected that this technique will play an important part, especially in cancer diagnostics. Where haemato-oncological malignancies and soft tissue sarcomas are concerned, this is already the case. Molecular tumour analysis will gain momentum due to advanced automated analysis using DNA arrays. Morphological aspects will long remain the foundation of tumour classification, but in the future not without major support from molecular analysis. literatuur 1 Bosman FT. Nieuwe methoden in de pathologische anatomie. Ned Tijdschr Geneeskd 1989;133: Steele RJ, Thompson AM, Hall PA, Lane DP. The p53 tumour suppressor gene. Br J Surg 1998;85: Ned Tijdschr Geneeskd november;143(45)

7 3 Raap AK. Advances in fluorescence in situ hybridization. Mut Res 1998;400: Brown PO, Botstein D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nat Genet 1999;21(1 Suppl): Duggan DJ, Bittner M, Chen Y, Meltzer P, Trent JM. Expression profiling using cdna microarrays. Nat Genet 1999;21(1 Suppl): Hahne M, Rimoldi D, Schroter M, Romero P, Schreier M, French LE, et al. Melanoma cell expression of Fas(Apo-1/CD95) ligand: implications for tumor immune escape. Science 1996;274: Curry BJ, Myers K, Hersey P. Polymerase chain reaction detection of melanoma cells in the circulation: relation to clinical stage, surgical treatment, and recurrence from melanoma. J Clin Oncol 1998;16: Gaffney EF, O Neil AJ, Staunton MJ. bcl-2 and prognosis in nonsmall-cell lung carcinoma [letter]. N Engl J Med 1994;330: Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD, Toyoda M, Tenjo T, Tanigawa N. Inhibition of apoptosis by surviving predicts shorter survival rates in colorectal cancer. Cancer Res 1998;58: Dubus P, Vergier B, Beylot-Barry M, Delaunay MM, Goussot JF, Beylot C, et al. Contribution of histopathologic and molecular analyses to the diagnosis of cutaneous B-cell infiltrates. Mod Pathol 1996;9: Niho S, Yokose T, Nishiwaki Y, Mukai K. Immunohistochemical and clonal analysis of minute pulmonary meningothelial-like nodules. Hum Pathol 1999;30: Shay JW. Telomerase in cancer: diagnostic, prognostic, and therapeutic implications. Cancer J Sci Am 1998;4( Suppl 1):S Kinzler KW, Vogelstein B. Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell 1996;87: Sturm PD, Hruban RH, Ramsoekh TB, Noorduyn LA, Tytgat GN, Gouma DJ, et al. The potential diagnostic use of K-ras codon 12 and p53 alterations in brush cytology from the pancreatic head region. J Pathol 1998;186: Rubnitz JE, Crist WM. Molecular genetics of childhood cancer: implications for pathogenesis, diagnosis, and treatment. Pediatrics 1997;100: Bovée JVMG, Hogendoorn PCW. Moleculair-biologische diagnostiek bij tumoren van het steun- en bewegingsapparaat. Ned Tijdschr Geneeskd 1997;141: Sidransky D. Nucleic acid-based methods for the detection of cancer. Science 1997;278: Brennan JA, Sidransky D. Molecular staging of head and neck squamous carcinoma. Cancer Metastasis Rev 1996;15: Min CJ, Tafra L, Verbanac KM. Identification of superior markers for polymerase chain reaction detection of breast cancer metastases in sentinel lymph nodes. Cancer Research 1998;58: Blaheta HJ, Schittek B, Breuninger H, Maczey E, Kroeber S, Sotlar K, et al. Lymph node micrometastases of cutaneous melanoma: increased sensitivity of molecular diagnosis in comparison to immunohistochemistry. Int J Cancer 1998;79: Liefers GJ, Cleton-Jansen AM, Velde CJ van de, Hermans J, Krieken JH van, Cornelisse CJ, et al. Micrometastases and survival in stage II colorectal cancer. N Engl J Med 1998;339: Wyld DK, Selby P, Perren TJ, Jonas SK, Allen-Mersh TG, Wheeldon J, et al. Detection of colorectal cancer cells in peripheral blood by reverse-transcriptase polymerase chain reaction for cytokeratin 20. Int J Cancer 1998;79: Fidler IJ. Critical determinants of melanoma metastasis. J Inv Dermatol Symposium Proceedings 1996;1: Nakagawara A, Ikeda K, Tsuda T, Higashi K. Biological characteristics of N-myc amplified neuroblastoma in patients over one year of age. Progress in Clinical & Biological Research 1988;271: Pegram MD, Pauletti G, Slamon DJ. HER-2/neu as a predictive marker of response to breast cancer therapy. Breast Cancer Research & Treatment 1998;52: Brown JM, Wouters BG. Apoptosis, p53 and tumor cell sensitivity to anticancer agents. Cancer Res 1999;59: Gezondheidsraad: Commissie DNA-diagnostiek. DNA-diagnostiek. Publicatie nr 1998/11. Rijswijk: Gezondheidsraad; Aanvaard op 7 oktober 1999 Oorspronkelijke stukken Gunstige effecten van cryochirurgische behandeling bij benigne en laaggradig maligne bottumoren bij 120 patiënten h.w.b.schreuder, l.c.m.keijser en r.p.h.veth Cryochirurgie is een vorm van chirurgie waarbij behalve een operatieve behandeling ook aanvullende lokale destructie van weefsel plaatsvindt door de toepassing van zeer lage temperaturen. In de orthopedische oncologie wordt cryochirurgie gebruikt als een adjuvante lokale therapie na een gecontamineerde, meestal intralesionale resectie (curettage) van benigne en laaggradig maligne bottumoren. 1 Het koude letsel breidt zich dan uit tot net buiten de begrenzing van de oorspronkelijke tumor en resulteert in een vergroting van de chirurgische marge, die dan vergelijkbaar is met die van een marginale resectie. Academisch Ziekenhuis, afd. Orthopedie, Postbus 9101, 6500 HB Nijmegen. Dr.H.W.B.Schreuder en prof.dr.r.p.h.veth, orthopedisch chirurgen; L.C.M.Keijser, assistent-geneeskundige. Correspondentieadres: dr.h.w.b.schreuder. Samenvatting: zie volgende bladzijde. Cryobiologie is de studie van de fysieke effecten van lage temperaturen op levend weefsel en verklaart de destruerende eigenschappen van een koudeletsel op een individuele (tumor)cel. Het effectiefst ontstaat dit letsel wanneer cryochirurgie wordt uitgevoerd door middel van zeer snelle bevriezing. Dit gaat gepaard met intracellulaire ijsvorming, die mechanische beschadiging van de celkern en de celmembranen induceert. Daarnaast zijn een minimumtemperatuur van 50 C en langzame ontdooiing essentieel. Dit laatste gaat opnieuw gepaard met intracellulaire (re)kristallisatie van water en dus opnieuw met membraanbeschadiging. Lokale ischemie door beschadiging van de microcirculatie heeft een additioneel necrotiserend effect op de (tumor)cel. Ned Tijdschr Geneeskd november;143(45) 2275