Wanneer moleculaire testen aanvragen bij hematologische aandoeningen?

Wanneer moleculaire testen aanvragen bij hematologische aandoeningen? Apr. Biol. Barbara Denys UZ Gent Labo Klinische Biologie Labo hematologie 19 December 2017

Overzicht Inleiding CMD Pre-analytische fase Moleculaire diagnostiek bij acute leukemieën Moleculaire diagnostiek bij myeloproliferatieve aandoeningen Moleculaire diagnostiek bij lymfomen Technieken komen beperkt aan bod RIZIV terugbetaling / aanrekening 2

Rol van het labo binnen de hemato-oncologie Basis van hematologische diagnostiek = Morfologie/histologie (perifeer bloed/beenmerg/biopten) + snel + Eenvoudig/geen geavanceerde techniek + Beperkt instrumentarium - Beperkte gevoeligheid - Interobserver variabiliteit - Geen bijkomstige info 3

Rol van het labo binnen de hemato-oncologie Verdere verfijning van diagnostiek Fenotypering flowcytometrie met monoklonale antilichamen Antilichaam-antigen binding Membranaire kleuring Cytoplasmatische kleuring niveau van eiwit (functie van cel) 4

Rol van het labo binnen de hemato-oncologie Genotypering karyotypering FISH PCR Microarray techniek Sequencing niveau van genoom = DNA niveau van transcriptoom = RNA (mrna, ) Detectie en/of analyse van nucleïnezuren in klinische stalen 5

Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie) 18 Centra voor Moleculaire Diagnostiek (CMDs) voor moleculaire diagnostiek (KB 98) afgeschaft door arrest Raad van State in 2005 2005 2007: ex-cmd s niet meer betaald door RIZIV, op kosten van ziekenhuis Art 33bis in voege vanaf 01/08/2007: De verstrekkingen moeten uitgevoerd zijn in een laboratorium dat, een ISO 15189 accreditatie, of een accreditatie volgens een gelijkwaardige laboratoriumnorm bezit voor de uitgevoerde verstrekkingen April 2009: CMD UZG accreditatie behaald 4 MLT s (~3 FTE) voor de testen binnen hemato-oncologie > 25 verschillende testen (waaronder ook NGS panels) ~3000 stalen/analysen per jaar (geaccrediteerd binnen art. 33bis) 6

Labo Moleculaire Diagnostiek (Klinische Biologie) Stalen naar labo Klinische Biologie sturen Aanvraagformulier Bijzondere stolling en hematologie (achterzijde) Eigen doorstuurformulier met duidelijke specificatie van test en klinische inlichtingen (voor sommige analysen vereist) Labgids: www.labgids.gent Aanvraagformulier Afdeling selecteren overzicht van alle testen Heel veel informatie: stalen antwoordtijd - terugbetaling klinisch belang/interpretatie 7

Stalen Karyo en FISH: Na/Li-heparine tube PCR/sequencing: afname steeds op EDTA (geen heparine) EDTA tubes in tussentijd in koelkast te bewaren; heparinetubes mogen op KT bewaard wroden Aparte ongeopende EDTA tubes moeten zo snel mogelijk doorgestuurd worden Voorbereiding staal: isolatie WBC door lyse RBC (dagelijks) Analyses op RNA: isolatie cellen binnen de 48h Analyses op DNA: isolatie cellen binnen de 72h Bepaalde toepassingen op DNA: rechtstreekse DNA isolatie uit volbloed Staaltypes: Bloed Beenmerg - (Vocht) - Biopt: vers of ingebed in paraffine (nefast voor DNA kwaliteit) 8

Startmateriaal - nucleïnezuren RNA Onstabiel (RNase) DNA Stabiel Beperkte variabiliteit bij fusiegenen resulterend uit translocaties Sterke verschillen in breukpunten bij verschillende patiënten Tot duizenden kopijen/ cel: heel gevoelig 1 kopij/cel (minder gevoelig) Correlatie met aantal tumorcellen moeilijk te bepalen (patiënt- en staalafhankelijk) Correlatie met aantal tumorcellen gemakkelijker te bepalen Interne controle: ABL1 qpcr (variatie in populatie?) Interne controle: CRP qpcr (± constant in populatie) 9

Instabiliteit RNA praktisch voorbeeld Staal werd geïncubeerd bij kamertemperatuur of bij 4 C: aantal kopijen controlegen daalt drastisch, zelfs na één dag bij KT => maat voor gevoeligheid specifiek target 10000 9000 Aantal kopijen controlegen 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 KT 4 C 0 Dag 0 Dag 1 Dag 2 Dag 3 10

ALL CLL Lymphomas MM naïve Lymphoid progenitor B-lymphocytes T-lymphocytes Plasma cells Hematopoietic stem cell Myeloid progenitor AML Myeloproliferative disorders Neutrophils Eosinophils Basophils Monocytes Platelets 2010 Universitair Ziekenhuis Gent Red cells 11

Moleculaire diagnostiek bij ACUTE LEUKEMIEËN Belang diagnose, prognose en follow-up! AML / B-ALL / T-ALL / MPAL 12

Acute myeloïde leukemie of AML Klonale hematopoietische stamcelstoornis Abnormale proliferatie en accumulatie van leukemische cellen of blasten Heterogeen ziektebeeld Incidentie: wereldwijd 3.7 per 100 000 personen per jaar, hoger > 65j Gemiddelde leeftijd bij diagnose = 65j 13

Acute lymphoblastaire leukemie (ALL) Meest voorkomende vorm van kanker bij kinderen Maligne proliferatie van immature lymfoïde precursorcellen B-cell precursor (BCP) ALL : ~85% van de gevallen T-ALL : ~15% van de gevallen Treatment Chemotherapy and HSCT According to (inter)national protocols CNS treatment Supportive therapy (bv pneumocystis, varicella) 14

Leeftijdspecifieke incidentie AML en ALL 15

Overall Survival (OS) AML - Primary induction failure: -Jonge pt: 20-30% -Oudere pt: 40-50% - Relapse: groot %, afh RF - Early relapse: kans op CR2 20% - Overleving na relapse: 10% 16

Overleving ALL patiënten Adults Mean 5-yr overall survival: 80-85% OS low risk group: ~ 90% 17

Klinisch belang moleculaire diagnostiek DIAGNOSE classificatie van patiënten met acute leukemie PROGNOSE risico stratificatie behandeling patiënten aanpassen risk-adapted therapy THERAPIE Targeted therapy: specifieke inhibitoren voor bepaalde mutaties FLT3-ITD/TKD en FLT3-inhibitoren (Midostaurin ) FOLLOW-UP opsporen minimale residuele ziekterest (MRD) opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling 18

WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues 2008 2016 19

DIAGNOSE acute leukemie Karyotypering Opsporen van fusiegenen (-expressie): 1. FISH 2. Hemavision screening: AML-ETO, PML-RARA, TEL-AML, BCR-ABL1... opsporen van (onco-) gen overexpressie: WT1-overexpressie, EVI1-overexpressie opsporen van mutaties: NPM1, FLT3, CEBPA, RUNX1, ASXL1, 20

Screening translocaties leukemie HemaVision TM is een kwalitatieve multiplex RT-PCR test ontwikkeld om 28 verschillende translocaties of chromosomale herschikkingen, inclusief meer dan 145 breekpunten of splice variants, te detecteren t(1;11)(p32;q23) MLL/AF1p, t(1;11)(q21;q23)mll/af1q, t(1;19)(q23;p13)e2a/pbx1, t(3;21)(q26;q22)aml/eap/mds/evi1, t(3;5)(q25.1;q34)npm/mlf1, t(4;11)(q21;q23)mll/af4, t(5;12)(q33;p13) TEL/PDGFRb, t(5;17)(q35;q21)npm/rara, t(6:11)(q27;q23) MLL/AF6, t(6;9)(p23;q34)dek/can, t(8;21)(q22;q22)aml1/mgt8, t(9;11)(q22;q23) MLL/AF9, t(9;12)(q34;p13) TEL/ABL, t(9;22)(q34;q11)bcr/abl, t(9;9)(q34;q34)set/can, t(10;11)(p12;q23)mll/af10, t(11;17)(q23;q21)mll/af17, t(11;17)(q23;q21) PLZF/RARa, t(11;19)(q23;p13.1) MLL/ELL, t(11;19)(q23;p13.3) MLL/ENL, t(12;21)(p13;q22)tel/aml1, t(12;22)(p13;q11) TEL/MN1, t(15;17)(q22;q21)pml/ RARa, t(16;21)(q11;q22)tls/erg, t(17;19)(q22;p13) E2A/HLF, inv(16)(p13;q22)cbfb/myh11, t(x;11)(q13;q23)mll/afx, TAL1deletion(p34)SIL/TAL1 21

Fusiegenen in acute lymfatische leukemie (ALL) Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004) 22

B lymphoblastic leukemia/lymphoma with recurrent genetic abnormalities t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1 t(v;11q23); MLL KMT2A rearranged t(12;21)(p13;q22); TEL-AML1 ETV6-RUNX1 Hyperdiploidy Hypodiploidy t(5;14)(q31;q32); IL3-IGH t(1;19)(q23;q13.3); E2A-PBX1(TCF3-PBX1) Provisional entity: BCR-ABL like Provisional entity: with iamp21 23

Prognostisch belang translocaties in ALL Pui et al., NEJM 350:1535-1548 (2004) 24

Genetische diversiteit fusiegenen bij AML Adult 10% PML-RARA Pediatric 25

AML with recurrent genetic abnormalities Abnormaal karyotype Normaal karyotype AML with t(8;21)(q22;q22): RUNX1-RUNX1T1 AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)(p13.1;q22): CBFB-MYH11 APL with t(15;17)(q22;q12): PML-RARA (also other complex rearrangements) AML with t(9;11)(p22;q23): MLLT3-MLL MLLT3-KMT2A AML with t(6;9); DEK-NUP214 AML with inv(3)(q21;q26.2) or t(3;3)(q21;q26.2): RPN1-EVI1 GATA2, MECOM AML (megakaryoblastic) with t(1;22)(p13;q13): RBM15-MKL1 AML with mutated NPM1 AML with biallelic mutations of CEBPA Provisional entitity: AML with BCR-ABL1 gene fusion (specific treatment) Provisional entitity: AML with mutated RUNX1 (based upon specific clinicopathologic features, elderly male, worse prognosis) Dohner H. et al NEJM 2015 + Arber et al. Blood 2016 26

Belang fusiegenen bij AML = PROGNOSE Grimwade D, Morzek K; Hematol Oncol Clin N Am 2011 27

Cytogenetica -> risicogroepen Karyotype = belangrijkste prognostische waarde bij diagnose AML: 30% chromosale translocaties / 10-15% non-random chromosomale afwijkingen Dus 40-50% cytogenetisch normaal (CN-AML) 28 Döhner et al. Blood, 2017

Belang mutaties bij AML 40-50% cytogenetisch normaal (CN-AML) = intermediair risicogroep Betere risico stratificatie vereist Steeds uitbreidende genetische afwijkingen hebben een significant impact op prognose: mutaties en overexpressie bepaalde genen 29

Moleculaire landschap in AML 25% / ongunstig 30% of > 50% CN-AML / gunstig 30

Prognose NPM1/FLT3-ITD Schnittger et al, Blood 2005 Dohner et al, Blood 2005 Verhaak et al, Blood 2005 Thiede c, Blood 2006 4 grote Europese studies op meer dan 1000 CN-AML patiënten identificeerden een aparte subgroep: Enkel NPM1 mutatie in afwezigheid van FLT3-ITD = geassocieerd met betere OS/DFS en lager risico op herval 31

Moleculair landschap in AML 200 patiënten met AML WGS/ WES 1623 genen met een mutatie 260 genen met tenminste 2 mutatie Slechts in 3 stalen geen mutatie 4-5 afwijkingen per patiënt 23 genen die het meest gemuteerd zijn (fig) Ontdekking van additionele moleculaire merkers die een belangrijke rol spelen in de prognose van : DNMT3A mutaties (27%), IDH1/2 (18%), TET2 (~10%), RUNX1 (~10%), TP53 (~10%) The Cancer Genome Atlas Research Network. N Engl J Med 2013 / TCGA) 32

Influence of Gene Gene Interactions on Overall Survival 33

And so it continues.. AML = complex dynamic disease with patients having typically >1 driver mutation Gene-gene interactions!!! Clinical effect of driver mutations is modified by the wider genomic context in which they occur Impact of mutations ~ age 34

Moleculair landschap van AML Döhner et al. Blood, 2017 35

NEXT GENERATION SEQUENCING MDG of Moleculaire diagnostiek Gent : nieuw platform waar technieken voor verschillende toepassingen ter beschikking staan; samenwerking Medische Genetica, Klinische Biologie en Pathologie NGS: next generation sequencing = hoofdtechniek; andere (nieuwe) moleculaire technieken kunnen ook aan bod komen (toekomst) In-house NGS protocol: MiSEQ Bestaande workflow voor constitutionele aandoeningen Voordelen: heel flexibel, snel genen toevoegen aan bestaande panels Nadelen: meer validatiewerk 36

AML/MDS/CMML panel Gen Exon Codon 2 NGS panels MPN Gen Aandoeningen CALR ET, PMF CSF3R CNL, acml JAK2 PV, ET, PMF MPL ET, PMF SETBP1 CMML, acml, CNL SRSF2 CMML ASXL1 13 Alle codons, hotspot op G646 CEBPA 1 Alle codons DNMT3A 8-23 Alle codons, hotspot op R882 FLT3 14-15 (ITD) 20 (TKD) ITD: alle codons TKD: D835 en I836 IDH1 4 R132 IDH2 4 R140 en R172 KIT 8/17 Exon 8: T417-R420 Exon 17: D816, D820, N822 NPM1 12 Alle codons, hotspot W288 NRAS 2-3 Codons 12, 13, 61 RUNX1 3-8 Alle codons SF3B1 14-16 Alle codons SRSF2 1 P95 TET2 1-9 Alle codons TP53 4-9 Alle codons U2AF1 2/6 S34 (exon 2) en Q157 (exon 6) 37

Myelodysplasie (MDS) Heterogene groep verworven aandoeningen van de pluripotente stamcel Ineffectieve haematopoiese Kwantitatieve en kwalitatieve afwijkingen van de 3 hematopoietische cellijnen Preleukemie 38

Myelodysplastic syndromes (MDS) Klonale BM neoplasie Gekarakteriseerd door een ineffectieve hematopoiese met morfologische dysplasie in hematopoietische cellen en perifere cytopenie Cytopenie is conditio sine qua non Classificatie is gebaseerd op dysplasie en % blasten, NIET op cytopenie Noemer om het aantal myeloblast te berekenen: alle gekernde BM cellen Dysplasie = >10% dysplastische cellen/cellijn 2016 WHO classification 2008 MDS with single lineage dysplasia (MDS-SLD) MDS with multilineage dysplasia (MDS-MLD) MDS-SLD with ringsideroblasts MDS-MLD with ringsideroblasts RCUD RCMD RARS RCMD-RS MDS with isolated del(5q) MDS with excess blasts (MDS-EB1 or MDS-EB2) RAEB-1 or RAEB-2 MDS unclassifiable (MDS-U) 39

Myelodysplastische syndromen MDS Diagnose van een MDS is een uitdaging. Cytopenieën, contrasterend met een celrijk beenmerguitstrijkje zijn suggestief. Daarenboven zijn cytomorfologische afwijkingen in PB en BM een essentiële vereiste. Studies hebben echter aangetoond dat de reproduceerbaarheid van cytomorfologische analysen, zelfs indien uitgevoerd door experten, vrij laag scoort.anecdote John Bennett (20% accurate diagnose) Alternatieven? 40

Moleculair landschap in MDS 944 patiënten met MDS 2764 mutaties in 96 genen Mediaan: 3 afwijkingen per individu (range 0 12) Haferlach et al, Leukemia 2014 41

Diagnostische criteria MDS Verworven klonale mutaties zoals gezien in MDS komen voor in hematopoïetische cellen van gezonde individuen zonder MDS Op heden is de aanwezigheid van MDS-geassocieerde somatische mutaties op zich NIET VOLDOENDE voor een diagnose van een MDS, ook bij een patiënt met een onverklaarde cytopenie (Arber et al, Blood 2016: WHO 2016 revision!) Bijkomende studies nodig om de link te onderzoeken tussen deze specifieke mutaties, mutatiefrequentie en combinaties van mutaties met de ontwikkeling tot MDS 42

MDS met ringsideroblasten SF3B1 mutaties Gen: splicing factor 3b, subunit 1 Belangrijke rol in splicing van mrna. Mutatie in MDS (20-25%) / MDS met ringsideroblasten (~80%) prognostisch gunstig Klassificatie MDS op basis van % ringsideroblasten en SF3B1 mutaties: MDS-RS 5% + SF3B1 mutaties MDS-RS 15% zonder SF3B1 mutaties 2010 Universitair Ziekenhuis Gent Cazzola M et al. Blood. 2013 Arber et al, Blood 2016 43

Terugbetaling RIZIV AML/MDS Op heden tem 31/10/2016 Acute leukemie: 5x aanrekenen (screening reeds 28 fusietranscripten) Bij herval: opnieuw aan te rekenen, min na 1j RAEB-2 met > 10% blasten kan ook uitgewerkt worden MUTATIE-analyse kunnen niet worden aangerekend 2008 Universitair Ziekenhuis Gent Vanaf 1 november 2016 ALL: 5x aanrekenen AML: 8x aanrekenen (screening reeds 28 fusietranscripten) Bij herval: opnieuw aan te rekenen, min na 1j MDS-EB-2 met > 10% blasten kan ook uitgewerkt worden Kost MUTATIE-analyse met NGS gedekt 44 44

Terugbetaling RIZIV voor MDS Geen RIZIV tussenkomst voor mutatie-analyse bij MDS patiënten (< 10% blasten) Op heden ook GEEN diagnostisch criterium CAVE oudere mensen Uitwerking wel mogelijk, enkel in duidelijk overleg 2008 Universitair Ziekenhuis Gent 45 45

AML/MDS uitwerking Diagnose en herval AML of MDS-EB-2 Translocatiescreening m.b.v. HemaVision WT1 overexpressie (qpcr) MLL-PTD (qpcr) AML/MDS panel met NGS indien klinisch relevant*: FLT3, NPM1, CEBPa, KIT, DNMT3A, TET2, NRAS, IDH1, IDH2, ASXL1, TP53, RUNX1, SF3B1, SRSF2, U2AF1 * < 65 jaar altijd; > 65 jaar te bespreken op MOC Nieuwe diagnose MDS: MDS-(RS)-SLD, MDS-(RS)- MLD, MDS del(5q), MDS- EB-1, MDS-U of CMML of PMF MLL-PTD (enkel bij MDS) AML/MDS panel met NGS bij bewezen MDS/CMML/PMF en indien klinisch relevant */**: FLT3, NPM1, CEBPa, KIT, DNMT3A, TET2, NRAS, IDH1, IDH2, ASXL1, TP53, RUNX1, SF3B1, SRSF2, U2AF1 *< 65 jaar en te bespreken op MOC / ** NGS uitwerking bij twijfelachtige diagnose MDS/CMML enkel na overleg op MOC

Klinisch belang moleculaire diagnostiek DIAGNOSE classificatie van patiënten met acute leukemie PROGNOSE behandeling patiënten aanpassen ( risk-adapted therapy) FOLLOW-UP opsporen minimale residuele ziekterest (MRD) opvolgen transplantatie m.b.v. chimerismebepaling 47

BELANG evaluatie minimale ziekterest ( minimal residual disease of MRD) monitoring respons op therapie selectie verder therapiekeuze indeling risicogroepen: zo snel mogelijk na inductietherapie high risk patiënten (hoge kans op herval) identificeren ondanks CR predictie prognose: voorspelling verder klinisch verloop detectie vroeg/laat herval Continue monitoring/follow up 48

Moleculaire diagnostiek bij myeloproliferatieve aandoeningen (MPN) Belang fusietranscript BCR-ABL bij CML Belang mutatie JAK2V617F, CALR, MPL, bij Phi-negatieve MPN 49

Myeloproliferative neoplasms (MPNs) Overproductie van 1 of meerdere myeloïde reeksen Granulocytair Megakaryocytair Erythrocytair Effectieve klonale myeloproliferatie: geen of minimale dysplasie! Oorzaak: Mutatie in hematopoïetische stamcel Klonale proliferatie in beenmerg Soms moeilijke DD Overlap/overgang vormen Evolutie Myelofibrose AL Arber et al. Blood; 2016 50

Myeloproliferatieve Aandoeningen o WHO classificatie 2008: - Chronic myelogenous leukaemia, BCR-ABL1 positive - Chronic neutrophilic leukaemie (CNL) - Polycythemia vera (PV) - Primary myelofibrosis (PMF) - Essential thrombocythaemia (ET) - Chronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified (CEL, NOS) - Mastocytosis - Myeloproliferative neoplasm, unclassifiable o MDS/MPD: CMML, JMML, atypic CML (BCR-ABL1 negative), MDS/CMD unclassifiable 51

2016 update Geen significante veranderingen indeling Veranderingen diagnostische criteria Nieuwe mutaties Beter inzicht in morfologisch kenmerken Mastocytose MPN MDS/MPN met ringsideroblasten en trombocytose = aparte categorie (niet meer provisoir) 52

Chronische myeloide leukemie of CML Leukocytose Myeloïde voorlopercellen Eosinofilie Basofilie BM: CML PBO: Normaal CML 53

Chronische myeloide leukemie of CML Incidentie: 1-2 cases per 100.000 mensen per jaar (15-20% van volwassen leukemie) CML iets frequenter gezien bij mannen dan bij vrouwen: 1.4 / 1 Mediane leeftijd bij diagnose: 55-60 jaar CML zeldzaam bij jongeren 3 fasen: chronic acceleratie blastencrisis Meerderheid (>80%) wordt gediagnosticeerd in de chronische fase(cml-cp) 54

Philadelphia (Ph) chromosoom of BCR-ABL1 fusiegen CML is de eerste kanker waarbij aangetoond werd dat dit veroorzaakt wordt door een onderliggende genetische afwijking! 55

Tyrosine kinase inhibitoren (TKI): Imatinib mesylate (Gleevec, Glivec, STI-571) 56

Diagnose CML Perifeer bloed voor detectie BCR-ABL door moleculaire genetische technieken Karyotypering t(9;22)(q34.1;q11.2) BM aspiraat is essentieel bij diagnose Complete karyotypering (bijkomende abnormaliteiten) Ziektestadium bepalen 57

Karyotypering / Moleculaire diagnostiek 58

NIEUWE DIAGNOSE CML PB staal voor BM Klinische biologie CMGG qpcr Karyotypering FISH Na/Li-heparine buis EDTA 59

Belang moleculaire monitoring bij FU CML Respons op behandeling met imatinib Meeste patiënten hebben een zeer goede respons op TKI behandeling Echter sommige patiënten zullen wel progressie vertonen Vroege detectie van progressie, herval of treatment failure is belangrijk om snel over te schakelen naar een alternatieve behandeling: nieuwe generatie TKI s! 60

Progression-free Survival on 1 st -line Imatinib by Molecular Response (MR) at 12 months 100 90 % without progression 80 70 60 50 40 30 20 10 0 No CCyR <3 log reduction >=3 log reduction MMR estimated rate of survival without progression at 42 months: n=138 75% PFS n=94 90% PFS n=136 98% PFS 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 Months since randomization IRIS Study,update 2004 61

Definition of the response to TKI (any TKI) first-line treatment Evaluation Time Recommendation of European LeukemiaNet: incorporating molecular responses at 3, 6, 12 and 18 months 3 months BCR-ABL1 10% and/or Ph+ 35% 6 months BCR-ABL1 1% and/or Ph+ 0 Optimal Warning Failure BCR-ABL1 > 10% and/or Ph+ 36-95% BCR-ABL1 1-10% and/or Ph+ 1-35% No CHR and/or Ph+ > 95% BCR-ABL1 > 10% and/or Ph+ >35% 12 months BCR-ABL1 0.1% (MMR) BCR-ABL 1 0.1-1% BCR-ABL1 > 1% and/or Ph+ > 0 After 1 year and any time BCR-ABL1 0.1% Clonal chromosome abnormalities (CCA) in Phcells (-7, or 7q-) Loss of CHR, loss of CCyR, confirmed loss of MMR (>0.1%), mutations, CCA/Ph+ Baccarani et al, Blood 2013 62

Myeloproliferatieve Aandoeningen o WHO classificatie 2008: - Chronic myelogenous leukaemia, BCR-ABL1 positive - Chronic neutrophilic leukaemie (CNL) - Polycythemia vera (PV) - Primary myelofibrosis (PMF) - Essential thrombocythaemia (ET) - Chronic eosinophilic leukemia, not otherwise specified (CEL, NOS) - Mastocytosis - Myeloproliferative neoplasm, unclassifiable o MDS/MPD: CMML, JMML, atypic CML (BCR-ABL1 negative), MDS/CMD unclassifiable 63

JAK2 V617F mutatie verworven puntmutatie chrom 9 exon 14; G naar T van codon 617 => Valine naar phenylalanine Involvement of Janus Kinases in Cytokine Signal Transduction (Panel A) and Structural Map of Janus Kinase 2 (Panel B) 2005: first reports by 4 groups gain-of-function point mutation, resulting in a constitutive tyrosine phosphorylation activity -> cytokineindependent activation of JAK-STAT pathway proliferative and survival advantage to affected hematopoietic precursors stimulatie erythropoïese zonder groeifactoren zoals EPO Goldman JM, NEJM 2005 64

Klinisch belang JAK2V617F DIAGNOSTISCHE WAARDE:! Belangrijke moleculaire merker bij diagnose van BCR-ABL negatieve chronische myeloproliferatieve aandoeningen; heterogene groep met vaak complexe histologische diagnose JAK2 tijdperk: veel vereenvoudigd simpele en relatief goedkope assay Ziekte van Vaquez of polycythemia vera (PV): >95% JAK2V617F positief Essentiële thrombocytemie (ET): ~50% positief Primaire myelofibrose (PMF): ~50% positief 100% specifiek voor klonale aandoening Geen onderscheid mogelijk tussen de verschillende MPD 65

Andere mutaties bij MPN JAK2 exon 12 mutaties Reeds meer dan 12 verschillende beschreven JAK2V617F negatieve PV-patiënten (3-5%) MPL mutaties myeloproliferatieve leukemie virus gen codeert voor een trombopoïetine receptor (TPO) Trombopoïetine (TPO) en MPL-receptor reguleren de productie van trombocyten Meest voorkomende mutatie: MPLW515L en MPLW515K 5% van PMF en 1% ET 66

Mutation Calreticulin CALR (1) December 2013: gelijktijdige publicatie NEJM (Nangalia et al + Klampfl et al) CALR exon 9 mutaties in meest nonmutated JAK2 MPN 20-25% van alle patienten met ET of PMF (of ~60% van de JAK2/MPL negatieve ET/PMF) NIET bij PV Initiële papers JAK2 en MPL niet samen (mutual exclusivity); ondertussen reeds enkele gevallen beschreven wel beide positief Frameshift inserties of deleties Op heden meer dan 50 verschillende types mutaties in CALR Meest frequente (80% van CALR mutaties): Type I: 52-bp deletie Type II: 5-bp insertie Buiten ET/PMF, enkele gevallen bij CMML, atypische CML, MDS, RARS-T 67

Mutation CALR (2) Chao M P, and Gotlib J Blood 2014;123:1438-1440 Belang 1) Diagnostisch 2) Klinisch/prognostisch CALR-gemuteerd ET: minder risico op trombose eerder jonge personen Lagere WBC en Hb meestal hele hoge plaatjes Indolent klinisch verloop CALR-gemuteerd PMF: betere OS tov JAK2+/MPL+ Triple-negative PMF (nonmutated JAK2, CALR, MPL): slechtste OS met grootste risico op evolutie naar AML! Recent werd ook aangetoond dat het type mutatie impact heeft op de prognose 68

BCR-ABL negatieve MPN Ontdekking van nieuwe mutaties Mutation PV ET pmf JAK2 V617F (exon 14) 96% 55% 65% JAK2 exon 12 3% Rare Rare CALR exon 9 ins/del Rare 15-32% 25-35% MPL exon 10 Rare ± 4% 8% TET2, IDH, ASXL1 or DNMT3A occasionally Diagnostische + prognostische informatie 69

Klinisch belang mutatieanalyse WHO 2016 revisie major diagnostic criteria 70

Belang mutaties bij MPN/MPN-MDS Diagnostisch belang prognose JAMA Oncol. 2015 71

2016 WHO revisie RARS-T Nieuwa aparte entiteit (2016) Nieuwe naam: MDS/MPN with ring sideroblasts and thrombocytosis (MDS/MPN-RS-T) Clinical MDS like refractory anemia transfusion dependent MPN like thrombocytosis (>450.000/µL) Morphological dyserythropoiesis in the BM with ring sideroblasts (>15%) large megakaryocytes with features resembling those in PMF or ET Genetic SF3B1 mutation (80-90%) JAK2 mutatie (50-60%) rarely CALR/MPL Echte overlap ziekte 72

AML/MDS panel Gen Exon Codon 2 NGS panels mini MPN-panel Gen Aandoeningen CALR ET, PMF CSF3R CNL, acml JAK2 PV, ET, PMF MPL ET, PMF SETBP1 CMML, acml SRSF2 CMML ASXL1 13 Alle codons, hotspot op G646 CEBPA 1 Alle codons DNMT3A 8-23 Alle codons, hotspot op R882 FLT3 14-15 (ITD) 20 (TKD) ITD: alle codons TKD: D835 en I836 IDH1 4 R132 IDH2 4 R140 en R172 KIT 8/17 Exon 8: T417-R420 Exon 17: D816, D820, N822 NPM1 12 Alle codons, hotspot W288 NRAS 2-3 Codons 12, 13, 61 RUNX1 3-8 Alle codons SF3B1 14-16 Alle codons SRSF2 1 P95 TET2 1-9 Alle codons TP53 4-9 Alle codons U2AF1 2/6 S34 (exon 2) en Q157 (exon 6) 73

Vermoeden MPN Polycythemie (Hb >16,5 g/dl of Hct >49% bij mannen; Hb >16 g/dl of Hct >48% bij vrouwen), met normale O 2 saturatie en subnormale/verlaagde EPO Trombocytose (PLT > 450x10 3 /µl) Leukocytose Cytopenie (vermoeden myelofibrose) en/of leuko-erythroblastair bloedbeeld Bloedstaal voor moleculaire uitwerking (beenmerg niet nodig) PCR t(9;22) of BCR-ABL bij leukocytose en vermoeden CML OF/ EN OF/ EN Mutatie JAK2V617F bij polycythemie, trombocytose of vermoeden PMF Mutatieanalyse m.b.v NGS 74

Diagnostische uitwerking MPN/MPN-MDS panel NGS- strategie Bevestiging diagnose: 95% PV Mutatie JAK2V617F POSITIEF >1% ~50-60% ET en PMF ~50-60% RARS-T zeldzaam CMML - Thrombocytosis (> 400 x 10 9 /L) / vermoeden ET qpcr NEGATIEF OF POSITIEF maar minimale kloon, < 1% - Vermoeden myelofibrose (cytopenie) - Polyglobulie / vermoeden PV Vermoeden CMML, JMML, acml, MDS/PMN-U, RARS-T NGS MPN panel F NGS AML panel in geval van CMML of PMF 75

Terugbetaling RIZIV MPN Op heden tem 31/10/2016 BCR-ABL bij Dx CML (verstrekking 588512-588523): 1x aanrekenen (dus geen uitwerking op BM en PB) CML FU (588593-588604): 4x aanrekenen Mutatie JAK2V617F (589691-589702 ): 1x aanrekenen Vanaf 1 november 2016 Verstrekking 589691-589702 voor JAK2V617F valt weg! Aanpassing verstrekking 588512-588523 waarbij genafwijkingen door middel van een moleculair biologische methode worden opgespoord in de diagnostische investigatiefase van een chronische myeloproliferatieve neoplasie (niet meer CML). Uitwerking MPN: 2x aanrekenen (B3500) 76

Moleculaire diagnostiek bij lymfomen Wanneer PCR nodig? Belang diagnose en follow-up 77

Non-Hodgkin lymfomen: Oorzaak en ontstaan Oorzaak onduidelijk geen genetische overerving verhoogd risico bij patienten met immuundeficiëntie (bv AIDS) Ontstaan De meeste vormen ontstaan in B-lymfocyten (85%) 65% ontstaat in lymfeklier (nodaal) en 35% extranodaal 78

Diagnostiek Kliniek: anamnese en lichamelijk onderzoek (gezwollen lymfeklier) LABO Cytomorfologisch onderzoek (klierbiopsie, uitstrijkje bloed en beenmerg) Hoe zien de cellen eruit? Normaal of afwijkend? Histologisch onderzoek door anatomopatholoog Hoe zien de cellen en het weefsel eruit? Immunofenotypering m.b.v. flowcytometrie Klonaliteitsonderzoek en algemene typering Moleculaire diagnostiek Klonaliteitsonderzoek en opsporen specifieke translocatie 79

Ig (en TCR) genherschikking VDJ recombinatie is uniek voor elke B-cel VH DH JH s Cµ 1 2 3 4 5 6 66 1 2 3 4 27 1 2 3 4 5 6 D H J H joining V H DH-J H joining V D J IgH IgH V D J V IgL J C C C C C C J V IgL precursor IGH mrna transcription C C C C CD79b CD79a translation V D J Cµ RNA splicing mature IGH mrna junctional region 80

PCR gebaseerde klonaliteit BIOMED-2 protocol Multiplex PCR Verbetering sensitiviteit Gestandaardiseerd protocol: betere inter-lab vergelijking 81

FR1 FR2 FR3 Analyse via capillaire elektroforese (fragmentanalyse / GeneScan) 82

Elaba et al., Int J Dermatol 2012 83

Klonaliteitanalyse m.b.v. PCR Startmateriaal: bloed, beenmerg, biopt (vers of in paraffine) Paraffine coupes: minimum 3 coupes van 50 micron: voldoende weefsel DNA isolatie Klinische info! 84

VOORDELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse Hoge klinische gevoeligheid Moleculaire diagnostiek vaak niet eerste lijn in de diagnostische uitwerking; vaak geen vers materiaal meer beschikbaar Gefixeerd materiaal / paraffinecoupes nog bruikbaar voor PCR applicaties, FISH CAVE belang fixatie protocol, waardoor beschadiging nucleïnezuren (gefragmenteerd); afh. Best gebufferde formol (4%) en minder dan 24h fixatieduur 85

NADELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse Complex Interpretatie vaak moeilijk Veel pitfalls Analyse vereist voldoende kwantitatief en kwalitatief (niet gefragmenteerd) DNA; niet altijd mogelijk op paraffinecoupes CAVE pseudoklonaliteit door preferentiële amplificatie bepaalde herschikkingen (toevallige amplificatie van 1 kloon) Vals negativiteit mogelijk: zeldzame herschikkingen somatische hypermutatie kan primer binding sites beinvloeden (vooral zware keten, lichte keten minder gevoelig) te weinig B/T cellen in gekregen materiaal EXPERTISE VEREIST! 86

Toepassingen klonaliteitsanalyse met PCR DIAGNOSE Histopathologische DD maligniteit vs reactief beeld: op vers en paraffine materiaal B-cel maligniteiten: uitwerking vermoeden klonaliteit met flowcytometrie (niet altijd duidelijk) T-NHL: uitwerking aberrant fenotype gevonden met flowcytometrie STAGING (gevoeligheid 1-10 %) Klonale verwantschap: klonaal verband aantonen tussen verschillende lymfoproliferatieve letsels bij diagnose of evolutie klonale verwantschap in follow-up stalen 87

Vermoeden lymfoproliferatieve aandoening Bloedstaal voor: Klinische biologie UZ Gent Flowcytometrie: B-cel: bepaling mkappa / mlambda expressie T-cel: aantonen aberrante populatie (weinig specifiek) PCR TCR genherschikking PCR OF/EN Ig genherschikking PCR 88

BCL1-IgH of t(11;14) Genetic hallmark voor mantelcellymfomen (vrijwel alle) IgH-BCL1 herschikking BCL1 (=CCND1): cycline D1 (oncogen) onder controle van enhancer regio van IgH geen abnormaal fusieproteïne gevormd, enkel verhoogde expressie van cycline D1 Variabiliteit in breukpunten (FISH is golden standard ) van Dongen et al.,leukemia, 2003 89

BCL1-IgH of t(11;14) Variabiliteit in breukpunten (FISH is golden standard ) PCR gebaseerde methode mbv 5 MTC regio: 40% van de breekpunten kunnen worden gedetecteerd van Dongen et al.,leukemia, 2003 Indien PCR positief, wel nuttig voor MRD analyse Gevoelige assay: 0,01% 90

BCL2-IgH of t(14;18) Folliculair lymfoom of grootcellig B-cel lymfoom BCL2 (anti-apoptotisch): onder controle van enhancer regio van IgH geen fusieproteine, enkel verhoogde expressie van BCL2 geen supergevoelige PCR gebruiken (translocatie ook te vinden in gezonde individuen) FISH = gouden standaard (detectie alle breekpunten) PCR gebaseerde methode; 3 sets van primers 60% van de breekpunten kunnen worden gedetecteerd MRD analyse 91

BCL2-IgH of t(14;18) 4 belangrijk regio s met frequente breukpunten 3 multiplex PCRs bij nieuwe Dx Gevoeligheid follow-up: 0.01-0.001% van Dongen et al.,leukemia, 2003 92

Vermoeden MCL of FL Staal voor: Klinische biologie CMGG PCR Flowcytometrie Karyotypering FISH FISH op celsuspensie Geen karyotypering meer! 93

CLL-epidemiology Incidentie: 3 (2-4,5) /100 000/jaar / western countries (>70 years: 50/100 000/jaar) / 20-25% van alle leukemieën Mediane leeftijd: 65 70 jaar Maligniteit van rijpe 5 (memory) B-cellen Monoklonale proliferatie van afunctionele lymfocyten met een apoptosedefect. 20-25% of all leukemic diseases 94

CLL = heterogene aandoening 95

CLL prognostische factoren Clinical staging Rai, Binet Lymphocyte doubling time (LDT) Pattern of marrow involvement (nodal, mixed, diffuse) Pattern of lymph node infiltration? Serum markers: LDH, beta2-microglobulin, thymidine kinase, scd23, scd54, scd20 Phenotype CD38, ZAP-70, CD49d IGVH gene mutation status Genetic aberrations 96

Genetische afwijkingen bij CLL Chromosomale afwijkingen bij 80% van de CLL patiënten Meest frequente deleties en gains Trisomie 12 Deletie 13q14 Deletie 11q22 Deletie 17p13 Verstoring p53 pathway 97

CLL / SLL Cytogenetic alterations in up to 80% (CHG array) Trisomy 12, 13q del, 11q del, 17p del Mutations of potential clinical relevance (TP53, NOTCH1, SF3B1, ATM and BIRC3) have been recognized No recognized disease-defining mutations 98

Genetische afwijkingen: detectiemethoden Klassieke cytogenetica: karyotypering FISH: slechts 50% van de chromosoomafwijkingen te detecteren Array CGH (comparative genomic hybridisation) 99

Genetische afwijkingen bij Multiple Myeloom Chromosomale afwijkingen bij 90% van de MM patiënten Translocaties: IgH gen op chromosoom 14q32 (50-70%) -> t(4;14) / t(11;14) / t(14;16) Meest frequente deleties en gains 1q afwijking (winst) Deletie 13q14 (50%) Deletie 17p13 TP53 mutaties 100

CLL en MM Staal voor: CMGG PCR Klinische biologie Flowcytometrie Karyotypering FISH NGS 101

Recent geïdentificeerde genetische afwijkingen in lymfoproliferatieve aandoeningen BRAF V600E mutatie WHO 2008: 'no cytogenetic abnormality is specific for hairy cell leukemia BRAF V600E mutaties komen voor in hairy cell leukemie (HCL), maar niet in de morfologisch moeilijk te onderscheiden variant, HCL-v Belangrijke diagnostische waarde MYD88 L265P mutatie Terug gevonden bij > 90% van de M. Waldenström of LPL Belang sensitieve techniek Invloed NF-kB pathway -> Velcade (bortezomib) werkt in op NF-kB pathway 102

Terugbetaling Geregeld via art.33bis, in voege sinds 1/8/2007 (en binnenkort art.33ter voor companion diagnostics) ISO15189 accreditatie verplicht! Rechtstreekse facturatie aan RIZIV Beperkt per diagnose, in tijd en per weefsel AML Dx: 8 testen terugbetaald (herval na min 1 jaar) AML FU: 4x / jaar (sinds start Dx) ALL: 5 testen terugbetaald ALL FU: 4x / jaar (sinds start Dx) MPN Dx: 2 testen terugbetaald CML FU: 4x / jaar (probleem met STOP therapie studies die maandelijks moeten opgevolgd worden in 1 e zes maanden) Klonaliteit: 2x / diagnostische investigatie en per onderzocht weefsel (herval na min. 1 jaar) 103

Bedankt voor jullie aandacht! Klinische Biologie Barbara Denys Karl Vandepoele MDG (NGS) Barbara Denys Karl Vandepoele Elien De Latter Joni Van der Meulen Centrum Medische Genetica Nadine Van Roy 104