Gearchiveerde versie

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Analysemethode Techniek Matrix / matrixgroep VALIDATIERAPPORT Voeding - Kwantitatieve bepaling van methylkwik met AMA (FLVVG-I-MET-81MeHg) AMA Datum laatste aanpassing 12-12-2014 Vis en aquacultuurproducten LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 1/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Overzicht van de prestatiekenmerken : Zie validatierapport voor de prestatiekenmerken bekomen door FLVVG. De laboratoria die deze methode willen overnemen, kunnen de criteria uit Verordening 333/2007 nemen voor de evaluatie van de prestatiekenmerken, hoewel deze niet bindend zijn. De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: Er zijn nog geen performantiecriteria opgesteld in de wetgeving voor Hg speciatie methoden. Als richtlijn kunnen daarom de criteria uit Verordening 333/2007 tot vaststelling van bemonsteringswijzen en analysemethoden voor de officiële controle op de gehalten aan lood, cadmium, kwik, anorganisch tin, 3-MCPD en benzo(a)pyreen in levensmiddelen worden genomen. De EN methode voor Methylkwik is met isotoopdilutie GC-ICPMS ( "Determination of methylmercury by isotope dilution GC-ICPMS in foodstuffs of marine origin"). De methode die FLVVG toepast, is de IRMM methode die werd voorgesteld in CEN TC 275 als alternatief voor de GC-ICPMS methode. De IRMM methode werd gevalideerd in ringtest IMEP-115. Het rapport van de ringtest kan gebruikt worden als criteria om de performantie van de AMA methode te toetsen. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 2/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Daarnaast worden de richtlijnen van de FAVV procedure voor validatie gehanteerd. - Inhoud: Validatierapport van 12-12-2014 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 3/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Analysemethode Techniek Matrix / matrixgroep Type validatie Verantwoordelijke (Naam en functie) Opgesteld door Medewerkers VALIDATIERAPPORT Voeding - Kwantitatieve bepaling van methylkwik met AMA (FLVVG-I-MET-81MeHg) AMA Vis en aquacultuurproducten Totaalvalidatie ir. Inge Van Hauteghem, sectieverantwoordelijke AC ir. Inge Van Hauteghem Functie: sectieverantwoordelijke AC Datum: 12-12-2014 (v.01) Handtekeningen : Get. Inge Corryn (laborante AC), Marnix De Gruyter (laborant AC) (Naam en functie) Periode van validatie Start: juni 2012 Einde: augustus 2014 (opmerking: ringtestresultaten en andere validatiegegevens worden continu aangevuld in het validatiedossier) Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door ir. Inge Van Hauteghem Functie: sectieverantwoordelijke AC Handtekeningen : Datum: 12-12-2014 Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Get. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 4/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie INHOUDSTABEL SAMENVATTING VALIDATIEGEGEVENS... 6 1. AANTOONBAARHEIDSGRENS EN BEPAALBAARHEIDSGRENS... 7 2. PRECISIE... 7 3. LINEARITEIT... 8 4. JUISTHEID / EXTRACTIERENDEMENT... 8 5. ROBUUSTHEID... 8 6. SPECIFICITEIT EN SELECTIVITEIT... 10 7. TRENDANALYSE... 10 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 5/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Samenvatting validatiegegevens Validatieparameter Aanvaardingscriteria Evaluatie / samenvatting Aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens Precisie Horrat < 2 Lineariteit Juistheid / extractierendement Robuustheid Specificiteit en selectiviteit Minstens LOQ bekomen 1/10 van de laagste norm voor totaal Hg (0,50 mg/kg) of < 0,050 mg/kg Opmerking: vergelijking met IMEP-115 Best passende ijklijn; r² > 0,99 Eisen ringtest / juistheid tussen 70 en 120 % Stabiliteit extractie fase doorlooptijd analyse Vrij van interferenties Samenvatting meetonzekerheid Model: MU_cal_v.03.1 (2014/871/LAB) specie Ringtesten Correcte identificatie van de species Meetonzekerheid U (%) Berekeningswijze inclusief: Validatie Controle Besluit kaarten U % MeHg ja ja ja 43 LOD: 0,010 mg/kg LOQ: 0,020 mg/kg Horrrat r : < 2 beheerst Horrat Rw : < 2 beheerst Vergelijking met IMEP-115: RSD r < RSD r,en en RSD Rw < RSD R,EN voor 0,020 - mg/kg Best fit is kwadratische functie. r² > 0,99 : voldaan Juistheid tussen 70 120 %, beheerst > 20 mg/kg Gunstige z-scores in ringtesten Voldaan Voldaan Organisch kwik wordt bepaald Voor rapportering wordt U = 40 % gebruikt. Gebruikte afkortingen MeHg AMA Methylkwik Advanced Mercury Analyser LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 6/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie 1. Aantoonbaarheidsgrens en bepaalbaarheidsgrens Verwacht werd dat de LOQ van de methode MeHg met AMA niet lager is dan de LOQ van totaal kwik (LOQ 0,010 mg/kg), wegens de extractiestappen die de bepaling met AMA van MeHg voorafgaan. Voor methylkwik zijn geen blanco monsters gevonden. Wel werd een CRM met laag gehalte in reproduceerbaarheidsomstandigheden geanalyseerd. Resultaat van de analyse van Oyster tissue, SRM 1566b met gecertificeerde waarde 0,0132 ± 0,0007 mg/kg en ringtest gemiddelde (IMEP-115) 0,019 mg/kg: RSD Rw = 24,6 % en Horrat (Thompson) = 1,1 < 2 : OK. Gemeten gemiddelde van 9 resultaten 0,026 mg/kg. Gezien de gunstige Horrat, Zie ook overzicht reproduceerbaarheid in bijlage. Besluit : Als LOQ voor MeHg wordt 20 µg/kg vooropgesteld. 2. Precisie Herhaalbaarheid Precisie in herhaalbaarheidsomstandigheden werd getest op 5 gecertificeerde stalen tijdens de IMEP-115 ringtest. Daarnaast werden nog twee extra herhaalbaarheidsproeven opgezet in 2014 op verse vis: een FAPAS ringtest staal Canned fish en een routinestaal paling. De paling is een zeer vette vis en werd daarom als aanvulling gezien voor de controle van de performantie van de methode. De Horrat r voldeden alle aan het vooropgesteld criterium : Horrat r < 2. Bij vergelijking van de RSD r waarden met de RSD r waarden gevonden in de CEN ringtest werd over het algemeen gevonden dat de RSD r < RSD r,en wat ook een indicatie is dat de methode op vlak van herhaalbaarheid beheerst is. Intralaboratoriumreproduceerbaarheid Ter bepaling van de intralaboratoriumreproduceerbaarheid worden controlekaarten bijgehouden van 3 gecertificeerde stalen van IMEP-115 aangevuld met een BCR 463 Tuna Fish. De Horrat Rw voldoen alle aan het vooropgesteld criterium : Horrat Rw < 2. Bij vergelijking met de RSD R,EN blijkt dat de interne RSD Rw < RSD R,EN voor BCR 463 Tuna fish (2,85 mg/kg), DOLT-4 Dogfish liver (1,33 mg/kg) en SRM 1566b Oyster tissue (0,0132 mg/kg certificaat, 0,019 mg/kg IMEP-115). Voor TORT-2 Lobster hepatopancreas (0,152 mg/kg) is de interne RSD Rw net iets groter dan de RSD R,EN. Verwacht wordt dat na bijkomende metingen de interne RSD Rw nog zal dalen. Besluit: de methode is beheerst op vlak van precisie. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 7/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie 3. Lineariteit Voor de techniek AMA wordt gewerkt met een ijklijn die eenmalig in de software wordt bewaard om dan voor alle kwikbepalingen te gebruiken. De ijklijn (bestaande uit een 1st range en een 2nd range) wordt dus niet hernomen per analysereeks. Het criterium '10 % afwijking t.o.v. de ijklijn' dat wordt toegepast op testen waarbij de ijklijn voldoet aan een lineair model, kan hier niet gehanteerd worden. Dit is reeds getest in de validatie van totaal kwik waaruit bleek dat een proefopzet met herhaalde injecties van concentraties gebruikt voor constructie van de ijklijn, geen kwadratisch verband hebben en de ijklijn zelf wel. Als 20 % afwijking als criterium wordt genomen, zijn de herhalingen wel OK. De proefopzet voor lineaire modellen kan dus niet gebruikt worden als controle. Wat wel wordt gedaan is de jaarlijkse controle van de ijklijn rechtstreeks. Onrechtstreeks worden bij elke meetreeks controlemonsters meegenomen en zijn er diverse ringtestresultaten die informatie geven over de performantie van het toestel, en daarbij ook de gebruikte ijklijn. Besluit: De kwadratische ijklijn voldoet en geeft consistente resultaten. 4. Juistheid Juistheid uit ringtesten Alle resultaten voor de ringtest IMEP-115 waren gunstig qua z-score. In deze ringtest werd gevraagd de IRMM-methode te gebruiken, het betrof dus eerder een validatie ronde. Een eerste ringtest resultaat van FAPAS was eveneens gunstig qua z-score. In deze FAPAS waren de deelnemers vrij qua keuze methode. De juistheid van de stalen met gehalte boven 20 mg/kg varieert van 75 tot 121%. De Oyster tissue met gehalte 13 mg/kg ligt onder de LOQ, wat ook te zien is aan de bias. Juistheid uit CRM en referentiemateriaal Uit de verzamelde gegevens voor toetsing van de juistheid uit CRM, dit is herhaalbaarheidsgegevens van CRM en de gemiddelden gevonden in controlekaarten voor CRM, wordt gevonden dat de juistheid voor gehalten hoger dan 20 mg/kg varieert van 70 tot 119%, wat gunstig. Besluit: de methode is beheerst op vlak van juistheid binnen het interval 70-120%. 5. Robuustheid Matrix Voor alle routinestalen die in FLVVG worden gemeten voor methylkwik, wordt standaard een totaal kwik analyse uitgevoerd. De analyse van totaal kwik met zijn kleine meetonzekerheid, geeft een indicatie van de LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 8/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie maximale concentratie aan methylkwik die kan gevonden worden (namelijk totaal kwik + 25% relatieve meetonzekerheid). De verhouding MeHg/totaal kwik voor de routine stalen van 2014 is opgelijst in bijlage. Van de 46 resultaten, zijn 44 resultaten in de range 70-105% voor MeHg/totaal kwik. Gemiddelde verhouding MeHg/totaal Hg is 85,8%. Bij deze routinestalen zit zowel erg vette paling als tonijn en zwaardvis. Binnen eenzelfde matrix zijn er variaties aan verhouding wat aangeeft dat het vetgehalte geen invloed heeft op het resultaat voor MeHg. De methode is robuust naar type vis. Noot: Afhankelijk van de soort is het aandeel methylkwik 70 tot 100 % van het totaal kwikgehalte in vis. Bewaring van de monsteroplossingen Om methylkwik op AMA te bepalen, moet de AMA worden omgebouwd voor grote schuitjes. Dit wil zeggen dat de AMA niet continu beschikbaar is voor de bepaling van methylkwik als kwik in de extracten. Het is dus van belang dat de extracten een tijdje kunnen bewaard worden. De bewaartijd werd getest aan de hand van de eerstelijn controlemonsters BCR 463 Tuna fish, een verse tonijn en TORT-2 Lobster hepatopancreas. Initieel resultaat Na 2 weken Na 3 weken MeHg MeHg Verschil MeHg Verschil (mg/kg) (mg/kg) % (mg/kg) % Verse tonijn 0,45 0,45 0,0 0,45 0,0 Verse tonijn 0,47 / / 0,443-5,7 Verse tonijn 0,5 0,474 5,2 / / Gemiddelde 0,47 0,46 2,6 0,45-2,9 Initieel resultaat Na 2 weken Na 3 weken MeHg MeHg Verschil MeHg Verschil (mg/kg) (mg/kg) % (mg/kg) % BCR 463 2,527 2,5166 0,4 2,5658 1,5 BCR 463 2,467 / / 2,4017-2,6 BCR 463 2,528 2,455 2,9 / / Gemiddelde 2,51 2,49 1,6 2,48-0,6 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 9/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Initieel resultaat Na 2 weken Na 3 weken MeHg MeHg Verschil MeHg Verschil (mg/kg) (mg/kg) % (mg/kg) % TORT-2 0,146 0,1444 1,1 / / TORT-2 0,156 / / 0,1482-5,0 TORT-2 0,149 0,1471 1,3 / / Gemiddelde 0,15 0,15 1,2 0,15-5,0 Besluit: De extracten van monsters kunnen minstens 3 weken bewaard worden zonder dat het gehalte aan methylkwik significant wijzigt. Bewaring van de monsters Controlekaarten voor CRM s en metingen van ringtest stalen met gekend gehalte tonen aan dat het gehalte aan methylkwik stabiel blijft in de monsters gedurende meerdere jaren. 6. Specificiteit en selectiviteit De IRMM methode vermeldt dat de methode geschikt is voor bepaling van methylkwik, namelijk monomethylmercuric cation. In principe is de methode niet selectief en zullen andere organische kwikspecies eveneens worden mee geëxtraheerd als deze zouden aanwezig zijn in de stalen, maar het resultaat worden beschouwd als MeHg gezien MeHg in nagenoeg alle voeding stalen de enige aanwezig vorm van organisch kwik is. 7. Trendanalyse Voor een trendanalyse: de ringtestresultaten zijn gunstig. Zowel negatieve als positieve z-scores werden genoteerd. Verder worden alle ringtestresultaten opgenomen in de module PT. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 10/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Bijlage: foto s procedure Afwegen in NUNC buis Eerste extractie Toevoegen waterstofbroomzuur en schudden; toevoegen tolueen LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 11/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Schudden en Vortexen Centrifugeren Resultaat eerste extractie LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 12/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Overbrengen 15 ml bovenste fase naar tweede NUNC buis met cysteïne oplossing Tweede maal toevoegen tolueen, schudden, vortexen, centrifugeren Resultaat tweede extractie Volledige bovenste fase overbrengen naar tweede NUNC buis met cysteïne oplossing Vortexen en centrifugeren van de tweede NUNC buis LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 13/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Onderste cysteïnelaag overbrengen met pasteurpipet naar vial Kwikgehalte meten met AMA met de grote nikkel schuitjes LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 14/15

FAVV BESTUUR LABORATORIA LABO: FLVVG SECTIE : Anorganische chemie Bijlagen: - overzicht herhaalbaarheid - reële duplo resultaten en criterium duplo s - overzicht reproduceerbaarheid - ruwe data lineariteit - routine stalen MeHg versus totaal Hg - overzicht ringtesten - juistheid CRM LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 2012-03 Validatierapport_MeHg_v01_2014.doc pagina 15/15

Parameter: Herhaalbaarheid Proef: Kwantitatieve bepaling van methylkwik met AMA I-MET: FLVVG-81MeHg Staalnr. Matrix Dogfish liver DOLT-4 1,33 ± 0,12 mg/kg Lobster hepatopancreas TORT-2 0,152 ± 0,013 mg/kg Freeze-dried mussel tissue SRM 2974a 0,069 ± 0,0008 mg/kg Oyster tissue SRM 1566b 0,0132 ± 0,0007 mg/kg (ringtest: 0,019 mg/kg) Tuna fish ERM CE464 5,12 ± 0,34 mg/kg Canned fish FAPAS T07209 135 ± 29,2 µg/kg Paling 14101802 onbekend Gehalte MeHg n RSD r (%) RSD r, max (%) Horrat r Bron RSD r, EN 1,098 mg/kg 3 2,8 10,4 0,3 < 2 : OK 0,152 mg/kg 3 1,9 14,0 0,1 < 2 : OK 0,082 mg/kg 2 0,8 15,4 0,1 < 2 : OK 0,022 mg/kg 3 1,4 18,7 0,1 < 2 : OK 4,608 3 0,9 8,4 0,1 < 2 : OK 94,3 µg/kg 6 8,9 5,3 0,6 < 2 : OK 0,0697 mg/kg 4 3,7 15,8 0,2 < 2 : OK IRMM method, collaborative trial: Sample 1 DOLT-4: gemiddelde 1,33 mg/kg; n = 3 IRMM method, collaborative trial: Sample 2 TORT-2: gemiddelde 0,152 mg/kg; n = 3 IRMM method, collaborative trial: Sample 3 SRM 2974a: gemiddelde 0,069 mg/kg; n = 3 IRMM method, collaborative trial: Sample 4 SRM 1566b: gemiddelde 0,0132 mg/kg; n = 3 IRMM method, collaborative trial: Sample 5 ERM CE464: gemiddelde 5,12 mg/kg; n = 3 IRMM method, collaborative trial: Sample 2 TORT-2: gemiddelde 0,152 mg/kg; n = 3 IRMM method, collaborative trial: Sample 3 SRM 2974a: gemiddelde 0,069 mg/kg; n = 3 RSD r,en (%) Vergelijking met EN Datum 5,2 RSD r < RSD r,en 16/08/2012 6,1 RSD r < RSD r,en 16/08/2012 5,1 RSD r < RSD r,en 16/08/2012 12,3 RSD r < RSD r,en 16/08/2012 3,9 RSD r < RSD r,en 27/08/2012 6,1 RSD r > RSD r,en 27/03/2014 5,1 RSD r < RSD r,en 28/03/2014 MeHg-AMA_herh_overzicht.doc

MeHg-AMA_herh_overzicht.doc

Parameter: Reproduceerbaarheid Proef: Kwantitatieve bepaling van methylkwik met AMA I-MET: FLVVG-81MeHg Staalnr. Matrix Tuna fish BCR 463 2,85 ± 0,16 mg/kg Lobster hepatopancreas TORT-2 0,152 ± 0,013 mg/kg Dogfish liver DOLT-4 1,33 ± 0,12 mg/kg (IMEP x 1,13 mg/kg) Oyster tissue SRM 1566b 0,0132 ± 0,0007 mg/kg (ringtest: 0,019 mg/kg) * kaart wordt nog vervolledigdgearchiveerde Gehalte MeHg n RSD Rw (%) RSD Rw, max (%) Horrat Rw 2,572 mg/kg 14* 4,6 13,9 0,3 < 2 : OK 0,159 mg/kg 19* 11,1 21,1 0,5 < 2 : OK 1,162 mg/kg 5* 8,9 15,6 0,6 < 2 : OK 0,0260 mg/kg LOQ 9* 24,6 T : 22 1,1 < 2 : OK Bron RSD R, EN IRMM method, collaborative trial: Sample 5 Tuna Fish ERM CE464: gemiddelde 5,12 mg/kg; n = 10 IRMM method, collaborative trial: Sample 2 TORT-2: gemiddelde 0,152 mg/kg; n = 11 IRMM method, collaborative trial: Sample 1 DOLT-4: gemiddelde 1,33 mg/kg; n = 3 IRMM method, collaborative trial: Sample 4 SRM 1566b: gemiddelde 0,0132 mg/kg; n = 3 versie RSD R,EN (%) Evaluatie 8,4 RSD Rw < RSD R,EN 10,0 RSD Rw > RSD R,EN 18,2 RSD Rw < RSD R,EN 24,8 RSD Rw < RSD R,EN Datum Kaart nr. 28/11/2014 Nr. 266 28/11/2014 Nr. 267 17/10/2014 Nr. 265 3/11/2014 Nr. 262 MeHg-AMA_repro_overzicht.doc

MeHg wordt als Hg gemeten Hg 16/01/2013 uitvoerder: Inge Corryn ijklijn : 14/09/2012 ng AU ijklijn herh 1 herh 2 herh 3 herh 4 herh 5 a b Blank 0 0,0006 0,0003 0,0007 0,0006 0,0001 0,0005 0,00060 0,00060 0,3 ng 0,3 0,0084 0,0100 0,0087 0,0080 0,0076 0,0084 0,00820 0,00860 1 ng 1 0,0278 0,0237 0,0238 0,0239 0,0223 0,0225 0,02770 0,02780 3 ng 3 0,0859 0,0703 0,0709 0,0708 0,0718 0,0720 0,08740 0,08440 10 ng 10 0,2762 0,2402 0,2476 0,2452 0,2443 0,2453 0,27430 0,27810 30 ng 30 0,7545 0,7426 0,7166 0,7412 0,7249 0,7280 0,75340 0,75550 Ijklijn gemaakt 14/9/2012 vanuit stockoplossing Hg; spikes gemaakt 16/1/2013 vanuit stockoplossing Hg (vers gemaakt) volgens zelfde schema. Voor aanmaak van de oplossingen: uit 30 ng is 0,3 ng en 3 ng gemaakt ; uit 10 ng is 0,1 ng gemaakt. Hg 2013 Absportie standaarden 0,8000 0,7000 0,6000 0,5000 0,4000 0,3000 0,2000 0,1000 y = 0,0242x - 0,0001 R² = 1 Lineariteit Hg 2013 y = -0,0001x 2 + 0,0289x - 8E-05 R² = 1 y = 0,0251x + 0,0066 R² = 0,9989 0,0000 0 5 10 15 20 25 30 ng standaarden gemiddelde standaard- standaardafwijking evaluatie bias tov ijklijn evaluatie herhalingen afwijking bias AU AU % stdafw abs (AU) rel (%) tov 20% Blank 0,0004 0,0002 54,7 NOK -0,0002-26,7 NOK 0,3 ng 0,0085 0,0009 10,7 NOK 0,0001 1,7 OK 1 ng 0,0232 0,0008 3,3 OK -0,0045-16,3 OK 3 ng 0,0712 0,0007 1,0 OK -0,0147-17,2 OK 10 ng 0,2445 0,0027 1,1 OK -0,0317-11,5 OK 30 ng 0,7307 0,0111 1,5 OK -0,0238-3,2 OK Vaststellingen: Ijklijn van september 2012 komt overeen met de ijklijn van april 2009! Voor de ijklijn wordt in de AMA gewerkt met een niet-lineaire functie. Ook in deze meting blijkt dat voor de lineariteit-ama-hg2009 en 2013.xls

MeHg wordt als Hg gemeten Besluit: Hg 2013 ijklijn een lineair verband een mindere correlatie (R² =0,9989) geeft dan een kwadratisch verband (R² = 1). Voor de herhalingen is het lineair verband de beste fit (R² = 1) en daardoor liggen bij de herhalingen de punten 1 ng, 3 ng en 10 ng onder de ijklijnkromme, terwijl punt 30 ng nagenoeg op de ijklijncurve ligt. De hypothese dat er verlies zou zijn bij doorverdunnen van 30 ng naar 3 en 0,3 ng gaat niet op: 0,3 ng ligt boven de ijklijn. Bovendien, de manier van verdunnen voor de ijklijn is net hetzelfde, en daar stelt zich dat fenomeen niet. De 1stelijns en 3de lijns resultaten zijn gunstig met de huidige ijklijn. Vervangen van de punten 1-3 -10 ng van de huidige ijklijn door een van de herhalingen lijkt geen goede optie, omdat de ijklijn dan lager komt te liggen met als gevolg hogere concentraties in de stalen. Er is geen reden om die verhoging te creëren, gezien de gunstige z-scores. Gemiddelde z-score over alle ringtesten met AMA in 2012 : 0,32! De z-scores in 2012 bekomen na 14/9 zijn eerder positief. Er is geen reden om de ijklijn te wijzigen, de ijklijn geeft goede resultaten. Aanpassen aan de bevindingen in de herhalingen zou ongunstiger resultaten kunnen genereren en is niet gewenst. Het vooropgestelde criterium '10 % afwijking t.o.v. de ijklijn', kan hier niet gehanteerd worden, gezien de herhalingen geen kwadratisch verband hebben en de ijklijn wel. Als 20 % getolereerd wordt, zijn de herhalingen wel OK. Voor Methylkwik: de meting zelf is een kwikmeting t.o.v. de ijklijn van Hg. Er is geen aparte ijklijn voor Methylkwik. De vaststellingen voor Hg kunnen daarom worden gebruikt voor Methylkwik. lineariteit-ama-hg2009 en 2013.xls

Juistheid uit ringtesten Proef Voeding: Kwantitatieve bepaling van methylkwik met AMA Apparatuur/detectie AMA (A AMA 1) Matrix Voeding, vis & aquacultuurproducten I-MET LAB I-MET-FLVVG-081MeHg Datum uitvoering 2012-2014 Medewerkers Bevoegde personen MeHg Ringtest Matrix Resultaat Resultaat Juistheid = std ringtest Bias absoluut ringtest FLVVG z-score Bias (%) 100 - bias (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (%) IMEP-115 DOLT-4 (2012) Dogfish liver 1.330 210 1.100-1,10-230 -17,3 83 IMEP-115 TORT-2 (2012) Lobster hepatopancreas 152 15 157 0,33 5 3,3 103 IMEP-115 SRM 2974a (2012) Freeze-dried mussel tissue 71 8 86 1,88 15 21,1 121 IMEP-115 SRM 1566b (2012) Oyster tissue 13 5 23 1,96 10 74,2 174 IMEP-115 ERM CE 464 (2012) Tuna Fish 5.120 380 4.540-1,53-580 -11,3 89 FAPAS T07209 (2014) Canned fish 135 29 101-1,16-34 -25,2 75 alle waarden z-score bias (%) juistheid (%) Gemiddelde 0,1 7,5 107,5 Stdv 1,6 36,6 36,6 Besluit: Bias tussen 70 en 121% voor gehaltes hoger dan 20 ppb ; Oyster tissue: LOQ! zonder Oyster tissue z-score bias (%) juistheid (%) Gemiddelde -0,3-5,9 94,1 Stdv 1,4 18,3 18,3 Juistheid uit ringtesten MeHg.xls 2012-

< LOQ Juistheid uit ringtesten MeHg.xls 2012-

Juistheid uit CRM (uitgedrukt als bias) Proef Voeding: Kwantitatieve bepaling van methylkwik met AMA (methode IRMM) Apparatuur/ detectie AMA (A AMA 1) Matrix Vis & aquacultuur METnr. LAB I-MET-FLVVG-081MeHg Datum uitvoering 2012-2014 - Medewerkers Bevoegde medewerkers MeHg Datum uitvoering Identificatie staal - matrix C referentie gemiddelde eenheid bias (procentueel) b c = (x-c ref )/C ref.100% Juistheid = 100 - bias 16/08/2012 (herh.) Dogfish liver DOLT-4 1,330 1,098 mg/kg -17 83 16/08/2012 (herh.) Lobster hepatopancreas TORT-2 0,152 0,152 mg/kg 0 100 16/08/2012 (herh.) Freeze-dried mussel tissue SRM 2974a 0,069 0,082 mg/kg 19 119 16/08/2012 (herh.) Oyster tissue SRM 1566b (IMEP x = ) 0,019 0,022 mg/kg 16 116 ~= LOQ 27/08/2012 (herh.) Tuna fish ERM CE 464 5,120 4,608 mg/kg -10 90 27/03/2014 (herh.) Canned fish FAPAS T07209 0,135 0,094 mg/kg -30 70 28/11/2014 (n=14) Contr.krt. BCR 463 Tuna fish 2,850 2,572 mg/kg -10 90 28/11/2014 (n=19) Contr.krt. TORT-2 Lobster hepatopancreas 0,152 0,162 mg/kg 7 107 17/10/2014 (n=5) Contr.krt. DOLT-4 Dogfish liver 1,330 1,162 mg/kg -13 87 3/11/2014 (n=9) Contr.krt. SRM 1566b Oyster tissue (IMEP x 0,019 0,026 mg/kg 37 137 ~= LOQ MeHg 2012-2014- gemiddelde -0,21 99,8 stdev 20,0 20,0 Juistheid uit CRM MeHg AMA.xls

Methylkwik Kwik (Hg) level 5 soort 2 mg/kg mg/kg 14230671 Vissen Paling 0,020 0,019 105 14110925 Vissen Paling 0,048 0,066 72,7 14131131 Vissen Paling 0,050 0,057 87,7 14101805 Vissen Paling 0,053 0,066 80,3 14251692 Vissen Paling 0,054 0,068 79,4 14140197 Vissen aquacultuurvissen Paling 0,057 0,073 78,1 14430674 Vissen Tonijn 0,059 0,073 80,8 14121801 Vissen Paling 0,070 0,094 74,5 14250720 Vissen Paling 0,071 0,090 78,9 14170206 Vissen Paling 0,080 0,084 95,2 14120437 Vis, andere zeedieren,de prod en bijprod 1 0,092 0,15 61,3 14181132 Vissen Paling 0,096 0,11 87,3 14140580 Vissen Paling 0,098 0,10 98 14370694 Vissen Paling 0,10 0,10 100 14270692 Vissen zeevissen Tonijn 0,100 0,12 83,3 14251113 Vissen Paling 0,11 0,14 78,6 14150961 Vissen Zwaardvis 0,11 0,11 100 14260617 Vissen Paling 0,12 0,20 60 14170215 Vissen Paling 0,13 0,15 86,7 14400493 Vissen Tonijn 0,16 0,16 100 14441094 Vissen Tonijn 0,17 0,20 85 14420319 Vissen Tonijn 0,19 0,20 95 14381975 Vissen Tonijn 0,22 0,26 84,6 14470186 Vissen Tonijn 0,23 0,26 88,5 14391816 Vissen Tonijn 0,29 0,34 85,3 14141072 Vissen Paling 0,29 0,31 93,5 14410844 Vissen Tonijn 0,30 0,36 83,3 14230003 Vissen zeevissen Tonijn 0,31 0,42 73,8 MeHg-resultaten_totaal vs MeHg.xlsGearchiveerde versie terugvinding

Methylkwik Kwik (Hg) level 5 soort 2 mg/kg mg/kg 14450565 Vissen Tonijn 0,31 0,36 86,1 14291302 Vissen zeevissen Zwaardvis 0,33 0,38 86,8 14210003 Vissen zeevissen Tonijn 0,40 0,45 88,9 14421538 Vissen zeevissen Tonijn 0,43 0,51 84,3 14230002 Vissen zeevissen Zwaardvis 0,44 0,53 83 14350491 Vissen zeevissen Zwaardvis 0,46 0,47 97,9 14472283 Vissen zeevissen Tonijn 0,49 0,56 87,5 14420363 Vissen Tonijn 0,55 0,61 90,2 14211893 Vissen zeevissen Tonijn 0,59 0,75 78,7 14391809 Vissen Tonijn 0,62 0,70 88,6 14150738 Vissen Zwaardvis 0,65 0,68 95,6 14390385 Vissen vissen rijk aan histidinetonijn 0,69 0,79 87,3 14180417 Vissen Zwaardvis 1,02 1,33 76,7 14151171 Vissen Zwaardvis 1,30 1,39 93,5 14160262 Vissen Zwaardvis 1,42 1,52 93,4 14320964 Vissen zeevissen Zwaardvis 1,48 1,81 81,8 14181147 Vissen Zwaardvis 1,59 1,94 82 14141073 Vissen Zwaardvis 1,97 2,29 86 gemiddelde MeHg 85,8 aantal 46 MeHg-resultaten_totaal vs MeHg.xlsGearchiveerde versie terugvinding

MET-FLVVG-081MeHg Resultaat 1 Resultaat 2 MeHg gem RSD % duplo's 12330133 2,358 2,388 2,373 1,26 12330159 1,059 1,037 1,048 2,10 12330160 0,144 0,15 0,147 4,08 voorstel criterium duplo's 12330163 0,07732 0,0827 0,08001 6,72 MeHg (mg/kg) 12330172 0,0212 0,022 0,0216 3,70 Duplo's: 0,020-0,100 max 0,015 mg/kg 12330174 4,177 4,323 4,25 3,44 0,100 -.. max 15% % 14101805 0,054 0,0526 0,0533 2,63 14110925 0,0472 0,048 0,0476 1,68 14120437 0,0824 0,1024 0,0924 21,65 14121801 0,0668 0,0728 0,0698 8,60 gemiddelde RSD % duplo's: 7,26 alle data 14131131 0,0517 0,0484 0,05005 6,59 14140197 0,0499 0,0643 0,0571 25,22 zonder de > 15% gevallen: 14140580 0,0979 0,0984 0,09815 0,51 gemiddelde RSD % duplo's: 3,96 = conform vereisten IRMM methode RT 14141072 0,3033 0,2703 0,2868 11,51 cfr herhaalbaarheid 14141073 2,0122 1,9256 1,9689 4,40 14150738 0,6708 0,6377 0,65425 5,06 14150961 0,1104 0,1052 0,1078 4,82 14151171 1,3306 1,2653 1,29795 5,03 14160262 1,4551 1,3903 1,4227 4,55 14170206 0,08035 0,08035 0,08035 0,00 14170215 0,1317 0,1317 0,1317 0,00 14180417 1,02385 1,02385 1,02385 0,00 14181132 0,0953 0,0965 0,0959 1,25 14181147 1,6052 1,5845 1,59485 1,30 14210003 0,4039 0,4057 0,4048 0,44 14211893 0,6077 0,5728 0,59025 5,91 14230002 0,4773 0,4053 0,4413 16,32 14230003 0,3132 0,3137 0,31345 0,16 14230671 0,022 0,018 0,02 20,00 14250720 0,0719 0,0708 0,07135 1,54 14251113 0,1107 0,1176 0,11415 6,04 14251692 0,0488 0,0599 0,05435 20,42

MET-FLVVG-081MeHg Resultaat 1 Resultaat 2 MeHg gem RSD % duplo's 14260617 0,1021 0,1464 0,12425 35,65 14270692 0,099 0,1002 0,0996 1,20 14291302 0,3348 0,3233 0,32905 3,49 14320964 1,5476 1,4102 1,4789 9,29 14350491 0,47 0,45 0,46 4,35 14370694 0,0996 0,1042 0,1019 4,51 14381975 0,2063 0,2433 0,2248 16,46 14390385 0,684 0,6926 0,6883 1,25 14391809 0,6174 0,6129 0,61515 0,73 14391816 0,283 0,2912 0,2871 2,86 14400493 0,1594 0,1507 0,15505 5,61 14410844 0,2848 0,3114 0,2981 8,92 14420319 0,2036 0,1769 0,19025 14,03 14420363 0,5695 0,5244 0,54695 8,25 14421538 0,466 0,3969 0,43145 16,02 14430674 0,0536 0,0642 0,0589 18,00 14441094 0,17 0,17 0,17 0,00 14450565 0,32 0,3 0,31 6,45 14470186 0,23 0,23 0,23 0,00 14471473 0,55 0,43 0,49 24,49 14472283 0,47 0,5 0,485 6,19

FAVV DG LABORATORIA Analysemethode Techniek Matrix / matrixgroep Type validatie Verantwoordelijke (Naam en functie) Opgesteld door Goedgekeurd door LABO: FLVVG SECTIE: Anorganische chemie VALIDATIEPLAN Voeding - Kwantitatieve bepaling van methylkwik met AMA (FLVVG-I-MET-81MeHg) AMA Vis en aquacultuurproducten Volledige validatie ir. Inge Van Hauteghem, sectieverantwoordelijke AC ir. Inge Van Hauteghem Functie: sectieverantwoordelijke AC Datum: 1-4-2014 ir. Inge Van Hauteghem Functie: sectieverantwoordelijke AC Datum: 1-4-2014 Handtekeningen: Get. Handtekening: Hierna volgt de beschrijving van de diverse stappen zoals aangegeven in de procedure P180 punten 6.1 tot en met 6.5: Get. Template validatieplan v2011-06-28 valplan_mehg_v.01_2014.doc _p.1

INHOUDSTABEL VALIDATIEPLAN... 1 1. STAP 1: TOEPASSINGSGEBIED (MATRICES EN WERKGEBIED)... 3 2. STAP 2: TYPE METHODE... 3 3. STAP 3: VALIDATIEPARAMETERS... 3 4. STAP 4: EXTERNE EISEN + INTERNE EISEN... 3 5. STAP 5: MONSTERS... 5 6. BIJLAGEN... 5 Template validatieplan v2011-06-28 valplan_mehg_v.01_2014.doc _p.2

1. Stap 1: Toepassingsgebied (matrices en werkgebied) Matrixgroep: Vis en aquacultuurproducten Element/specie: methylkwik Werkgebied: ondergrens = bepaalbaarheidsgrens ; bovengrens: geen limiet 2. Stap 2: Type methode Kwantitatieve methode, IRMM methode die werd voorgesteld in CEN TC 275 als alternatief voor Methylkwik met isotoopdilutie GC-ICPMS (WD "Determination of methylmercury by isotope dilution GC-ICPMS in foodstuffs of marine origin"). De IRMM methode is gevalideerd in de ringtest IMEP-115. 3. Stap 3: Validatieparameters Volledige validatie: - Bepaalbaarheidsgrens en aantoonbaarheidsgrens - Herhaalbaarheid - Interlaboratorium reproduceerbaarheid - Juistheid / terugvinding - Lineariteit - Robuustheid - Specificiteit en selectiviteit Opmerking: - aanvaardingscriteria: zie 4 - meetonzekerheid volgens laatst geldige FAVV template 4. Stap 4: Externe eisen + interne eisen Er zijn nog geen performantiecriteria opgesteld in de wetgeving methylkwik. Als richtlijn worden daarom de criteria uit Verordening 333/2007 tot vaststelling van bemonsteringswijzen en analysemethoden voor de officiële controle op de gehalten aan lood, cadmium, kwik, anorganisch tin, 3-MCPD en benzo(a)pyreen in levensmiddelen genomen. Daarnaast worden de richtlijnen van de FAVV procedure voor validatie gehanteerd. Template validatieplan v2011-06-28 valplan_mehg_v.01_2014.doc _p.3

- Bepaalbaarheidsgrens en aantoonbaarheidsgrens: er is nog geen norm vastgesteld voor methylkwik in vis en aquacultuurproducten. Er zijn nog geen eisen voor de LOQ. De LOQ voor de methylkwik bepaling moet voldoende laag zijn om resultaten te kunnen interpreteren. Methylkwikgehalte is gelijk aan of lager dan totaal kwik gehalte. In de IRMM methode wordt een LOQ van 0,010 mg/kg vooropgesteld. Template validatieplan v2011-06-28 valplan_mehg_v.01_2014.doc _p.4

- Herhaalbaarheid: Horrat r < 2 - Interlaboratorium reproduceerbaarheid: Horrat Rw < 2 - Juistheid / terugvinding: ringtestcriteria (z-score), juistheid tussen 70 120 % (IRMM methode: 85-115 %) - Lineariteit: r² > 0,99 ; residu s < 10 % (IRMM methode 15 %): indien de ijklijn voor totaal kwik gebruikt wordt, kunnen deze gegevens gerecupereerd worden voor de bepaling van Methylkwik als kwik. - Robuustheid: bewaartermijn extract, stabiliteit methylkwik in de (routine-)stalen - Specificiteit en selectiviteit: vrij van interferenties, correcte identificatie 5. Stap 5: Monsters 6. Bijlagen Voor zover beschikbaar: monsters (CRM, ringteststalen) met gekende concentraties aan Methylkwik. De kennis kan gehaald worden uit het certificaat, uit literatuur, uit ringtestrapporten, Lineariteit: gegevens totaal kwik. - Stappenplan objectief 2014 Methylkwik Template validatieplan v2011-06-28 valplan_mehg_v.01_2014.doc _p.5

Acties etappes output verantwoordelijke termijn validatie methode I-MET validatieplan voor deze test in Word versie voorzien stabiliteit cysteïne laag (extractie fase 2, NUNC buis B) nagaan (1 week) validatieplan Inge Van Hauteghem 2014-04-15 stabiliteit info Inge Corryn 2014-04-15 ijklijn aanpassen nodig? lineariteit Inge Corryn 2014-04-15 LOD-LOQ bepalen - 9 procedureblanco's LOD- LOQ Inge Corryn, Marnix De Gruyter herhaalbaarheid r Inge Corryn, Marnix De Gruyter intralaboratorium reproduceerbaarheid specificiteit/selectiviteit juistheid uit CRM / terugvinding uit spikes Rw specificiteit, selectiviteit Inge Corryn, Marnix De Gruyter Inge Van Hauteghem bias / terugvinding Inge Corryn, Marnix De Gruyter 2014-06-15 2014-06-15 2014-06-15 2015-06-15 2014-06-15 ringtestresultaten oplijsten bias Annemie Boone continu meetonzekerheid U Inge Van 2014-09-01 Hauteghem validatierapport validatierapport Inge Van Hauteghem Methode voorzien Flow, voorblad Inge Van (limsnummer) IRMM methode Hauteghem, Vanessa Schotte 2014-09-01 2014-04-15 Template validatieplan v2011-06-28 valplan_mehg_v.01_2014.doc _p.6